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Studies on molecular biological characteristics of antigenic structure of the rabies virus nucleoprotein

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Academic year: 2021

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Title

Studies on molecular biological characteristics of antigenic

structure of the rabies virus nucleoprotein( 内容の要旨 )

Author(s)

五藤, 秀男

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第015号

Issue Date

1995-03-14

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/2069

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

(2)

名(本籍)

学位授与年月

学位授与

要件

研究科及

び専攻

研究指導を受けた大学

(岐阜県)

博士(獣医学)

獣医博甲第15号

平成7年3月14日

学位規則第4条第1項該当

連合獣医学研究科

獣医学専攻

岐阜大学

Studies on molecular biological

characteristics ofantigenic structure of the rabies virus nucleoprotein

主査

阜 大

副査

阜 大

助教授

副査

帯広畜産大学

副査

手 大

副査

東京農工大学

之一助

狂犬病ウイルスの主要な構造蛋白質であるN蛋白質は、最近マウスやイヌにおいて感染

防御を誘導できることが示され、新しいワクチンへの応用に期待されている。しかしな

がら、N蛋白質の構造とその機能についてのこれまでの研究は少く、その諸性状はほとん

ど明らかにされていない。さらに、現在日本で使用されている動物用ワクチン株のRCHL 株については、いまだ分子生物学的性状が知られていない。そこで、この研究はRCHL株 を用いてN蛋白質の分子生物学的性状を明らかにすることを目的とし、N遺伝子の分離を

行いN蛋白質の発現系を大腸菌で構築した。さらにこの発現系と合成ペプチドを用い、モ

ノクローナル抗体(MAb)のエピトープを同定し抗原領域をアミノ酸配列上にマッピング した。 1)RC-RL株N蛋白質の塩基配列の決定 他の株で報告された同じ長さのORFを含むRC-HL株N遺伝子のCDNA(N c DNA)を合成 した。塩基配列と推定アミノ酸配列を他の固定毒株(CVS、PV、SAD B19、ERA)と比較す ると、そのホモロジーはそれぞれ91.0づ1.8%と95.1-95.8%であった。塩基配列において、 RC-HL株を含めた4株において変異の認められる183ヶ所のうち、RCHL株は41ヶ所でCVS株

(3)

と同じ塩基を保存していたが、PV、SADB19株とはわずか3ヶ所のみであった。アミノ酸 配列では、29ヶ所においてRC-HL株の変異が認められ、そのうち11ヶ所は蛋白質の構造を 変化させる可能性がある非同義置換で、5ヶ所はC末端側に位置していた。RC-HL株とCVS 株での非同義置換の数はIICHL株と他の株との間より少なかった。これらの結果は、RC HL株とCVS株が共にPV株を由来とするこれまでの推測と矛盾しなかった。 2)狂犬病ウイルスN蛋白質の大腸菌での発現と抗原領域のマッピング N蛋白質の抗原領域ⅠとⅣは主にリニヤーエピトープが存在する。そこで、これらの領 域をマッピングをするため、N蛋白質の大腸菌での発現系を構築した。NcDNAは発現ベク タ∼PET3aに組み込みE・α,)iBL21に導入した。プラスミドを導入された大腸菌は、IPTGの発 現誘導によって56kDaの蛋白質を産生し、この56kDa蛋白質はN蛋白質に特異的なMAbと反 応性を示した。次に、さまざまな欠損変異N蛋白質を大腸菌で発現させ、1領域とⅣ領域 を認識するMAbとの反応性をウエスタンプロット法で調べ、エピトープの領域を推定した。 その結果、抗原領域ⅠとⅣは360から383アミノ酸領域の24アミノ酸で構成されることがわ かった。さらに、狂犬病ウイルスと狂犬病関連ウイルスでよく保存されているⅠ領域は、 この24アミノ酸を比較することにより360から369アミノ酸領域であることが示唆された。 3)N蛋白質のエピトープマッピングと抗原領域の構造解析

357から387アミノ酸領域をカバーする連続した8アミノ酸の合成ペプチドとMAbとの反応

性から、Ⅰ領域に含まれる3偶のエピトープとⅣ領域の1個のエピトープは358カ、ら367アミ ノ酸領域に位置することがわかった。ⅠⅤ領域については、再び大腸菌発現系で詳しく調 べたところ、独立した2つのエピトープが360から366と375から383アミノ酸領域で構成され ることがわかった。Ⅳ領域に含まれるMAb8-1のエピトープは、抗体と反応するためには エピトープの他にN蛋白質のN末端側のアミノ酸領域が必要であった。抗原領域ⅠとlVを

認識するMAbを用いて狂犬病ウイルス感染細胞を観摩すると、1領域と1V領域のMAbは

異なるN蛋白質分子を認識することがわかった。この現象は感染細胞のシクロヘキシミド

処理の実験から、Ⅰ領域は主に未成熟なN蛋白質で形成されているのに対し、Ⅳ領域はヌ

クレオカブシドの状態の成熟したN蛋白質で形成されることを示唆した0 この研究において、N蛋白質の抗原領域を形成するアミノ酸を明らかにすることができ た。又、モノクローナル抗体によりN蛋白質分子の構造的違いを検出できることを示し、 今後のN蛋白質の詳細な構造解析に応用できる可能性を示唆した0

申請者

五藤秀男君の学位論文は、現在日本で使用されている狂犬病の動物川

ワクチン株であるRC-HL株について、従来全く解明されていなかったN蛋白質の

構造と機能を分子生物学的に解析した結果をまとめたのもである。

(4)

-118-氏は、まず狂犬病ウイルスRC-HL株のN遺伝子の分離を行い、N蛋白質の発現系を大腸

菌で構築することを試み、次いでこの発現系と合成ペプチドを用い、モノクローナル抗体

(MAb)のエピトープを同定し、抗原領域をアミノ酸配列上にマッピングすべく研究を

展開している。

得られた成績は、次の3つに大別することができる。

1)RC-HL株N遺伝子の塩基配列を決定することに初めて成功した。さらにこの塩韮

配列及び推定アミノ酸配列を、狂犬病ウイルス固定毒株の他の4つの株(CVS、PV、

SADB19、ERA)のそれらと詳細に比較検討し、RC-HL株とCVS株が共にPV株に由来

するという従来の推測を、退伝子解析の面からも実証している。

2)N蛋白質の大腸菌での発現系を構築することに成功し、さらにさまざまな欠損変異

N蛋白質を同時に大腸菌で発現させることによって、N蛋白質の抗原領域Ⅰと1Vのマッピ

ングを行い、これが360から383番目までの24アミノ酸で構成されていることを明らかに

した。また、狂犬病ウイルスと狂犬病関連ウイルスでよく保存されている1領域が361)∼

369番目のアミノ酸領域であることを示唆した。

3)N蛋白質のエピトープマッピングを行い、その結果をもとにN蛋白質の抗原領域の

構造解析を行っている。上述の抗原領域Ⅰと1Vをカバーしうる24個の連続した8アミノ酸

の合成ペプチドと、ⅠとⅠⅤ領域を認識するMAbの反応性から、エピトープのマッピング

に成功した。さらにこれらMAbを用いたFA反応で狂犬病ウイルス感染細胞を観察した

成績を総合して、Ⅰ領域は主に未成熟なN蛋白質で形成されているのに対し、1V領域はヌ

クレオカブシドの状態の成熟したN蛋白質で形成されることを示唆する結果を得た。

これらの研究をとおして、申請者は狂犬病ウイルスRC-HL株のN蛋白質の抗原領域を

形成するアミノ酸配列を決定し、またMAbによりN蛋白質分子の機能的差異を検出でき

ることを明らかにした。これらの成続は今後更にN蛋白質の詳細な構造解析にも応用しう

る可能性を示唆しており、極めて貴重な知見を提供しているものと考えられる。

審査委貝会は、本提出論文ならびに基礎となる学術論文1編(その他審査当日までに

(5)

Arch.Virol.に受理された論文1編)および既発表論文4編についでl真重に審査した結果、

博士(獣医学)の学位論文としてふさわしい内容であると認定した。

参照

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