四国医誌 45 巻5号 370 ～531 OCTOBER ,52 8991 （平)01 307
原 著
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による
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DFUR
の増強効果の検討
記 本 晃 治
徳島大学医学部耳鼻咽喉科学教室（主任：小池靖夫教授） （平成01 年9月1日受付） SCC-25 細胞， FRO 細胞， KB 細胞に対して， 5－
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d e o x y - enidir5 -uoroulf ( 5－
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DFUR ）と， emoldayriDip (DP ）の併用による5－
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DFUR の抗腫蕩効果増強の有 無につき，主としてMTT yassa を用い， n viorti で実 験的検討を行った。 さらに L細胞において5－
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DFUR とDP 併用による影響についても検討した。 FRO 細胞， KB 細胞に対しては， DP による5－
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DFUR の明らかな増強効果は認めず，併用により抗腫蕩効果が 低下する傾向がみられた。 これに対し， SCC-25 細胞で はDP の併用により， 5－
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DFUR の抗腫蕩効果の有意な 増強を認めた。さらに L細胞においては， DP 併用に より増殖抑制が有意に減弱したことより，耳鼻咽喉科領 域における主たる癌組織型の扇平上皮癌に対して， DP が5－
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DFUR の効果を増強し，正常細胞に対しては副 作用を軽減させる可能性があると考えられた 。 最近多くの抗癌剤が開発され，その進歩はめざましい が，化学療法により治癒を期待できる癌は限られている 。 また，単剤での効果にも限界があるのが，現状である。 このため多剤併用などにより，既存の抗癌剤の抗腫蕩活 性を増強させたり，副作用を軽減させることにより 治 療 効 果 を 向 上 さ せ る 努 力 が な さ れ て い る 。 B i o c h e m i c a l niolatduMo も そ の ひ と つ で あ る 。 B i o c h e m i c a l nioatulodM は癌化学療法の場において，抗 癌剤（e妊rotce ）を投与する前後，あるいは同時に，ほ かの抗癌剤あるいは非抗癌剤（orlatodum ）を投与する ことによってe除rotc の薬理動態を変化させ，抗腫蕩効 果を高めたり，正常細胞に対するe百rotce の障害，副作 用を軽減させることで 化学療法係数を増大させ，癌化 学療法の効果を増強させようとするものである21, ）。 5 -f l u o r o u r a c i l (FUra ） に 対 す るtordulamo と し て は M e t h o t r e x a t e 3 ・4 ), Ln5iorvcoue l, U6licar ・ ,7)8norefretnI l などがある 。また， elomdairyDpi (DP ）がFUra の抗 腫蕩効果を増強するとの報告もある9。） 今回筆者は， SCC-25 細胞， FRO 細胞， KB 細胞に対 して， FUra の 潜 在 活 性 型 薬 剤 で あ る5－
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oxy-de 5 -f l u o r o u r i d i n e ( 5－
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DFUR ）と DP の併用による， 5－
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DFUR の抗腫蕩効果増強の有無につき，主としてMTT a s s a y を用い， n viorti での実験的検討を行った。さら に， L細胞において5－
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DFUR とDP 併用による影響に ついても検討した。 材料および方法 使用細胞および培地 SCC-25 細胞（舌，ヒト扇平上皮癌）は， AMERICANTYPE CULTURE COLLECTION 干士のものを用いた。 培地としてs'elgaE Minimum laitnessE Medium 培地（大
日本製薬株式会社）とハム
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1
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培地（大日本製薬株式会社）等量に， ltafe%01 flac serum (BIO WHITT AKER 杜） , ineutam-glL ,)l/gm292( enostirocordyh .0( 36μg/ m l ) nil, plicine UOOl( /m)l , snicmytoeptr OμlO()mlg/ を加えて｛吏用した。 FRO 細胞（甲状腺未分化癌）は，山下俊一教授（長 崎大学医学部附属原爆後障害医療研究施設発症予防部 門）より提供をうけた。培地としてRPMI1640 培地（大 日本製薬株式会社）に， laet%f01 flac m,rues nillicinep ( l O O U / m l ) , inycomptrets μOO(l)mlg/ を加えて使用 した。 KB 細胞（domierpide anomarcic ）は，桑野信彦教授 （当時大分医大，現在九州大学）より提供をうけた。培 地としてMinimum laitnessE Medium 培地（大日本製 薬株式会社）に， ltafe%10 flac ,mrues enimatulg-L 292( m g / 1 ) , micynatneg μ(25/mlg ）を加えて使用した。 L細胞（マウス皮下組織）は桑野信彦教授（当時大分 医大，現在九州大学）より提供をうけた。培地としてハ
3 0 8 ムF-12 培地に， laetf%01 flac ,mures nillicinep lOOU/( m l ) , inymctorpets OμO(lml)g/ を加えて使用した。 実験1 : SCC-25 細胞を用いて， 0.1% トリパン青液で 染色し算定盤により測定した細胞数と MTT ysaas での 測定結果との相関を調べた。 細胞数の測定は，以下のように行った。 1 ）平底llew42 の プ レ ー ト で 各 濃 度 の 培 養 細 胞 の 上 j青を吸引で除去し， 0.125% トリプシンμ0051 で， プレートより残った培地を取り除き，その後0.125% トリプシン 1 ml を力日えた。 2) 51 分間， 37 ℃， 5 %CO2 のroatbunci 内に静置した。 3 ）パスツールピペットで細胞を剥がし，顕微鏡で細胞 が剥がれたことを確認し パスツールピペットで チューブに入れた。 4）培地を4 ml 加えて計5ml にした。 5) lOOOrpm で5分間遠心した。 6）上清をデカンテーションして捨て，培地を 1 ml 加 えた。 7) 1.0 %トリパン青液を用いて，細胞数を算定盤にて 測定した。 上記の実験と併行して，MTT ysaas にての測定も行っ た。 MTT ysaas はCHEMICON 杜 の MTT-CELL GROWTH ASSAY キットを用いた。llew 内の培養細胞 に，培地0.5ml とMTT : ( 3 - ( 4 , 5 -dlozaihtlyhtemi 2 -)ly - 2 , 5 -lynehpid muilozartet bromide ）を050. ml 加え37 ℃， 5 %CO2 のrotaubcni 内で4時間反応させ た。反応終了後，lonaproposi .Ohtiw 04N HCl を0.5ml 用いてformazan を溶出させ 570nm の吸光度をELISA r e a d e r JS( aie AUTO READER ，三光純薬）により測 定した。 実験2 : SCC-25 細胞 FRO 細胞の培養細胞に対する 5人DFUR のeosd nesposer eurvc をMTT ayssa によ り求めた。実験のプロトコールは以下に示すとおりであ る。 1 ）平底lelw42 プレートに SCC-25 細胞は2 ×14Q 個／ m l / w e l l , FRO 細 胞 で は5 ×13Q 個／ll/weml ず つ 細 胞を播いた。 2) 81 時間， 37 ℃， 5 %CO2 、でteaubcni し 細 胞 が 付 着 したところへ，薬剤を各濃度に培地中に溶解・調整 し，この薬剤を含む培地で培地交換することに よ り 薬 剤 を 接 触 さ せ た 。 5
－
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DFUR の 濃 度 は 7 . ,5 .51 ,0 .03 ,0 .06 Oμg/ml とし，接触時間はそ 記 本 晃 治 れぞれ3 , 6 , 2,4 ,84 27 時間とした。 3) 5－
’
DFUR を接触させた後，各llew を薬剤を含ま ない培地にて3
回洗浄し薬剤を除去し，培地を加え て培養を継続した。 4）薬剤接触開始より27 時間後に， MTT ysasa を用い て測定を行った。 5）対照として， 5－
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DFUR を接触させず同様の実験 を行った。 ※5－
’
DFUR は，日本ロシュ株式会社より提供をう けた。 実験3 : SCC-25 細胞 FRO 細胞 KB 細胞の培養細 胞に対して， 5－
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DFUR とDP の併用による効果につき 検討を加えた。 DP の接触濃度は. 5μg/ml2 とした。培 養開始細胞数は，SCC-25 細胞： 2 ×14Q 個／,llew/lm FRO 細胞： 5×13Q 個／lel/wml KB 細胞： 1×1140 固／lelwl/m とし，実験2
と同様の方法で薬剤を27 時間接触させた後， MTT aysas により測定した。さらに， SCC-25 細胞につ いてはトリパン青染色により算定盤で細胞数を測定した。 ※oledampyriDi は，日本ベーリンガー・インゲルハ イム株式会社より提供をうけた。 実験 4 ：正常細胞にDP が及ぼす影響を調べる目的で L細胞の培養細胞に対する 5－
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DFUR とDP の作用につ いて検討を加えた。L
細胞の培養開始細胞数は5
×3
0
1
個／lel/wml とした。 5－
’
DFUR の接触濃度は30μg/ml, DP の接触濃度は2.5μg/ml ，接触時間は27 時間とし，薬 剤接触後， MTT ysasa を用いて測定を行った。 統計的検定 有意差の検定には， Mann-Whitney 検定を用い，相関 の検定には， rsonPea の相関係数を利用した。 実験1については，算定盤・MTT aayss ともに各濃 度6 wlle の測定結果を使用して検定した。 実 験2，実験3，実験4については，llew21 の測定 結果につき検討した。 結 果 実験1 : MTT ysasa では，各濃度の細胞の吸光度か ら細胞を含まない吸光度を差しヲ｜いたものをlacitpo d e n s i t y ( .0 D.）として示した。細胞数と mazanfor 生 成の関係は，相関係数. 90 89 (P<O. 10 ）で，吸光度は 生細胞を正確に反映していると考えられた。（図1 )3 0 9 D i p y r i d a m o l e による5 ’ーDFUR の増強効果 FRO 細胞における5 ’司DFUR のgnivivrus noitcarf evruc (MTT )yassa 図3 SCC-25 細胞でのMTTassay と細胞数の関係 接触時間 -0- 3h －ロ－ 6h 『。－ 24h
－
。
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48h ー＋ー-h72 s u r v i v i n g no合itca （）% 1 0 0 寸 90 寸 8 0 寸 70 寸 60 寸 5 0、I.，-J r 989=0. ( p <0.01) U n A D 9 8 1 β 5 4 3 2 OE
O
－ 0 0 0 0 0 0 0 0 2 5 . 0 2 0 . 0 1 0 . 0 0.15 細胞数（X 104) 5 . 0 6 0 . 0 1 5 . 0 0.03 5－’D町R濃度（μg/ml) 7 . 5。
5－’DFUR30μg /ml 単独に比して有意な増殖抑制の増強 を 認 め た （P<0.05 ） 。 さ ら に 併 用 時 で はginivrvsu f r a c t i o n 平均.84 05% で， 5－’DFUR 60 μg / ml 単独 ( s u r v i v i n g noitcarf 平均5.0 85% ）と向程度以上の効果 を認めた 。 SCC-25 細胞に対して， DP2.5μg /ml 単独， 5－’DFUR 7 . 5μg /ml ・ .51 Oμg /ml 単独， 5－’DFUR7. 5μg /ml ・ .51 0 μg/ml と DP2.5μg/ml 併 用 に て ， そ れ ぞ れ の 薬 剤 を72 時間接触させた後， トリパン青染色にて細胞数を測定し た結果を図5 に示す。 5－’DFUR 単独に比して， DP を 併用したものは，いずれも有意に増殖抑制が強くなった (p<O. 05 ）。 5－’DFUR7. 5μg /ml と DP2.5μg /ml 併 用 した際にはsginivrvu noitcarf 平均3.1 90% で， 5－’DFUR 1 5 . Oμg /ml 単独（sginivrvu noitcarf 平均3.7 06% ）以上 の増殖抑制を認めた。 FRO 細胞， KB 細胞に対しては， DP の明らかな増強 効果は認めず，併用により抗腫蕩効果が低下する傾向が みられた。（図6，図7) 実 験4 : L 細胞に対しては， 5－’DFUR 単独では増殖 抑制を示したが， DP 併用にて有意な増殖抑制の減弱を 認めた（p<O. 05 ）。 （図8) B i o c h e m i c a l ionModulat の 概 念 に よ るFUra の modurator としてはFUra の制癌効果増強作用を持つ， U r a c i l , nroerfetIn な ど が 察 M e t h o t r e x a t e , in,orcovLeu 考 SCC-25 細胞における5ー’DFUR のgnivivrus noitcarf evruc (MTT )yassa 実 験2
：対照を100% とした場合のそれぞれの薬剤濃 度，接触時間での吸光度の比をgniivvrus noitcarf とし， SCC-25 細胞，FRO 細胞に対する5－’DFUR のgniivrvus f r a c t i o n rvecu を作製した。（図2, 3 ）い ず れ の 細 胞 も， 5－’DFUR を長時間接触させると増殖抑制が強く なり，時間依存性の抑制を示した。 実 験3 : SCC-25 細 胞 に 対 し てDP2. 5μg/ml のみ， 5－’D FUR30μg / ml のみ， 5－’D FUR30μg/ ml とDP2.5 μg/m,l 5－’DFUR60μg /ml を72 時間接触させ， MTT a s s a y にて測定したngiivrvus noitcarf を図4 に示す。DP 2 . 5μg /ml 単 独 の 場 合 ， 増 殖 抑 制 は 認 め な か っ た 。 5－’DFUR30μg/ml とDP2. 5μg /ml を 併 用 し た 際 に は -B- r3h 4ト 6hr ~ 24hr 『企－ 48hr －＋ー 72hr 7 . 5 60 .0 接触時間 1 5 . 0 00.3 5・’：D町R濃度 （μ/g凶） n o ・ － － － p i v 仇ω
o b Q／ －m ／ k v w u C 3 90 司 8 0 ... 70 司 60 司 寸J
必 図2 1 0 0...晃 治 記 本 3 1 0 MTTassay ) FRO 細胞における薬剤の効果 （接触時間27時間 図6 MTTassay ) SCC-25 細胞における薬剤の効果 （接触時間27時間 図4 s u r v i v i n g no企itca （）% 100 n 0 ．
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－ d 、 、，， J h 例。
b －m v m ・．．．． ．．． ・．．．．．． ．． ・．．．．．．． －．－ －－－・． ・．．．．．．．． ・．．．．．． ．． ・・・ ・・・・．． ・・・－．．．．． ・．． ．．． ．．． ・ ． ．．． ．．．． ・・・・・・・．． ・－ － ・ー・． ． ． ． ・．．． ．． ．．． ・．．．．．．．． ・・・・． ．．．． ・．．．． ．． ・ ． ．．．．． ・．．． ．．． －．． －－－・ ・．．．．．． ・ ． ．． ．．． ・ ・ ・．．．． ・・・－－．． 80 60 40 20 ＊ ｜ ｜ ・．． ・・・・ ・． ・ ． ．． ．．． ・ ． ．．．． ・ ． ．．．． ・・．．． －－－．．． －．．．．． ・・．．・ － ・－－・ ・．． ・ ・ －・ －． ． ．・． ・ － －・ ・・．．．．．． ・－．． ． ・．．． ． ・ ． ．．． ・ ． ．．． ・．． 100 8 0 60 40 20 DP+S ’ーDFUR ターDFUR DP。
5ー’DFUR30+
5ー’DFUR60 DP。
DP : Dip yrlamoid 2 . e 5μg/ml 5ヘ
DFUR: 5’－ DFUR30μg /ml ターDFUR30 DP : D2.moleridaipy 5μg /ml 5’ーDFUR30: 5－’DFUR30μg /ml 5’ーDFUR60: 5－’DFUR60μg /ml*
:
p < 005. DP MTT as say ) KB 細胞にお ける薬剤の効果（接触時間27時間 n 0 ・u
台
%
。
bJIK．
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o δ 図7 ・． ・・・・．． ．．． ・．．．．． ．．． ・．．．．．．．． ・．．．．． ．．． －－－ ．． ．．．． ・．．．．． ．．． ・．．．．．．．． ・．．．．．．．． ・ ． ．．．． ．．． － － －・．．． ．－－－ －－・． ．． ． ・ ． ．．．．．． ． ・ ． ．．．．．． ． －－－－－． － －－． ・・・・・ ・・ ・． －・．． ・・．．． ・ ． ．．．．．．． ・ － －・ －－・・． ． ． ．．． ．．．． 100 80 60 c e l l tnuoc ) ｜ ｜ SCC 52- 細胞における薬剤の効果 （接触時間27時間 ＊ ｜ ｜ s u r v i v i n g 台notica （）% 1 0 0 図5 40 20 80 ω 40 2 0 DP+5'-DFUR ターDFUR DP。
。
DP : Dip yr.e2lmoaid 5μg /ml 5’－DFUR: 5’－ DFUR30μg /ml H i r o s e 1 3）らは， iaemkauel とlymphoma のllec enil に おいて，enitsircniV とDP を併用した場合，enitsircniV 単独に比べて細胞内のenitsircniV 濃度が上昇し，抗腫 蕩効果が増強したと報告 している 。Asoh ら15）はllecBK の 薬 剤 耐 性 株00,-3VJ HC - 7 - 5 /VCR を用いて， V i n c r i s t i n e , ycininomAct D とDP を併用した際には， A c t i n o m y c i nD
の細胞外排出が減少し，細 5 ' -D51RUF ＋ DP 5'-UFD R 7 + .5 5 にUFD R 1 5 DP DP : D.ole2dampyrii 5μg /ml 5’ーDFUR7. 5: 5－’DFUR7. 5μg /ml 5’－DFUR15 : 5－’DFUR15μg /ml*
:
p<0.05 5・7R－UFD .5 DP V i n c r i s t i n e , あり， DP もその 一つである 。一方， DP により効果が 増強される抗癌剤 （e旺rotce ） としては， FUra の他， Adriamycin1 ) , Methotrexate0 ・11) , V12 1enitsicrni ) , 3 A c i v i c i n 1 4）などが報告されている 。Dipyridamole による5’”DFUR の増強効果 図8 L細胞における薬剤の効果（接触時間72時間 MTT assay) s u r v i v i n g no世itca （ %） ＊ 1 0 0
｜ ｜
80 60 40 20。
DP ターDFUR DP+5'-DFUR DP : Dipyridoamle2. 5μg/ml 5－’DFUR: 5－’DFUR30μg /ml* :
p<0.05 胞内濃度が上昇して耐性が克服され，さらに， VJ-300 においてDPを作用させた際に 170kDa のband をも っnietrpocylg-P の発現が阻害されたと報告している。 今回の実験で使用した5－’xy-deo enidir5 uoroulf -( 5－’DFUR ）は， lica5-ruoulf (FUra ）の潜在活性型 であり，生体内では，neidiimryp edisoelcun sealyrhopsohp により FUra に転換され，その効果を発揮する薬剤であ 3 1 1 る。この酵素は小腸などを除き 正常細胞に比べて腫蕩 細胞に多く存在することから，腫蕩特異性が期待できる 化合物である。 FUra の作用機序はRNA の機能障害と DNA の合成 阻害である。 FUra は細胞内に取り込まれ，etatoro p h o s p h o r i b o s y l esarefsnart により FUMP に変換された 後，リン酸化を受けてFUTP となり， RNA に取り込ま れ， RNA の機能障害を起こす。また， FUra がenidiru p h o s p h o r y l a s e により FUrd に変換された後，enidiru k i n a s e によってFUMP となる経路もある 。DNA に関 しては FUDP 治、らeditoelcunobir eastcduer によって FdUDP となり，脱リン酸化されてFdUMP に変換され， これが,
5
Hz-0-C1 ,H4F etalydimyht estaehntys と三 量複合体を形成してdTMP 合成を阻害し，結果として DNA 合成の基質である dTTP を枯渇させ， DNA 合成 を阻害する。さらに，FUra からeniidymht esalryhospohp によってFdUrd に その後FdUMP に変換される経路 もある（図9。） D i p y r i d a m o l e (DP ）は，冠動脈拡張剤・血小板凝固 抑制剤として，以前より臨床に用いられている薬剤で， ヌクレオシドの細胞膜輸送を阻害する作用をもっOFUra に対する DPの作用は次のように考えられている 。すな わち， FUra の作用は細胞外からのenidimyht やenidiru の供給で阻害されるが DPにより これらのヌクレオ シドの細胞外からの供給が阻止されることによって， 図9 FUra の代謝 o r o t a t e lyosbriohspohp t r a n s f e r a s e PAPP PPi＼ノ
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~ ~ － 吟 悶A I R-1-P iP ATP ADP ATP ADP I ATP ADP d R -1imyht『J..--P i eI
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5 , IeyelnhteMQ- eatol-fzH H r f o l a t e PRPP lysobrio: phsohp tephaosophrpy R -1 -P etahpsoph-1-: esobir d R -1 -P etahpsohp-1e-so: biryxoed FUrd enidiruoroulf-5 FUMPenidiruoroulf-5 5 ' -m o n o p h o s p h a t e FUDP enidiruoroulf-5 5－ p’idtehaosph FUTP enidiruoroulf-5 5tahーsp’ohpirt e FdUrd enidiruyxo:5ed-'2-－or’oulf FdUMP :5r－’oulfenidiru。
yxoed-'2 5－’hatemonophosp FdUDP enidiruyxoed:5-'2-orou’lf 5e－t’haspophid FdUTP enidiruyxo:5ed-'2-－or’oulf 5tah－sp’ohprit e3 1 2 FUra の効果が増強される。さらに，細胞膜輸送の阻害 により細胞内のFdUrd の細胞外への輸送も抑制される ため，細胞内FdUrd 濃度が増加し，結果的にFdUMP 産生が増加し， FUra の効果が増強されると言われてい る9。） Asoh ら51）は， lleBcK とその耐性株のVJ-300 におい て， FUra とDP の併用にて FUra の抗腫蕩効果の増 強を認めたが， FUra の細胞内濃度は変化なかったと報 告している 。 さらに HeLa およびBl6melanoma 細 胞 においても FUra とDP の併用効果は認めたが， FUra の細胞内濃度の増加は認めなかったとの報告もあり,)61 FUra に対するDP の効果はヌクレオシドの細胞膜輸送 阻害によるegavlsa pathway の利用低下によるものと考 えられる。以上のように， FUra に対するDP の効果， 作用機序についての検討は行われているが，検索し得た 限りにおいて， 5－DFUR’ とDP の併用効果についての 報告は認めない。 そこで， SCC-25 細胞， FRO 細胞， KB 細 胞 に 対 し て， 5－DFUR’ とDP の併用による， 5ーDFUR’ の 抗 腫蕩効果増強の有無につき，n viorti で実験的検討を行っ た。今回の実験では，開始細胞数は，予備実験を行い， 安定した細胞増殖が得られ 実験時聞が細胞の対数増殖 期間になるように濃度を求め， SCC-25 細胞は2 ×140 個／ m l / w e l l , FRO 細胞では5 ×
3
0
1
個／,llew/lm KB 細胞は 1×140 個／llwe/ml L細胞では5×1Q 3個／llwel/m とし た。 また，薬剤の効果判定には MTT yassa を用いた。 MTT aysas はATP 合成に関与したTCA elcyc のー酵 素であるコハク酸脱水素酵素を細胞ytilibaiv の指標と して用い，そのコハク酸脱水素酵素の活性を示すための 酵素受容体としてlozaihtlytem muilozartet bromide (MTT ）を用いる方法である71～02。） MTT は淡黄色で あ る が ， 水 素 給 体 の 存 在 に よ り 還 元 さ れ て 紫 色 の f o r m a z a n を形成する 。 この反応は，細胞が死滅すれば s u c c i n i c naseehydroged 系酵素の活性を失い，紫色への 発色が起こらなくなる 。 このformazan の色の差を測定 することで薬剤の有効性を比較する方法がMTT yassa である。実験lにおいて細胞数とformazan 生成の関係 は，相関係数9.980 で，吸光度は生細胞数を正確に反映 していると考えられた 。ま た 実 験2 において5－DFUR’ が時間依存性の抑制を示したことより， DP の併用効果 の判定は，薬剤接触27 時間とし，その後にMTT ysasa にて測定を行った。 MTT ysasa では，培養が短期間で 記 本 晃 治 あり，時間依存性の薬剤の場合，その抗腫蕩効果の判定 に対して過小評価する可能性がある。しかし，山内ら21 ) は，耐性株を用いた基礎的実験により3
日間培養を行え ば評価可能であると述べている。I
n
ortiv での抗癌剤感受性の結果と臨床効果との相関 については06 ～80% 程度の報告が多い。 Wnesie 22laht ）は， 文献上の固形癌における各種の感受性試験の結果と臨床 成績との関係を0200 例についてまとめ， eurt evitisop r a t e 6 3 % , eurt evtiagen rate92% と報告している 。一般 に， MTT ysasa 等の抗癌剤感受性試験は，無効な薬剤 の使用を避けるという意味で有効で、あると言われている 。 また， MTT yassa では細胞の生物学的死と蛋白質であ る酵素の失活に時間的ずれがあり，細胞の死滅後にも酵 素活性が残存している場合があり，抗癌剤感受性試験と して利用する場合には，高濃度の制癌剤で処理する必要 があると言われている32）。実験 3 においても細胞数を算 定盤にて測定した場合と MTT ysasa による測定で，差 を認めた。そこで，効果判定の基準について，前原ら24 ) は， MTT ysasa において最高血中濃度の5～0
1
倍の抗 癌剤に3 日間接触させ osCI 値が得られたときに有効と 判定している。山本ら52）は 最高血中濃度と同程度の濃 度で 3 日間接触させ 対照と比較して吸光度が70% 以下 になったとき有効と判定している 。今回の実験は，薬剤 併用による相乗効果を調べることが目的であるため，詳 細な検討は行っていないが， MTT ayssa を抗癌剤感受 性試験として使用する際には 判定の基準をどこにする かを考慮する必要があると思われた。 しかし， MTT a s s a y は測定が比較的簡単で，結果を数値で示すことが でき，特に多くの検体あるいは薬剤についての検討を行 う際には測定時間も短縮できるという利点があり，有用 な方法と思われた。 5－DFUR’ とDP の投与実験結果は， KB 細胞， FRO 細胞に対しては， 5－ DFUR’ 単独では，抗腫蕩効果を 認めたものの， DP を併用した場合には， 5－ DFUR’ の 効果が弱まる傾向を認めた。 しかし， Asoh ら51）は， KB 細胞においてFUra とDP を併用した際に， FUra の効 果増強を認めたことを報告している。これらのことは， DP により 5－ DFUR’ の細胞内への取込みが抑制されて いる可能性があることあるいは 5－DFUR’ より FUra への転換抑制がおこっていること等が考えられる 。Asoh ら15）は， KB 細 胞 に お い てFUra の 代 謝 物 で あ る5 -f l u o r o u r i d i n e (FUrd ）と DP を併用した場合には， FUrd 単独に比べてFUrd の抗腫蕩効果が減弱し， FUrd の細D i p y r i d a m o l e による5－’DFUR の増強効果 胞内濃度が低下したと報告している。 5－’DFUR にも 同様のことがおこっている可能性も考えられるが，今回 の実験では細胞内濃度の検討は行えていない。 これに対して， SCC-25 細胞においては， DP2. 5μg/ml 併用により， 5－’DFUR の有意な効果増強を示した（pく 0 . 05 ）。また， DP2.5μg/ml 単独にては増殖抑制を認めな かったことより， SCC-25 細胞に対してDP が 5－’DFUR のmodurator として有効であると言える。また，今回 の検討で5 ’ーDFUR の有意な効果増強を示したDP 濃度 は，. 5μg/ml2 以上であった。 DP の血中濃度について は，工藤ら62）が人工弁置換術後の患者に術直後より DP 100mg の持続点滴， 3 日目より DP300mg の経口投与に て，血中濃度は経静脈投与時3 μg/ml 前後・経口投与 時2 μg/ml 前後であったと報告している。さらに，前 原ら72）は胃癌患者に対してDP50mg の 点 滴 静 注 と Adriamycin20mg の静注，およびDP300mg, FUral50 mg の経口投与を行い併用療法の臨床試験を行っている。 DP の平均血中濃度は点滴中8. 8μM (.2 l 7μg/ml) まで 上昇し， DP 点滴による副作用としては，顔面熱感・頭 痛・吐気・上腹部痛であり，いずれも軽度で，点滴終了 後に消失し， FUra あるいはAdriamycin の副作用増強 はなかったと報告している。さらに，実験 4 において， 正常細胞にDP が及ぼす影響を調べる目的で使用した L 細胞においては， DP2. 5μg/ml 併用にて， 5－’DFUR の増殖抑制が5－’DFUR 単独に比して有意に低くなっ た（p<O. 05 ）。以上のことより，耳鼻咽喉科において 主たる癌組織型である squamous llec carcinoma に対し ては， DP が 5－’DFUR の効果を増強し，一方，正常細 胞に対しては5－’DFUR の副作用を軽減する可能性も あると考えられた。 しかし，本実験では，扇平上皮癌については，使用し た細胞がSCC-25 細胞のみであり 正常細胞としてはL 細胞のみの検討である。その他の扇平上皮癌由来細胞お よびヒトの正常細胞を用いた検討が必要であると考えて いる。それにより，本実験と同様の結果が得られれば， さらに，薬剤の細胞内濃度測定による5－’DFUR に対 する DP の作用機序についての検討も行う予定である。 謝 辞 稿を終えるにあたり 御指導後校閲の労を賜りました 小池靖夫教授に深謝致します。また，直接御指導，御教 示をいただいた野口病院 野口志郎院長，具体的な実験 3 1 3 手技で御協力いただいた野口病院検査科渡辺陽子氏， 脇屋滋子氏，谷川陽子氏に深謝致します。 文 献 1 . 太田和夫：calemihcoiB .noitdaruom 医 学 の あ ゆ み，141 : 5,755-27 8719 2. 堀越茂：licachemBio moduration ーその概念と歴史 的背景－．消化器癌， 1 : 46,463-6 9191 3. ,onitreB ,.R.] ,ikcwiaS W. L,. ,tsiuqdniL .C ,.A and G u p t a , S.V :. dtnednpee-ludehcSe uromttina e旺estc o f meetaxertoht and .licaru5 -oroulf Cancer ,chreaesR 3 7 : 38,327-2 7197 4. 赤沢修吾，須田薙夫，吉田清一：MTX/ 5 -FU 時 間差投与法と消化器癌治療．消化器癌， 1 : 4-67 4 7 4 , 1 9 9 1 5 . Br,gere .S .H and ra,aaHk M. T : . pihsniotaleR fo dUMP nda eerf FdUMP sloop ionotitibihn tfoetalydimyh s y n t h a s e by 5 -.licaruoroulf l.oM .,lcomarhaP : 25 3 0 3 也309,1984 6. ,iijuF ,.Sa,dekI K吋Fukushima, M, and ,aksaariSh :.T E妊tce ufolicar and stisevitavired on aromutitn ytivitca o f 5 -licaruoroulf and 1 - ( 2 -t)lyurfrodhyatre 5 -f l u o r o u r a c i l . Gann, 69 : 72,7-763 8971 7 . ,iijuF ,.So,natiK ,.S,daekI ,.K and ,akasarihS :.T E宜tce o f noirtaistnimoadc fo licaru or neosiytc on teh antitumor tyvitica folacinilc doses 1 - ( 2 -fo t e t r a h y d r o f u r y l ) - 5 -licauroroulf and level 5 -fo f l u o r o u r a c i l rni.stnedo Gann, : 207 4,21-09 9197 8 . Warder, ,.S W e,ortsr ,.R Weinberg, ,.V Thompson, ,.D
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