Pharmacologic evidence for involvement of phospholipase C in pemphigus IgG-induced inositol 1, 4, 5-trisphosphate generation, intracellular calcium increase, and plasminogen activator secretion in DJM-1 cells, a squamous cell carcinoma line

Title

Pharmacologic evidence for involvement of phospholipase C in

pemphigus IgG-induced inositol 1, 4, 5-trisphosphate generation,

intracellular calcium increase, and plasminogen activator

secretion in DJM-1 cells, a squamous cell carcinoma line( 内容の

要旨(Summary) )

Author(s)

江崎, 智香子

Report No.(Doctoral

Degree)

博士（医学）乙 第1256号

Issue Date

2000-10-18

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/15016

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氏名 (本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与月何 字位授与の要件 学位論_文題目 審 査 委 員 江 崎 智香子(岐阜県) 博 士(医学) 乙第 1256 号 平成.12一年10 月18 日 学位規則第4肇第2項該当

PharmacoIoglC _eVidence foriTIVOIverT?ent Of phospholipase Cin Pe,mPhiguslgG-induc9dino$ito11,4.5-trisphosphate.9eneration.

intr?9eJIularcaIciumi,nC,reaSe,and pIasminog?n aCtivaIor secretion in DJM-1celrs･a _{SquamOuSCerIcarciりOmaline} (主査)教授 北 島 康 雄 (副査)教授 片1桐 義'博 _教痩 中 島 茂 論■ 文 内 容 の 要 旨 尋常性天癌瘡では,表皮細胞間接着構造であるデスモソームlのデスモグレイシⅡ(細胞膜貫通糖蛋白)に対す る自己抗体が,≠女モウ -ムセ結合する七とにより,特融解を生じるとされている｡このときプラスミノーゲン アクチベーター(PA)の様な蛋白分解酵素の表皮細胞からの分泌が関与すると推定されているが,詳細なメカ テズムは不明である｡我々はごれまでに･培養表皮細胞を如､･尋常性夫痘瘡血清IgG添加によって⊥過性の細 胞内カルシウム(Ca2サの動員とイノシトール1,4ふ三リン酸(IP3)'の生成が誘導されもの対し,廟天痘瘡およ び健常人IgGではとのような変化がみられず,天痘瘡水痘形成のメカニズムに-ぉけるCa打依存性シナナル伝達機 構の関与を報告してきた｡ :そこで申請者は,太研尭において,天痕瘡水癌形成のiカニズムにおけるホスホリパーゼC(PLC)iのはたす 役割について,PLC阻害剤;U73122,およびその本宿性アナロケ;U73343を用い,ヒト皮膚有頼細胞癌由来株 DJM-1細胞での,天板瘡IgG添加時ゐ細胞内Ca2+rの変動とIP3ゐ生成,PA分泌,細胞接着離解に対する影響をみ ることによって検討した｡ 研究方法 1.8mM Ca2+で培養したヒト皮膚有辣細胞癌由来株DJM-1細胞に,血清からハイトラッププロテインAアフイ ニチイーカラムを用いて精製した尋常性天痘瘡,類天庖瘡および健常人のIgGを添加し,細胞内Ca汁の変動とIP｡ の生成,PA分泌,細胞接着離解を以下の方法で測定,観察し,PLC阻害剤;ロ7312岳,およびその不活性アナロ グ;U73343の影響を比較検討した｡ 1)免疫蛍光染色:U73122,U73343による,天癌瘡IgGの細胞表面への結合性に対する影響を,一次抗体として 天痘瘡IgGを用いた免疫蛍光染色間接法で確認した｡10%天癌癒血清を添加し24時間培養した細胞で,ケラチン 18,6を認識する抗ケラチン抗体;LP34を1次抗体とした免疫蛍光染色を行い,細胞接着の変化を観察した｡ 2)`細胞内カルシナム濃度の測定:bJM-1細胞に,蛍光性カルシウム指示薬fⅦra-2/AM(5〟M)を室温下2時 間作用させ取り込ませた後,天痘瘡IgG(1mg/ml)を添加し二蛍光顕飯鏡画像解析装置ARGUS-100/CAを用 いて,細胞内Ca2+濃度の変動を単一細胞で測定した｡ 3)イノシトール1,4,5一三リン酸の測定:培養したDJM-1細胞に天板瘡IgG盲添加し, 一定時間後に10%過塩素酸 により反応を停止した｡IP｡の定量はIP8特異的結合蛋白質によるIP｡アッセイキットを用いて行った｡ 4)プラスミノーゲンアクチベーター活性の測定:DJM-1細胞に,天癌瘡,頬天癌癒,健常人IgGを添加し,一 定時間後に培養液を回収し-80℃で保存した｡一定量のプラスミノーゲンと培養液を混合し,生じたプラスミン が発色性合成基質(S-2251)から遊離させるp-ニトロアニリン量を測定する,2段階アミド分解アッセイによっ

-75-て培養液中に分泌されたPAの活性を測定した｡ 結果および考察 1)PLC阻害剤;U73122(10FLM),不活性アナログ;U73343(10fLM)で30分間処理しても,ともに抗体の細 胞表面への結合性には影響がないことを,一次抗体として天板瘡IgGを用いた免疫蛍光染色間療法で確認した｡ 2)DJM-1細胞において,天板瘡IgGを添加すると.20秒後をピークとする急速ヤー過性の細胞内Ca2+濃度の上 昇がみられ.阜ゐ後なだらかに下降し癒刺激時の値に復する変化カiみられた｡こめ夫痘瘡IgGに誘導される一過 性の細胞内Caれ濃度の上昇は/U■73122(1-10〝M)を含む培養簸で30分間前処理することにより,著しく抑制

された｡10〝M,5分由の前年鱒でも両様め抑制反応がみられた｡それにれ∴ロ7§紬(10〟叫,DMSO(0･01%)

によるコントロールでは,抑制されなかった｡ 3)天痘瘡IgGは添加後20秒をピークとする一過性の帆生成を引き起こすため,∴IgGの添加20秒後のIP3量を比較 した｡U73122(1-100〟M)で30分間前処理すると,天癌癒IgGに誘導されるIP3生成は抑制された｡一方,U73343 (10FLM),､DMSO(0.01%)では,IP,生成の抑制はみられなかった｡ 4)培養掛こ分泌されたPAの活性は,24時間までは時間依存性に増加し,その後プラトーに達するが,天癌癒IgG を添加すると,類天板瘡,健常人IgGを添加した場合と比較して,24,36時間後でPA活性は顕著に増加した｡ この天痘瘡IgGによ㌍A活性の増加札U73122(1-100FLM)を作用させることにより抑制され,類天板瘡,健 常人IgGによる､レベルまで劇的に低下した○それに対し叩3343(10〟M)では,天痘痕IgG誘導性のPA活性の 上昇の抑制はみられなかった｡ 5)10%天癌瘡血清を添加.し24時間培養したDJM-1細胞では,ケラチン線維が細胞接着面から嘩周囲に収縮し, 細胞接着の難解が引き起こされることが,抗ケラチン抗体を用いた免疫蛍尭染色でとらえられた｡一方天桓癒血 清と共に10〝MのU7312.2を加えた細胞では,,この変化は抑制され,隣接する細胞との連結が観察された○ 本研究において,P!.C阻害剤;U73122は,細胞の生存性や抗体の細胞への結合能に影響するこ.となく,天病 魔IgGによって誘導される細胞内Ca2+の変動とIP3の生成,PA分泌を抑制することが,明らかにされた○これら の結果より,天痘瘡IgGによ冬培養表皮細胞内シグナノ}伝達における,PLCの関与が示唆′された｡ 論文書査の結果の要旨 申請者 _{江崎智香子は,培養表皮細胞を用いて尋常性天桓瘡の抗体結合後の水痘形嘩メカニズムに串けるCa2+} 依存性シグナル伝達機構を検討し,､ホスホリパーゼCの関与を示した｡これらの知見は,天痘瘡における水癌形 成メカニズムだけでなく,自己免疫性水痘症の病態を解明するうえに少なからず寄与するものと認める｡ [主論文公表誌] PharmacologlCeVidenceforinvQIve甲entOfphospholipaseCinpemphigusIgG-inducedinositoll,4･5-trisphosphategerleration,.intracellularcalciumincrease,andplasminogenactivatorsecretionin DJM-1 cells,a SquamOuS Cellcarcinomaline