原 著
〔東女医大誌 第63巻 第12号頁1510∼1519平成5年12，月〕
ヒト脱落膜からのinsulin−like growth factor結合蛋白一1（IGFBP−1）
分泌の調節機序に関する研究
東京女子医科大学 産婦人科学教室（主任：武田佳彦教授）
マツ オ アケ ミ
松 尾 明 美
（受付 平成5年8月25日）
Studies on the Regulation of Instllin・Like Growth Factor・Bind量ng．Protein・1
Release in Human Decidua
Akemi MATSUO
Department of Obstetrics and Gynecology（Director：Prof． Yoshihiko TAKEDA）
Tokyo Women’s Medical College
The deddua is known to produce a large amount of insulin4ike growth factor・binding protein−1
（IGFBP−1）during pregnancy． We studied the hormone and nutritional regulation of IGFBP−1 release by
decidual cells． Progesterone stimulated IGFBP−1 release in a dose−dependent manner that vレas
inhibited by the addition of RU38486， a potent progesterone antagonist． While epidermal growth factor
had no effect on IGFBP−1 release， both De串（1・3）IGF・I and insulin inhibited IGFBP−1 release dose
dependenty．・Since progesterone and IGF−I are produced in the placenta， these results suggest the
existence of placental regulation of IGFBP−1 release by the decidtla． The fact that low concentrations of
glucose evoked IGFBP−1 release， while IGFBP・1 release was stimulated in the presence of a non・
metabolizable glucose，2−deoxy−D−glucose， suggest that intraceullular concentrations may regulate
IGFBP−1 release． Similarly， deprivation of amino acids stimulated IGFBP・1 release， however， IGFBP−1
release was not stimulated in the presence of aromat童。 and acidic amino acids．
These results suggest the ex量stence of a mechanism for regulations IGFBP・1 production that is
activated by specific amino acids．
緒 言
Insulin−like growth factor（IGF）は成長因子
の一つであり，構造の類似した2つのポリペプチ
ド，IGFIとIGF−IIが存在する1）2）． IGFは血中や
体液中ではそのほとんどがIGFの特異的結合蛋
白（IGFBP）と結合した状態で存在しており，現
在IGFBP−1からIGFBP−6までの6つのIGFBP
が同定されている3）4）．このうちIGFBP1は画商鎖
構造を有する結合蛋白で血中ではIGFと結合し
ていない不飽和の状態で存在し，IGF−1とIIに対
して同様な親和性を有している5）．その血中動態
は低血糖，飢餓などの低栄養状態で増加し6），逆に
高血糖やインシュリンで低下する7）．IGFBP・1は
IGF−1の作用を抑制することが報告されている
が8），IGFの作用を増強するという報告も見られ
る9）．
近年の研究によりIGFBP−1は子宮内膜の生理
に深く関与して．いることが明らかとな．り．つつあ
る．子宮内膜の周期的な形態の変化が，卵巣のス
テロイドホルモンによりコントロールされている
ことは周知の事実である．エストロゲンは子宮内
膜の増殖を促進し，プロゲステロンはエストロゲ
ンのこの作用を抑制すると共に，子宮内膜にグリ
コーゲンの蓄積や分泌能の充進などの機能分化を
促進する．子宮内膜はIGFのレセプターを保有し
ており1D＞， IGF自身も産生する11）．しかも，子宮内
膜’のIGFレセプターとIGF自身はエストロゲン
により増加し，このことよりエストロゲンの子宮
内膜増殖作用は子宮内膜のIGFとそのレセプ
ターのautocrine機構を介して発現される可能性
が示唆される，また，子宮内膜はIGFBP−1を産
生・分泌するが，増殖期の子宮内膜にはIGFBP−1
は発現しておらず分泌期の子宮内膜にのみ見られ
る12）．子宮内膜とプロゲステロンをインキュベー
トすると培養液中にIGFBP−1分泌が増加するこ
とから13），子宮内膜のIGFBP−1産生はプロゲステ
ロンにより制御されといると考えられている．
IGFBP−1はIGF−1が子宮内膜のIGF−1レセプ
ターに結合するのを抑制し10），子宮内膜に
IGFBP−1が発現する時期に一致して内膜は増矩
期から分泌期へ移行する．このように，子宮内膜
に対するエストロゲンの増殖作用，プロゲステロ
ンの分化作用には子宮内膜のIGF・IGFBP−1系が
深く関与している．IGF・IGFBP−1系は脱落膜と絨
毛組織との相互作用の中でも重要な役割を担って
いると考えられている．絨毛はIGFを産生しIGF
レセプターと含有する14）．従ってIGFはauto−
crine機構により絨毛の発育を促進すると考えら
れる．一方，卵巣のプロゲステロンにより脱落膜
化した子宮内膜は非二時に比較し1
ｽ量のIGFBP−
1を分泌するようになる15）．絨毛は非常に強い増殖
活性を持つが，その子宮への侵入は十分にコント
ロールされている。卵管妊娠や頚管妊娠に見られ
るように，脱落膜組織が十分に形成されない部位
への着床では絨毛組織は母体側組織へ高度に侵入
していくことを考えると，脱落膜化した子宮内膜
から分泌されるIGFBP−1がIGFの絨毛への作用
を抑制することにより，絨毛が子宮壁に侵入する
のを防いでいることは十分に考えられることであ
る．
このように，子宮内膜・脱落膜から分泌される
IGFBP−1は重要な生理学的意義を持つが，その分
泌調節機構については不明な点が多い．本研究で
は脱落膜細胞を用い，各種ホルモンがその分泌へ
与える影響を検討するのを目的とした．また，
IGFBP−1の主要な産生臓器である肝臓では
IGFBP−1産生は糖などの栄養因子により影響を
受けるが16），脱落膜のIGFBP−1分泌も栄養因子の
制御を受けているかどうか検討した．
実験材料および方法
1．実験材料
プロゲステロン，エストラジオール，シクロヘ
キサマイドは米国Sigma社（St． Louis， US．A）
より，また，インシュリンは和光純薬工業（大阪），
ヒトepidermal growth factor（EGF）は湧永製
薬（大阪）よりそれぞれ購入した．Des（1−3）IGF−1
はオーストラリアのGroPep社（Aeelaide， Aus−
tralia），プロゲステロンのアンタゴニストである
RU 38486は日本ルセル社（東京）より提供された
ものを使用した．プロゲステロン，エストラジオー
ルおよびRU 38486は使用時にエタノールに溶解
し，培養液に添加した．培養液中のエタノール濃
度は1％以下であり，この濃度のエタノールは
IGFBP−1分泌に影響を与えないことを確認した．
その他のホルモンおよびシクロヘキサマイドは培
養液に希釈して使用した．コラゲナーゼ（type I）
とDNase−1は和光純薬工業（大阪）より購入した．
2．脱落膜細胞培養
脱落膜は社会的適応により人工妊娠中絶術を施
行した妊娠8∼10週の正常妊娠例より，イン
フォームドコンセントを得た上で採取した．得ら
れた脱落膜組織は細切後199培養液（Gibco Japan，
東京）中でコラゲナーゼ（10mg／g組織）および
DNase−1（1mg）と共に37℃で30分浴温槽中でイ
ンキュベートし，遊離細胞を作製した．遊離細胞
はナイロンメッシュにて濾過し未消化の組織を取
り除き800×gで10分間遠心後，Marko仔ら17）の
方法に従いパーコール上に重層し間質細胞を単
離し，約20万個／mlの濃度で1640培養液（25mM
HEPES，2．2g／1 NaHCO3，10％胎仔牛血清，0．1
mg／ml gentamycin， pH7．4）中で95％air，5％
CO2下で2日間培養後実験に使用した．なお，遊離
細胞作製時のトリパンブルーによる細胞のvia−
bilityは常時80％以上であった．
3．ホルモン負荷実験
2日間培養後，細胞は胎仔牛血清を含まない
0．1％BSA添加1640培養液で3回洗浄し，さらに
同培養液中で各種濃度のプロゲステロン，エスト
一1511一
ラジオール，インシュリン，EGF， Des（1−3）IGF−1
と共に37℃で24時間，95％air，．5％CO2下でイン
キュベートした．インキュベーション後，培養液
を採取しIGFBP−1測定まで一20℃で保存した．．
本培養系ではプロゲステロンはIGFBP−1分目
を促進させたが，その機序を検討するため細胞を
RU 38486とシクロヘキサマイド存在下にプロゲ
ステロンとインキュベートしたときのIGFBP−1
分泌も測定した．
4．糖およびアミノ酸のIGFBP・1分泌・に与え
る影響
細胞を2日間培養後，胎仔牛血清を含まない
0．1％BSA添加1640培養液で3回洗浄し，さらに
1640培養液のグルコース濃度を0∼2，000mg／1
に調整したものとグルコースを，非代謝性で細胞
内の糖利用を阻害する物質である2−deoxy−D−
glucoseに置換，した培養液中で細胞を37℃，95％
air，5％CO2下でインキュベートした．アミノ酸
に関しては必須アミノ酸を全く含まない培養液，
分岐鎖アミノ酸（ロイシン，イソロイシン，バリ
ン）のみ含む培養液，芳香族アミノ酸（チロ．シン，
フェニルアラニン，トリプトファン）のみ含む培
養液，酸性アミノ酸（グルタミン酸，アスパラギ
ン酸）のみ含む培養液を作製し，それぞれの培養
液と細胞をインキュペーシ重ンした．インキュ
ベーション時間は細胞に必須の栄養素であるグル
コースとアミノ酸を含まない培養液で培養するた
め，細胞への悪影響を考慮し／2時間とした．この
インキュベーション時間ではトリパンブルーを用
いた検討で，細胞のviabilityへの影響に見られな
かった．
表1 エストラジオールとプロゲステロンのIGFBP一
1分泌へ与える影響
培養液中IGFBP・1
（％ n＝5）
コントロール
100．0
エス．
gラジオール（μ9／ml）
0．σ1
104．5±2．3
0．1
103．2士2．6
1．0
104．4±2．4
プ・ゲステ・ン（μ9／mD
0．1
106．2±6．7
1．0
178．5±5．9＊
10
22L6．±14，6象
5回同様の実験を繰り返し，その平均値を示す．
IGFBP1濃度はコントロールの時のIGFBP4分泌を100％
とした時のパーセントで表示．
寒二pく0．0001vsコントロール．
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0．1
1．0
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1』
10
プロゲステロン （μglml｝
頗pく0．001vsコントロール
エストラジオール （μ91ml｝
図1 エストラジオールとプロゲステロンの玉GFBP−1分泌へ与える影響
5．IGFBP・1測定
培養液中のIGFBP・1はMedix Biochemica社
（Kauniainen， Finland）より提供されたエンザイ
ムイムノァッセイキットを使用して測定した．こ
のキットのアッセイ感度は1ng／mlであり， intra
およびinterassayの誤差はいずれも5％以下で
あった．IGFBP−1の測定値の有意差検定はStu−
dent t検定を用いた．濃度依存性の検定は最小二
乗法．
ﾉより検定した．各実験は最低3回行い，図
のIGFBP4値は代表的な1回の実験結果を示し，
表のIGFBP−1値はすべての実験の平均値のパー
セント表示を示す．IGFBP−1濃度は，各種ホルモ
ンー濃：度あたりtriplicate cultUreで行い，その平
均をmean±SE「で表示した．
結 果
1．ホルモンのIGFBP−1分泌へ与える影響
脱落膜細胞を24時間インキュベーションしたと
きの培養液中のIGFBP−1濃度は800ng／ml前後と
なる．エストラジオールを0．01∼1μg／mlの範囲
で添加してもIGFBP−1分泌はコントロール値と
同程度であ．
ﾂたが，プロゲステロンを0．1∼10μg／
mlの範囲で添加するとIGFBP−1分泌はプロゲス
テロンの濃度依存性に増加した．プロゲステロン
10μg／mlではIGFBP−1値は約1，950ng／mlとな
り，．コントロール値の約2，4倍に増加した（図1，
表1）．
1μg／mlのプロゲステロン添加時のIGFBP−1
分泌は1μg／mlのRU 38486の同時添加によりコ
1ントロール値にまで抑制されたが，RU 38486の単
独投与ではコントロール値と比較し有意な変化は
見られなかった（図2）．
プロゲステロンによるIGFBP−1分泌充進が蛋
白合成を介しているかどうかを検討するため，シ
クロヘキサマイド添加時のIGFBP・1分泌を調べ
た．1μ9／m1のプロゲステロン添加時のIGFBP−1
分泌は5μg／mlのシクロヘキサマイド添加で完全
に抑制され，IGFBP−1値はコントロール値以下と
なった（図3）．
一方，Des（1−3）IGF−1はIGFBP−1分泌を容量
依存性に低下させた．IGFBP−1分泌は10−10Mの
Des（1−3）IGF−1添加で有意にコントロール値よ
り低下し，10−6M Des（1−3）IGFIではコントロー
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コントロール
★★垂ｭ0．001vs プロゲステロン単独添加
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RU38486
コントロール
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図2 プロゲステロンのIGFBP・1分泌に及ぼすRU 38486の影響
一1513一
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★★吹モO．001vs コントロール
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一10
一9
一8
一7
一6
Des（1−3）IGF−1（log M）
図4 Des（L3）IGFIのIGFBP−1分泌へ与える影響
表2 Des（1−3）IGF−1のIGFBP・1分泌へ与える影響
Des（1−3）IGF・1
培養液中IGFBP・1
（log M）
（％ n＝5）
コントロール
100．0
一10
85．7±2．3
一9
73．8±3．7＊
一8
63．1±5．6＊
一7
52．4±3．4艸
一6
50．8±10．2＊＊
5回同様の実験を繰り返し，その平均値を示す．
コントP一ルはDes（L3）IGF−1無添加の培養液で培養し
た．IGFBP・1濃度はコントロールのIGFBP−1分泌を100％と
した時のパーセントで表示．
＊：P〈0．001vsコントロール，．＊＊：P＜0・01 vsコソト
ローノレ。
ル値の47％までIGFBP−1値は低下した（図4，表
2）．Des（1−3）IGF−1のED50は6．2×1『10Mで
あった．
同じくインシュリンはIGFBP−1分泌を低下さ
せ，10−6Mインシュリンはコントロール値の55％
までIGFBP−1値は低下し，そのED5。は7．7×1rg
Mであった（図5）．
一方，EGFは10『loM∼10 6Mの間でIGFBP−1
分泌に有意の変動は見られなかった．
表3 培養液中グルコース濃度が硲FBP−1分泌へ与
える影響
グルコース濃度（mg〃）
培養液中IGFBP−1
@ （％ n＝5）
0
319．2±152＊
62．5
174．3±8．9＊＊
125
88．7±3．5
250
97．8±7．1
500
102．2±3．5
1，⑪00
105．4±12．3
2，000
100．0
2−deoxy−D−glucose
@（2，000mg〃）
316．3±7．3＊＊
5．回同様の実験を繰り返し，その平均値を示す．
IGFBP−1濃度は培養液中グルコース濃度2，000 mg〃の時の
IGFBP−1分泌を100％とした時のパーセントで表示．
串：p＜0．001vsグルコース2，000 mg〃，＊＊：pく0．01 vs
グルコース2，000mg〃．
2．糖およびアミノ酸のIGBP・1分泌に与え
る影響
1640培養液は2，000mg／1のグルコースを含む
が，この濃度を低下させていくとグルコース濃度
が62．5mg〃となった時点でIGFBP−1分泌はコン
トロールの174％に増加し（表3），グルコースを
全く含まない培養液ではIGFBP・1濃度はコント
ロールの319％まで増加した．培養液のグルコ特ス
言
6
ε
左
目
⊆
1000
800
600
400
200
0
★Pく0．01
VS コントロ
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