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添付資料

2 SSR

マーカーによるブナシメジの

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SSR

マーカーによる

マーカーによるブナシメジ

マーカーによる

ブナシメジ

ブナシメジの

ブナシメジ

の

DNA

品種識別

品種識別マニュアル

マニュアル

ホクト株式会社きのこ総合研究所

Ver2.0

2014/10/20

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ブナシメジのDNA品種識別マニュアルの目次目次１．適用範囲２．一般事項３．測定の原理４．識別方法４．１方法の要旨４．２検査試料４．３購入試薬４．４調製試薬４．５機器・プログラム４．６実験操作４．６．１操作準備作業４．６．２操作場所４．６．３試薬および器具４．６．４試験材料の取り出し４．６．５ DNA抽出操作４．６．６ DNAの定量４．６．７ PCR増幅操作４．６．８ PCR産物の増幅確認試験４．６．９ SSRマーカーの検出方法４．６．１０データ解析、判定４．６．１１実験操作フロー図５．トラブルシューティング６．是正処理付属文書：１．ブナシメジ品種識別に用いる8種類のSSRマーカーの詳細２．8種類のSSRマーカーによる30品種のフラグメント長３．参考文献別添資料：農林水産省品種登録ホームページより「植物品種識別における品種同定理論」この目次リストはＤＮＡ鑑定学会の様式に準拠したものです。

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１．適用範囲ブナシメジ（Hypsizygus marmoreus）は、今日ではシイタケ、エノキタケに次ぐ第 3 位の消費量を誇る食用きのこで、きのこの需要が増大した結果、日本などで広く栽培され、流通している。国内生産量が増加し、現在では多くの品種が農林水産省に登録されるに至った。品種登録では、ブナシメジの重要な形質に基づいて品種が判断されるため、栽培試験による特性調査を行う必要がある。そのため品種を識別するためには数ヶ月の期間を要する。品種識別の簡易的な方法として、審査基準（http://www.hinsyu. maff.go.jp/）にあるように、対峙培養試験が有効とされているが、対峙培養試験であっても品種を識別するには1.5ヶ月程度要する。税関で育成者権侵害物品を取り締まるためには、短期間で侵害嫌疑貨物を疎明することが必要となる。そこで、ブナシメジの品種識別法を確立することを目的に、ブナシメジにお

いて多数のSSR（Simple Sequence Repeatの略、別名マイクロサテライト）領域

を同定し、そのうちの6種類の品種識別に有用なSSR マーカーを開発した。このマーカーにより当社保有の登録品種「ホクト白１号菌(品種登録番号：第13294 号)」と、持ち込まれたサンプル品種との異同の鑑定が可能である。基準品種：ホクト白1号菌（品種登録番号：第13294号) 被検査物：子実体菌糸体（ブナシメジ加工品は対象外）図 1 子実体（左図）と菌糸体（右図）２．一般事項本DNA品種識別マニュアルは、ホクト株式会社きのこ総合研究所（長野県長野市下駒沢800-8）で維持・栽培されている既存栽培品種の10品種（ホクト白1 号菌、MH025014、MH025016、MH025019、MH025022、MH025066、MH025091、 MH025146、MH025217、MH025374）、野生品種である 10 品種（MH025038、 MH025045、MH025046、MH025054、MH025070、MH025092、MH025097、MH025121、 MH025160、MH025339）、そして市販されている10品種（MH025012、MH025064、 MH025286、MH025288、MH025362、MH025369、MH025397、MH025462、MH025463、 MH025528）の計30品種を用いて、解析・作成されたものである。本 DNA品種識別マニュアルは、子実体または菌糸体から抽出した DNA を用

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いて、SSR マーカーによる分析法を確立し、マニュアルとして作成したものである。

３．測定の原理

SSRとは、Simple Sequence Repeatの略称であり、法医学では、Short Tandem

Repeat とも呼ばれ、STRと略称されている。SSR分析は、2～数塩基の反復配列からなる SSR 領域を特異的に増幅するプライマーを用い、PCR 法で増幅した DNA断片の長さの差異（遺伝子型）を検出する方法である。反復配列領域は、その反復回数に突然変異を起こしやすいとされており、DNA断片の長さを高精度で分析することにより、近縁な品種間でも判別が可能である。その測定手順は、１）ブナシメジのサンプルから、ゲノムDNAを抽出する。２）SSR 領域を特異的に増幅するプライマーを用いて、ブナシメジのサンプルから抽出したゲノムDNAとホクト白１号菌のゲノムDNAを鋳型にして PCR増幅を行う。PCRの際に、一方のプライマーの5’端に蛍光標識したものを用いる。３）蛍光DNAシーケンサーを用いて、PCR増幅産物を電気泳動で分離し、検出する。４）内部標準のサイズスタンダードを基に、フラグメント解析用ソフトウエアを用いて、PCR増幅産物の長さと遺伝子型を決定する。５）2)～4)を3回、反復実験を行い試験結果に矛盾がないか検討する。 (トラブルシューティング参照) ６）サンプルのブナシメジがホクト白 1 号菌と同一品種であるかを照合して判定する。４．識別方法 DNAマーカーの一種であるSSRマーカーを8種類用いた識別方法である。４．１方法の要旨ゲノム中に豊富に散在している 4 塩基以上の反復配列を挟み込むように設計したプライマーを用いて、PCR増幅断片長の差異を蛍光DNAシーケンサーで分析する。SSR 領域はその反復回数に突然変異を起こしやすく、塩基置換と比較して変異頻度が1～2ケタ大きいとされている。本マニュアルで利用する8種類のSSR マーカーは、ホクト株式会社きのこ総合研究所保有菌株「ホクト白１号菌」のゲノムDNA配列を次世代シーケンサーによって決定し、得られた配列を基に４塩基以上の反復配列を探索し、開発したものである。「表1. ブナシメジ品種識別に用いる8種類のSSRマーカーの特徴」と「付属文書１．ブナシメジ品種識別に用いる8種類のSSR マーカーの詳細」に詳細なデータを記している。

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４．２検査試料ブナシメジの子実体、菌糸体を検査試料対象とし、病害、虫害、その他の被害を受けていない健全な組織を用いる。1サンプル1子実体、または1菌糸体とする。基準とするホクト白1号菌のDNA、もしくは子実体、菌糸体は、ホクト株式会社きのこ総合研究所より入手する。入手した検査試料は、4℃で保存する。４．３購入試薬＜一般試薬＞・フォルテクターⅡ(消毒用エタノール)(日本化薬フードテクノ株式会社) ＜DNA抽出関係＞・Plant Geno-DNA-Template TM

（Geno Technology社, code: 786-135） Template Extraction Buffer

pink RESIN Wash-Ⅰ Wash-Ⅱ（要調製）スピンカラム TE Buffer RNase ・クロロホルム(Wako, code:038-02606) ・エタノール(99.5) (Wako, code:057-00456) ＜PCR関係＞・SSRプライマーセット（ABI Prism社）表1 に記した msHm-1~8の 8 種類のマーカーを増幅するプライマーセットを使用する。蛍光プライマーの合成には、必ずABI Prism社受託合成サービスのDNAフラグメント解析用カスタム蛍光プライマーを利用する。フォワードプライマーの5’端にVICで蛍光ラベルしたものを用いる。リバースプライマーは、ノンラベルとし、オプションでテイル配列を付ける。 ※ABI Prism社のテイル配列は非公開となっているため、本マニュアル通り表1. ブナシメジ品種識別に用いる8種類のSSRマーカーの特徴 Forward Reverse

msHm-1 59 CGAGTGTTTCTCATCGCTGT GCTGATGATGCTCGTTGATG + Tailed option 132 msHm-2 59 AAGCTGCGAGAATTCCACTC ACCGTCCGTGAGAATACGAG + Tailed option 77 msHm-3 59 GAGGTGTGCGTTCTCGTTCT GCACCAGTACCTACGCCAAC + Tailed option 139 msHm-4 59 ACCCGGAAATAGAACGAGAG CAACCTCTGTTCAACCACCTC + Tailed option 150 msHm-5 59 CAGAAGGCTGTCCTCACACA GAGCCGATCAAGAACCGATA + Tailed option 256 msHm-6 59 CCGTTGTGGGTTAGGTCAAA TAGTATGTGTAGGCGACAAAGG + Tailed option 126 msHm-7 59 GGAAGAGAGGGAGGCAAAAA GTCGACGGTTATTTCGAACG + Tailed option 131 msHm-8 59 ATCACGCATATACGCACCC CACCTCTCGCAGGTATGGAC + Tailed option 242

SSR マーカーアニーリング温度(℃) プライマー配列 (5'-3') ターゲットサイズ (bp)

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の結果を出すために、蛍光プライマーの合成はABI Prism社で行うこととする。

・AmpliTaq Gold 360 Master Mix（アプライドバイオシステムズ社）＜電気泳動関係＞

・ゲルローディング溶液（シグマアルドリッチジャパン社）

・DNAマーカー 100bp DNA Ladder One（ナカライテスク社）

・TBE バッファー（10x）（Tris-Borate-EDTA buffer 10x）（シグマアルドリッチジャパン社）

・Agarose 900 （株式会社同仁化学研究所）

・エチジウムブロマイド溶液（滅菌超純水に0.5-1.0µg/mlの濃度でエチジウムブ

ロマイドを加えた溶液）

＜フラグメント解析関係＞

・Genetic Analyzer Buffer with EDTA（アプライドバイオシステムズ社）

・Hi-Di Formamide（アプライドバイオシステムズ社）・3130 POP-7ポリマー（アプライドバイオシステムズ社）・3100/3130xl 50cm Capillary Array ( 61cm×50µm、アプライドバイオシステムズ社) ・GeneScan 600LIZ サイズスタンダード（アプライドバイオシステムズ社）４．４調製試薬・SSRプライマー溶液 8 組の蛍光ラベルされたフォワードプライマーとリバースプライマーのペアを、それぞれ 10pmol/µL の濃度になるように滅菌超純水に溶解した溶液を、8マーカーそれぞれに対応して用意する。・Wash-Ⅱ 使用前に99.5％エタノールを80ml加え、ストック溶液として保存する。・TBE バッファー（10x）使用時に、超純水で10倍希釈したものを以後使用するTBEバッファーとして用いる。・70％エタノール（DNA抽出用） 99.5％エタノールを滅菌超純水希釈して70％エタノールを調製する。４．５機器・プログラム・フリーザー（－20℃以下）・凍結乾燥機（EYELA FDU-1100）・ボルテックスミキサー・高速冷却遠心機（1.5-2 mlチューブが利用可能なもの）

・分光光度計（Thermo Scientific社 Multiskan GO)

・ PCR Thermal cycler (BIO-RAD社 C1000 Thermal Cycler)

・電気泳動装置（アドバンス社、Mupidなど）

・紫外線照射装置

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・電子天秤

・オートクレーブ

・超純水製造装置

・恒温機（ヤマト科学株式会社 DG400）

・ Applied Biosysytems 3130 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ社）

もしくはこれに準じる蛍光DNAシーケンサー

・ Gene Mapper ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）

※フリーソフトであるPeak Scanner software でもサイジングが可能

４．６実験操作４．６．１操作準備作業 DNA実験操作は、実験開始前に実験台上を70％エタノールで消毒する。また、無菌作業が必要なときはクリーンベンチを使用する。実験操作時は、白衣、上履きを着用し、各操作に応じてゴム手袋、眼鏡、マスクを着用する。４．６．２操作場所 DNA抽出からPCR 増幅、DNAシーケンサー分析まで、供試サンプル以外のDNAが混入しないクリーンな環境で操作する。４．６．３試薬および器具・上記の購入試薬、調製試薬・滅菌超純水・ポテトブドウ糖寒天培地（分包：造粒タイプ）（関東化学株式会社）・ラップ・アルミホイル・輪ゴム・新聞紙・ 9cm滅菌シャーレ・スパーテル・白金耳・メス・ピンセット・ステンビーカー(容量1000ml) ・ソコレックスSH 容量5ml(連続式自動分注器)（アズワン株式会社）・ 1.5 mlチューブ・ 2 mlチューブ・パラフィンフィルム・ホモジナイゼーション用ペッスル（フナコシ社）・マイクロピペット各種容量・マイクロピペット用チップ・ 96穴PCRプレートまたは8連PCRチューブ（アプライドバイオシステム

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ズ社）・ PCR用96穴シーリングマット・ 96穴プレートセプター純水は電気伝導率0.0056 mS/m （25 ℃）以下になるように脱イオン化されたものをさらに精製した超純水を用いる。滅菌水は超純水を 120℃、20 分間オートクレーブで処理したものを用いる。特別の指定がある試薬はそれに従い、その他についてはJIS特級試薬（あるいは同等のグレード）を用いること。チップやチューブ類は、滅菌済みのものを用い、必ず使い捨てとする。マイクロピペットのチップ類、その他ピペット類及び1.5 mlと 2.0 ml等のチューブは、オートクレーブ滅菌(120℃、20分)し、その後、60℃に設定した恒温器に入れ、完全に乾燥してから用いる。４．６．４試験材料の取り出しサンプルの取り出し・取り扱い時には、サンプル間で相互に混入しないように、サンプル毎に作業台や電子天秤等の清掃を十分に行うとともに、マスクを着用し唾液などの飛散を防ぎながら操作に細心の注意をはらう。子実体を検査試料対象とする場合（図2参照）、汚れていない子実体の内側を使用するため、傘部分と柄の部分を切り分け、柄の部分の外皮を削ぐように切り落とし内側を露出させる。それをメスとピンセットを用いて5mm角程度の大きさに切り分けて2mlのチューブに8粒程度入れ、-20℃以下のフリーザーで凍結させ、DNA 抽出直前に凍結乾燥し、４．６．５の DNA 抽出操作に用いる。図 2 および後述の図 3 では手袋を未着用であるが、サンプルに素手で触れてしまう危険のある場合は手袋を着用することでコンタミのリスクを軽減させることができる。

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図 2-1 子実体ブナシメジ図 2-2 子実体の外側部分を削ぐ赤丸の部分を使用する図 2-3 5mm 角に試料を裁断する図 2-4 2ml チューブに試料を入れ完成菌糸体を検査試料対象とする場合、まず、ポテトデキストロース（PDA）平板培地を 9cm シャーレに作製する。ポテトブドウ糖寒天培地分包１袋をステンレスビーカーに開け、超純水 400ml 加えてよく混和する。ラップをし、アルミホイルで蓋をして輪ゴムでとめる。ソコレックスSHをアルミホイルで包み、さらに新聞紙で全体を包み輪ゴムでとめる。ポテトブドウ糖寒天培地とソコレックスSHをオートクレーブで121℃、15分間高圧蒸気滅菌をする。培地が 60℃まで冷めたらクリーンベンチ内で、ソコレックス SH を用いて、ポテトブドウ糖寒天培地を 9cm滅菌シャーレに 16ml ずつ分注する。25 枚ほど作製できる。培地が固まるまで 1 時間ほどクリーンベンチ内で静置する。作製したPDA平板培地 4枚(予備1 枚含む)の中央部付近に、クリーンベンチ内で菌糸体または子実体の小片を接種し、25℃、2週間培養後、気中菌糸を集菌する（0.1g-0.5gで可、0.3gが適量）。集菌方法は図3参照。まず、スパーテルを用いて菌糸を集める。このとき、寒天培地を削り取らないように注意する。次に、集めた菌糸を2mlチューブに入れる。2mlチューブ１本にPDA平板培地 3 枚分の気中菌糸を集菌し、-20℃以下のフリーザーで凍結させ、DNA 抽出直前に凍結乾燥し、４．６．５のDNA抽出操作に用いる。

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図 3-1 スパーテルを用いて菌糸を集める図 3-2 全体から集菌しまとめる図 3-3 集めた菌糸を 2ml チューブに入れる図 3-4 1 本につき 3 片ほど入れて完成いずれの場合も、DNA抽出の際には、凍結乾燥機からサンプルを出して、できる限り短時間(15分以内)に扱うことが重要である。室温で長時間放置すると吸湿し、糖質がでてくるため、粉砕が困難になる。なお、凍結サンプルを保存したい場合は-20℃以上のフリーザーで、2ml チューブにパラフィンフィルムをまいて保存するようにする。４．６．５ DNA抽出操作

基本操作は、Geno Technology社のPlant Geno-DNA-Template TM のプロトコルに従っている。なお、抽出工程が多く 2 時間程度要するため、マスクおよびゴム手袋を着用し、クロロホルム使用時には眼鏡を使用することで安全を確保するとともにコンタミのリスクを軽減できる。 1. 4.6.4 で 2ml チューブに作製した凍結サンプルを凍結乾燥し、ホモジナイゼーション用ペッスルを用いてそのサンプルを粉状になるまで丁寧に粉砕する。

2. 300µlのTemplate Extraction Bufferを添加し、ホモジナイゼーションペッスルでさらにサンプルをすりつぶした後 300µl の Template Extraction

Bufferを加えて合計600 µlとし、室温で20分間放置する。

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4. 冷却遠心機で、15,000ｘg、15 分間、室温で遠心する。（この遠心中に、恒温機を60℃に設定し、その中にTE bufferを入れて温めておく） 5. 4の遠心分離で得られた上清（クロロホルムの下層、菌糸体の凝集物である中間層、Buffer に DNAが溶出している液の上層のうちの上層のこと）を、新しい 1.5ml チューブに回収し、等量(約 600µl)の 70％エタノールを添加する。上清を回収する際、上清と沈殿したクロロホルムを混合しないために、中間層にある粉砕した子実体または菌糸体の凝集物に触れないよう静かに上清を吸い取るようにする。また、70％エタノールを添加する際、上清との境界を乱さないよう、チューブ壁を伝わらせて静かに重層する。ここで70%エタノールを上清と混合してしまうとDNAの収率が著しく低下してしまうため、細心の注意を払う。 6. 40µlのpink RESINを添加後、数回反転させて混合し、室温で5分間放置(ときどき混合して懸濁状態を保つ)。なお、pink RESINは使用前にボルテックスまたはピペッティングを激しく行い、溶液を均一な状態にすること。また、pink RESINは顆粒状の物質を多く含んでいるため、ピペットチップの先端をはさみで斜めに切り、孔を大きくすることで先端での顆粒の詰りを防ぐことができる。 7. 12,000xg、5 分間、室温で遠心し、デカンテーションして上清を除去する。 8. チューブをタッピングして沈殿をほぐし(ボルテックスミキサーを用いてはならない)沈殿がほぐれたことを確認してから、500µlのWash-Ⅰを添加してpink RESINをタッピングでさらに懸濁する。 9. 12,000xg、5分間、室温で遠心し、上清を除去する。 10. 新しい1.5mlチューブにスピンカラムをセットし、そこに500µlの調製済みの Wash-Ⅱに再懸濁（※8 と同様の操作を行い、沈殿がしっかりほぐれるまで懸濁すること）したpink RESINを添加する。 11. 10,000xg、2 分間室温で遠心し、溶出された洗液を除去し、調製済みの Wash-Ⅱで同様に、さらに 2 回遠心洗浄する。この洗浄の際にスピンカラム内でメンブレンにピペットの先が触れないようにピペッティング操作を行い、しっかりとペレットを洗うことにより抽出されるDNAの品質が向上する。また、2回目の遠心はカラムから洗液を完全に除去するよう、10分間行う。 12. スピンカラムを新しい 1.5ml チューブに移し、1µl の RNase と 50µl の TE Buffer (50~60℃)を添加して、ピペットチップを用いてRESINを懸濁し、室温で10分間静置する。 13. 3,600xg、10分間、室温で遠心し、DNA溶出液を得る。DNA溶液は4˚C 保存する。長期保存の場合は－20℃保存し、凍結融解を繰り返さないように注意する。

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４．６．６ DNAの定量抽出したDNAの定量方法には、アガロースなどの電気泳動による分析や分光光度計による分析がある。本マニュアルでは、分光光度計による定量を行う。本分析については通常の分子生物実験でのDNA濃度測定法に準じたものであればよい。なお、石英セルを使用する場合、セルを直接素手で触れて光路面を汚さないためにゴム手袋を着用する。 1. 5µlのサンプルDNAに995µlの滅菌超純水を添加し、DNA溶液を1/200 に希釈する。 2. 260nmと280nmの吸光度を測定する(図4参照)。 260nm/280nm の値の比が 1.8-2.0 になることを確認する(トラブルシューティング参照)。 DNA濃度計算は吸光度 1 の時の濃度が50µg/ml であるので、 DNA 濃度（µg/ml）＝260nmの吸光度×50 ×200で計算できる。 3. SSR分析用に、100ng/µl (50-100ng/µl ) の調製DNA溶液を、滅菌超純水を溶媒として作成する。 4. 元のDNA溶液は-20℃以下で凍結保存し、調製DNA溶液がなくなるまたは調製DNA溶液を作成してから1ヶ月程度経過した際に再度融解し、調製DNA溶液を作成するようにする。なお、凍結・融解を繰り返して使用するのはこの調製DNA溶液とする。図 4 分光光度計を用いた DNA の波長このような山成の形状になり、２６０ｎｍ付近にピークがくる形が望ましいなお、NanoDrop などの微量サンプル測定機器による DNA 吸光度の測定でも同様の結果が得られればサンプルを使用してよい。４．６．７ PCR増幅操作 PCR増幅操作は以下の通りである。なお、PCR実験では、微量の鋳型DNA であっても増幅されるので、目的以外のDNAの混入を防ぐとともに、試料の酵素的分解を防ぐため、人間の皮膚表面から分泌されているDNase の混

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入を防止しなければならない。コンタミネーション防止のため、実験の際はマスクと手袋を必ず着用する。また、PCR 反応液の調製はすべて氷上で行う。１．PCR反応液の調製（１サンプル分）サンプルDNA溶液（20 ng/µl） 1.0 µl 調整済みSSRプライマー溶液 1.0 µl

AmpliTaq Gold 360 Master Mix 10.0 µl

滅菌超純水 8.0 µl 合計 20.0 µl なお、SSRマーカー毎の組成の誤差を防ぐために、例えば30品種測定する場合、30 サンプル分＋ロス分を見込んだ量(31 サンプル分)の、サンプルDNA溶液を除く試薬の混合液を予め作成し、チューブに１反応分ずつの液量を分注してから、各々のチューブにサンプルDNA溶液を加えるようにする。２．PCRシステムを用いて、以下のプログラムでPCR反応を行う。 ※不必要な PCR 産物の増幅を最小限に抑えるため、ステップダウン PCR法を用いて行う。これによりフラグメント解析が容易になる。・95℃10分間熱変性。・95℃30秒間、62℃30秒間、72℃15秒間の反応を、5サイクル。・95℃30秒間、60℃30秒間、72℃15秒間の反応を、5サイクル。・95℃30秒間、58℃30秒間、72℃15秒間の反応を、35サイクル。・72℃7分間の反応後、4℃で∞。３．反応終了後にサンプルを保存する場合は、プライマーの蛍光標識を失活させないようにするためアルミホイルで遮光し、-20℃で保存する。４．６．８ PCR産物の増幅確認試験４．６．７で作成したPCR 産物の増幅を確認するため、アガロースゲル電気泳動を行う。増幅が確認された場合は４．６．９へ、増幅がみられなかった場合にはトラブルシューティングを参照し、再度４．６．７のPCR 増幅操作を行い、産物を得るようにする。なお、得られた産物は今後の試験に使用する可能性が高いため、コンタミを防ぐためにマスクとゴム手袋を必ず着用する。１．泳動用アガロースゲルと泳動用バッファーの作成 TBEバッファーを、電気泳動装置に入れ、また 200ml 程度の三角フラスコにTBEバッファー70mlとAgarose 900を1.05g加えて濃度が1.5％のゲルを作成する。フラスコにラップをかけて電子レンジで溶解させる。このとき、突沸が起きないように 500W を数十秒単位でかけながら内部を確認する。一度

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かけたら、アガロースを融解させるようにゆっくりとフラスコを回すように混ぜる。内部にアガロースの粒が見えなくなったら、ゲル板に溶液を流し込んで固まるまで静置する。２．サンプルの泳動ゲルが作成できたら、電気泳動装置に入れてゲルが浸ることを確認してからアプライを行う。サンプルの一部（5 µl）を未使用のPCRチューブまたは8 連チューブに移し、そこにゲルローディング溶液を1µl 加えて計 6µl とする。一番左に100bpのラダーマーカーを5µlアプライし、その他のサンプルも順次アプライする。アプライが完了したら、100V25 分または125V20 分で泳動を行う。この条件に関してだが、バンドがしっかり分離でき、産物の有無が確認できればよいので電圧と時間は適宜変更してもかまわない。３．ゲルの染色泳動が完了したら、300mlの純水にエチヂウムブロマイド溶液を3~5µl混合したゲル染色液を作成し、その中に泳動したゲルを浸して20～30分ほど浸透し、染色する。染色後、手袋をした手でゲルを紫外線照射装置にのせ、254nm や 366nm などの紫外線を照射する。図5-1 のようにバンドが確認されたらそのサンプルを４．６．９のフラグメント解析に用いる。図５－１ msHm-1 の電気泳動図 30 菌株すべてで増幅がみられるこのようにマニュアル記載のバンドを確認することで次のフラグメント解析をスムーズに行うことができる

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図５－２ msHm-1 の電気泳動図 2 か所で増幅がみられない

この場合トラブルシューティングを参照し、すべての菌株でバンドが見える様に再度 PCR を行う。

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４．６．９ SSRマーカーの検出方法前項で得たSSRマーカーによるPCR産物をDNAシーケンサーで分析し、フラグメント解析を行う。基本的分析操作は、アプライドバイオシステムズ社のフラグメント解析のプロトコルに従って行う。１．前項で得たPCR産物を、滅菌超純水で100倍から500倍に希釈する。希釈倍率は、PCR増幅を考慮し、フラグメント解析に適した倍率で行う。（トラブルシューティング参照）２．1.0µlの希釈PCR産物、0.2µl の600LIZサイズスタンダード、10 µl の Hi-Diホルムアミドを、96 穴PCR プレートに入れ混合し、シーリングマットで蓋をする。３．PCRシステムなどを用いて、95℃3分間熱変性を行った後、直ちに氷上で 5 分間以上静置する。※サーマルサイクラーのプログラムを使用し、 95度3分間の反応後、4℃で∞とすることで同様の反応として扱うことができる。

４．Applied Biosysytems 3130 Genetic Analyzerのプロトコルに従い、50cmキャピラリー、POP-7ポリマー、専用のバッファー（Genetic Analyzer Buffer

with EDTA）を用いて、分析を行う。５．Gene Mapperソフトウエアを用いて、結果の解析を行う。４．６．１０データ解析、判定表2にホクト白1号菌の8 SSRマーカーの遺伝子型(フラグメント長)を示した。フラグメント長は600LIZサイズスタンダードに対しての相対値を表している。また、スラッシュ区切りで 2 つの数字が並んでいるものは、同一プライマーセットで 2 本の鎖長の異なるフラグメントが増幅することをあらわしている。付属文書２に、全8種類のSSRマーカーでの既存栽培品種の10品種（ホクト白1号菌、MH025014、MH025016、MH025019、MH025022、MH025066、 MH025091、MH025146、MH025217、MH025374）、野生品種である 10 品種（MH025038、MH025045、MH025046、MH025054、MH025070、MH025092、 MH025097、MH025121、MH025160、MH025339）、そして市販されている10 品種（MH025012、MH025064、MH025286、MH025288、MH025362、MH025369、 MH025397、MH025462、MH025463、MH025528）の計30品種の 8 SSR マーカーの遺伝子型を示した。この計30品種を8SSR マーカーで識別を行ったところ、すべての品種を区別することが可能であった。表2.ホクト白1号菌の8SSRマーカーの遺伝子型（フラグメント長） SSRマーカーの開発時に、プライマー対のTm値、プライマーダイマーやヘアピン構造を考慮して、プライマーを作成している。50℃～63℃までアニー msHm-1 msHm-2 msHm-3 msHm-4 msHm-5 msHm-6 msHm-7 msHm-8 ホクト白1号菌 133 67/79 145 155 269 130 132 243 SSRマーカー

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リング温度を検討して、至適アニーリング温度の決定を行い、波形を安定させるためのテイル配列をプライマーに付加している。以下、データ解析、判定に際しての注意点を記す。１．まず、全ての蛍光色素を表示して波形を確認する。次にVICの蛍光色素である緑色のピークのみを表示して解析を行う。これにより、PCR増幅産物の希釈濃度が濃すぎることによって生じるフラグメントの乱れをチェックすることが可能である。サンプル濃度が濃いと、本来フラグメントのピークとして検出されるはずのない色が検出されることがあり、ターゲットのフラグメントの正しい値を表していないことがある。その場合は、原則として高い値を示している上位二本のピークを選びこれを遺伝子型とする。２．PCR増幅産物はサイズスタンダードのピークと比較して適正な希釈濃度にする。PCR増幅産物の希釈濃度が低い場合、サイズスタンダードのピークと比較して、サンプルのピークが低くなる。最も高いフラグメントのピークがサイズスタンダードの 1/3 以下の場合は別の低いフラグメントのピークを見落とす危険があるため、注意が必要である。明確に判断できない場合は、希釈倍率を２倍～４倍程度低くして、濃度のより高い希釈液を作製し直し、再度分析を行う。また、希釈濃度が濃すぎるとピークの大きさが検出限界を超えてしまい、ピークの先端が表示されない（波形の相対値が10000を超えている）。この場合、フラグメントのサイズデータが正しく表示されないため、PCR産物の希釈倍率をさらに5～20倍希釈してピークが上限を超えないように調製する。（図6-1）３．サイズスタンダードの波形を確認する。フラグメント解析におけるピークの数値は、サイズスタンダードのピークサイズをもとに作成した検量線によって計算されるため、サイズスタンダードの波形が乱れていると、正しいデータが計算できず、結果が表示されない。よってサイズスタンダードの波形が乱れていた場合は分析を４．６．９の２からやり直す。図 6-1 フラグメント解析結果の例① ピークが 2 箇所のみに表示されており、そのピークの値も上限を超えていない。ＯＳ，ＳＱという表示が緑印になっている。サイズスタンダードの波形、サンプルの波形がともに安定しているということであるため、信頼性の高いデータといえる。

(20)

図 6-2 フラグメント解析結果の例② ピークが 2 箇所のみに表示されているが、ピークの値が 10000 程度の高い値になってしまっており、ピークが高すぎるためにサンプルの波形に信頼性がないということで黄色い三角印（OS）が表示されてしまう。図のように単一のバンドしか検出されない場合はアリルを決定することが可能であるが、複数（2 本）のバンドが出現してしまった際に、それが非特異的なものか判断するのが非常に難しくなるため、そのような波形は望ましくない。複数のピークが出てしまって判断できないときは希釈倍率を変更して再度フラグメント解析を行う。図 6-3 フラグメント解析結果の例③ 解析を行ったが波形がみられない状態。この場合 SQ に赤い丸が表示され、上図のような画面が表示される。要因の一つとしては、サイズスタンダードとサンプルの濃度が濃すぎたために泳動がうまくいかなかったことが考えられる。サイズスタンダード、サンプルともにピーク値が 100 程度あれば検出可能であるため、なるべく低濃度に調製して再度泳動を試みることによって改善される可能性が高い。

(21)

４．６．１１実験操作フロー図

サンプル採取ブナシメジ子実体もしくは菌糸体

DNA抽出 Plant Geno-DNA-Template

TM キットを用いる方法または、同等の濃度及び純度のDNA が抽出できる方法 DNA濃度測定 (分光光度計) DNA量の確認、DNAの質の確認(吸光度260nm/280nm比)、 DNA溶液（20ng/µl）の調製 PCR増幅 PCR反応液 ※４．６．７参照 PCR産物の増幅を電気泳動で確認産物ありの場合は次のステップへ産物がない場合は再度PCR反応を行うフラグメント解析希釈PCR産物＋サイズスタンダード＋Hi-Di Formamide DNAシ－ケンサー分析 GeneMapperソフトウエアによる解析、遺伝子型決定違うパターン同じパターンホクト白1号菌と同一品種ではない（解析終了）ホクト白1号菌と同一品種の可能性あり栽培試験等のさらなる詳細な解析が必要

(22)

５．トラブルシューティング問題点対応１．反復実験で同じ結果が得られない鋳型とするDNA（テンプレートDNA ）とプライマーがすべての試験で同一の場合、PCR で増幅される産物は原則として同一のものが得られるはずである。従って、反復実験で同じ結果が得られない原因としては ① テンプレート DNAが純粋なものではない②フラグメント解析での希釈率が適正でないため波形が安定しない、の２つがあげられる（ ② に関しては後述のトラブルシューティングを参照）。よって、同一の結果が得られなかった場合は1)のDNA抽出までさかのぼり、実験を再度行う必要がある。２．抽出DNAの260nmと280nmの吸光度の 260nm/280nm 比が 1.8-2.0 にならない分光光度計を用いて抽出したDNAの純度を測定した際、図4のような波形にならなかった場合、まず260nmの部分にピークがあるかどうかを確認する。ピークがあった場合、そのまま次の行程に進み、PCR産物が増幅されたらそのままテンプレートDNAとして用いてよい。増えなかった場合はトラブルシューティング「SSR-PCR反応で増幅がうまくいかない」を参照。ピークがなかった場合は、再度DNA抽出を行う。その際、試料をより細かくホモジナイズすること、上清を取るときに下層と混じり合わないことなどを注意すると改善される可能性がある。

(23)

３．PCR反応で増幅がうまくいかない (産物が得られない、非特異的なバンドが多数出現する等) 抽出DNAの質や夾雑物の混在に問題がある場合(抽出 DNAの260nmと280nm の吸光度の260nm/280nm比が1.8-2.0にならない場合)、テンプレート DNA を滅菌超純水で5-10 倍希釈することで、増幅が向上する場合がある。希釈しても増幅が見られないときは、再度DNA 抽出を行う。 PCR機の温度制御は、メーカー／機種によって異なるため、PCR Thermal cycler は BIO-RAD 社 C1000 Thermal

cyclerを推奨機器としている。異なるメーカー／機種を用いて、SSR-PCR 反応の増幅が悪い場合、アニーリング温度を2-5℃下げる。一方、非特異的なバンドが多数出る場合(図 5-2)には、アニーリング温度を2-5℃上げる。４．フラグメント解析の際に波形がみられない蛍光標識をつけた PCR 産物は光に弱く、遮光保存を行わないと失活してしまう。PCR 産物を作成し、それらを保存しておいてから後日フラグメント解析を行った際に波形がみられなかった場合、PCR 産物が失活している可能性が高いため、再度PCRからやり直す。図6より、SQが赤丸で表示されて波形がみられない場合は、全体の濃度を1/5 ～1/10 程度に希釈して再度泳動を試みる。６．是正処置本マニュアルの使用者からの情報収集として、改善依頼票を設けて情報交換を行い、必要に応じてマニュアル等の是正措置を行う。付属文書：１．ブナシメジ品種識別に用いる8種類のSSRマーカーの詳細２．8種類のSSRマーカーによる30品種のフラグメント長３．参考文献別添資料：農林水産省品種登録ホームページより「植物品種識別における品種同定理論」

(24)

付属文書1．ブナシメジ品種識別に用いる8種類のSSRマーカーの詳細 ※注付属文書１は、Roche GS-FLX の結果を基に作成した参考データである。実際は、配列をアセンブルする際にVariantが複数箇所に存在するので本来の配列とは数塩基程度異なる場合がある。そのため、プライマー１とプライマー２で挟み込まれている塩基数と本文中で表記されているフラグメント鎖長には差が生じているが、本文のフラグメント鎖長を基準とする。 SSR マーカー名：msHm-1 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：CGAGTGTTTCTCATCGCTGT＜青字＞プライマー２**：GCTGATGATGCTCGTTGATG＜青字＞反復モチーフ：(ACCAGC)6＜赤字＞塩基配列**：

AATTGTCCAA CTGTCTCTAT AAACAATTGT CCAACTGTCT CTATAAACTC

GTGCGTAAGG ATCGTGCTTA TAATTGAACG TTTATCCTGA CATCTAGCCA

GCTTCCCGCA ACCGATCCCT CCAAAAACAT TTGTACCAGG ATGGGCCTTT

CTGGATGTGA AGGTAGCGTA TG

CTGGATGTGA AGGTAGCGTA TGCTTCGCTC CCACTGCGAC AAGTCTCATG

CTTCGCTC CCACTGCGAC AAGTCTCATG

ACTTTGTCCA GGCGAATGAC ATGTTTGAGC AGGCGAATGC TAAACAGAAC

GCAAGTAAGT ATTGACATCT GTACATTT

CG AGTGTTTCTC ATCGCTGT

AT

CTGAAGATAT AACCGAGTCG ACGGCTGCCC CTTCCCCCAC CAAGACCGAC

ACCAGCACCA GCACCAGCAC CAGCACCAGC ACCAGC

ATCA

CATCAACGAG

CATCA

CATCATCAGC

TCAGC

GCCACCACAT CCACGACGTT TCTTGCGAGC AGTCCATCAT

CACCTGTTAC TACAGCCGAT TCCGCCTCCA CTAGCGAGAC AGCGGCGGCG

TCTCTGGAGT CACATGCGAA CGCGGTTGTC GGGGGGATTG TTGGTGGTGC

AATGGGCCTC ACTCTTATCC TGGGCTTTGC ATACTGGTAC ATCAGTCGAC

*プライマー１はVICの蛍光修飾を行った。

(25)

SSR マーカー名：msHm-2 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：AAGCTGCGAGAATTCCACTC＜青字＞プライマー２**：ACCGTCCGTGAGAATACGAG＜青字＞反復モチーフ：(ACCT)8＜赤字＞塩基配列**：

AAGAAGGCGC GCAACCCTCA CAGTCAGAAC AAGCATCCAT GTTTCCTTCG

TCCAGCAAGA AGGCGCGCAA CCCTCACAGT CAGAACAAGC ATCCAT

TCCAGCAAGA AGGCGCGCAA CCCTCACAGT CAGAACAAGC ATCCATGTTT

GTTT

CCTTCGTCCA TATTGTTCAA GTATATGAAT CTGTCGTGCA TAGGCCTCGC

TACAGCT

AAG CTGCGAGAAT TCCACT

T

AC CTACCTACCT ACCTACCTAC

CTACCTACCT

ACCAC

TCGTA TTCTCACGGA CGGT

GACTTC CACCATGGTC

ATTGCAACTA ATGGGGGCCT GAAATAAAGT GTTCAAGTTA AAAGAGGCGG

TCAACGAACT GATCCGATCA CTGATCGTGA

CGTCGACGCC TTAAATCTAA

ATCACGTGCT CTCCAAAATT TCGATCGACA GTCCACAGCA GTCCACCCTT

(26)

SSR マーカー名：msHm-3 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：GAGGTGTGCGTTCTCGTTCT＜青字＞プライマー２**：GCACCAGTACCTACGCCAAC＜青字＞反復モチーフ：(GCTGGT)6＜赤字＞塩基配列**：

TTGCAGTGGA TCAACGGGTT CATCTTTCAC GATAGTAACG GGAGGTGGAG

GTGTAGGTGC AGAGGGAGGC ACGGGTTTCG TTTGTCGAGC TT

GAGGTGTG

CGTTCTCGTT CT

GGTTCTTG TCGTTCCGCC TCGGCGGGTT GGGGAGGAGC

AGCCCTCTTA GGGCCACTGG GTGGT

GCTGG TGCTGGTGCT GGTGCTGGTG

CTGGTGCTGG T

GTTGGCGT

GTTGGCGTA GGTACTGGTG C

A GGTACTGGTG C

TGGTGTGGG TGTGGGTGCG

GATATTCCAA GACCGCGACT TTCACGGAAT GCCTGCACCA GACCAATCAA

CGTCGGTTCA CTGAAGGCCT CGAGATTCGC GACGATGAGT TCCGTAATGA

(27)

SSR マーカー名：msHm-4 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：ACCCGGAAATAGAACGAGAG＜青字＞プライマー２**：CAACCTCTGTTCAACCACCTC＜青字＞反復モチーフ：(GACTCG)5＜赤字＞塩基配列**：

GACTTGTTCC AGACGTTGAC CCAGCTGTGA TTTGGGTAAC TGTTTCAACG

ATCACGTTGG TGTTTG

ACCC GGAAATAGAA CGAGAG

GGAG AG

GGAG AGGGTGATGG

GGAG AG

GGTGATGG

TGATGGTGAT

TGATGGTGAT GGAGTAGGAG AATTGATACT GGGCGGGGCC GCTGGTCGCG

GGAGTAGGAG AATTGATACT GGGCGGGGCC GCTGGTCGCG

TCGTCTC

TCGTCTCCGG ACTCA

CGG ACTCA

GACTC GGACTCGGAC TCGGACTCGG ACTCG

G

GAGGT

G

AGGT

GGTTGAACAG AGGTTG

AGGA CTGTGATGTT TGAGGATCTA TGAGGCAATA

GCCACAGCCG A

GCCACAGCCG ACAAAAAAAA AAAAAAAGGG G

CAAAAAAAA AAAAAAAGGG G

CAAAAAAAA AAAAAAAGGG GAAACGAAAA GAAAATACAG

AAACGAAAA GAAAATACAG

AAGGTGCGTT AGAATGAGCG GGGAGACACT GAAGTACCTA AAGCGACCTC

GAAATAGTCC CGAATTCTTG GCGAGAACCA GAAATTGTTG

CCGTC

(28)

SSR マーカー名：msHm-5 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：CAGAAGGCTGTCCTCACACA＜青字＞プライマー２**：GAGCCGATCAAGAACCGATA＜青字＞反復モチーフ：(GATA)5＜赤字＞塩基配列**：

AGACTGCGGT CACATTT

CAG AAG

CAG AAGGCTGTCC TCACACA

GCTGTCC TCACACA

ACC

CCTTTAAATT

CT

CTGCGTGGGA TT

GCGTGGGA TT

GCGTGGGA TTGAAAAAT

GAAAAAT

GAAAAATT TCGACATTAC TGTATTATTC TTCCTTTGCT

GAAAAAT

T TCGACATTAC TGTATTATTC TTCCTTTGCT

ACCAATTGTG TTGCTTGCTT TGATATGCAT CTTACGAGTG ATTTAGCTAT

CCGCA

CCGCATTTTT

TTTTT

AGTGTTCGAA ATAAACAGCC TGAGCAAATA TGAATCGTGT

GATAGATAGA TAGATAGATA

TTTTTTTGTG

AAGTGCAATA TCATGTTTTC

CGTAAGTACA

TATCGGTTCT TGATCGGCTC

CAGAC

CAGACTAGTA TCCGAAGCCT

TAGTA TCCGAAGCCT

GCGTAGGTTC AAGCAGAGTA AGTATCTACC GCATCACATC AATCCAATCA

CATTCCTCCT GCGGGCTCGT CCTGCGTGTC CTTCGCAAAA CTTGACCTTT

(29)

SSR マーカー名：msHm-6 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：CCGTTGTGGGTTAGGTCAAA＜青字＞プライマー２**：TAGTATGTGTAGGCGACAAAGG＜青字＞反復モチーフ：(TGGA)5＜赤字＞塩基配列**：

CTGATATCGT TGTTTC

CTGATATCGT TGTTTCGTAT ATACCACGTC

GTAT ATACCACGTC

GTAT ATACCACGTC CTGACCTCCT GATTCTGATT

GTAT ATACCACGTC

CTGACCTCCT GATTCTGATT

GTAGTCAAAG TTGCACCAAG TATAGCGACT T

GTAGTCAAAG TTGCACCAAG TATAGCGACT TCTTTTTT

CTTTTTT

CTTTTTTCA CGTATGAGCT

CTTTTTT

CA CGTATGAGCT

TGTGAGTTTG TTCATC

TGTGAGTTTG TTCATCCTTT TTGC

CTTT TTGC

CTTT TTGCTTCCTT ATGTGGTGAT TGATGTG

CTTT TTGC

TTCCTT ATGTGGTGAT TGATGTG

CCG

TTGTGGGTTA GGTCAAA

GAC TTCC

GAC TTCCTTGTCC CGACATGATA CACAGACAAT

TTGTCC CGACATGATA CACAGACAAT

TGGATGGATG GATGGATGGA

T

TGTAGAACAG GATTCTTCTT

GTAGAACAG GATTCTTCTT

GTAGAACAG GATTCTTCTT TCTCTCTT

GTAGAACAG GATTCTTCTT

TCTCTCTT

TCTCTCTTGC

TCTCTCTT

GC

C

CCTTTGTCG CCTACACATA CTA

TTAT

TTATTAC ACACTAAGG

TTAT

TAC ACACTAAGG

TAC ACACTAAGGC CGAGCCCTCT

C CGAGCCCTCT

GCGCAGGGAT AACATATACT ATAGAACAGA TGAATGCCAA TGGACAGGTG

ACTGAATCGA TATCCGTATA GCATCAGGAA CGTTTGAGGC CATGTGCGTG

(30)

SSR マーカー名：msHm-7 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：GGAAGAGAGGGAGGCAAAAA＜青字＞プライマー２**：GTCGACGGTTATTTCGAACG＜青字＞反復モチーフ：(AAGG)13＜赤字＞塩基配列**：

GAGAATTGGA ATGGGAAAGG GAGGGGGAAG TGAGGCAGAA AAGAGGCGGA

CGGAGAATTG GAAT

CGGAGAATTG GAATGGGAAA GGGAGGGGGA AGTGAGGCAG AAAAGAGGCG

GGGAAA GGGAGGGGGA AGTGAGGCAG AAAAGAGGCG

GACGTGTGTT TCTGGTGAAC GGAGGCACGG G

GGAAGAGAG GGAGGCAAAA

A

AAGAGAGAG GGAGGGAGGG AGGG

AAGGAA GGAAGGAAGG AAGGAAGGAA

GGAAGGAAGG AAGGAAGGAA GGAAGG

AAGA AGGGACTACG TA

CGTTCGAA

ATAACCGTCG AC

CGTGCGAT ACGCTGCACG TTCGCTTTCA CGTTTTC

CGTGCGAT ACGCTGCACG TTCGCTTTCA CGTTTTCTTC

CGTGCGAT ACGCTGCACG TTCGCTTTCA CGTTTTC

TTC

GACGAGGGCG CGGAACGCCG CTACATCATG CAGATAGTGA GGATGTGGTA

TATGTCGGGG AAAAAAAAGA AGAGAGGTAT ACGGACGATC ATGCAAATCC

GGCAATTGCT CGCCCGCTTC CTTCGTGCCT GTCTCCCTTG TCCTCGTGTT

GAGCGTAGCC CTCTCCC

*プライマー１はVICの蛍光修飾を行った。 **プライマー2 には tail 配列を付加した。

(31)

SSR マーカー名：msHm-8 作成に用いた材料品種：ホクト白1号菌至適アニーリング温度：59℃ プライマー１*：ATCACGCATATACGCACCC＜青字＞プライマー２**：CACCTCTCGCAGGTATGGAC＜青字＞反復モチーフ：(AAAGA)8＜赤字＞塩基配列**：

GGTTGAGTGA

TGCAGAGGAA

GACGAAGAGG

CAGAAGTGGG

TGTAGAAGAA

GCAGAAGCCG

AAAACGAACG

AAGAGAAAAC

CCCGC

ATCAC

GCATATAC

GC

ACCCCGCAAC

TTCTTCGGGT

CCGTAGCGAG

CGTATGCATA

TATCTTCACG

TGCATAAAGT

TACATTCAGT

AAGGAAACCG

CAGATTTAAT

ATTACGCAGG

AAGT

AAAGAA

AAGAAAAGAA

AAGA

GAGAAA

ACGCACCGTT

GCAGAAAAGC

CACAGCCGTG

GGCTCGACGT

CCGCCATCTC

ATCCGCG

GTC

CATACCTGCG

AGAGGTG

CGG

TTCCGTTTCC

ACTGGATTCG

AG

AGGGATCTAC

GGATCTAC

CTCCACCTCC

ACGTCCACTG

GTGGGACTTT

AGGGACGGGG

AGCTTTCGCC

GGGGTAAGGA

*プライマー１はVICの蛍光修飾を行った。 **プライマー2 には tail 配列を付加した。

(32)

付属文書２．8種類のSSRマーカーによる30品種のフラグメント長 msHm-1 msHm-2 msHm-3 msHm-4 msHm-5 msHm-6 msHm-7 msHm-8 ホクト白1号菌 A B-12/B C D E F G H MH025014 A B-12/B+8 C-6/C D+6 E+21 F+4 G-40 H-23 MH025016 A-18/A B-12 C-18/C-6 D-6 E+12 F G H-23 MH025019 A B-12/B C-18/C D-6 E+15 F+8 G-40/G H-23 MH025022 A B-12 C-18/C-6 D+6 E+15 F/F+8 G-40/G H-23 MH025066 A-18/A B-12/B C-6 D E/E+15 F/F+4 G-40 H MH025091 A B-12/B C-18 D-6 E+15 F G-40/G H-23 MH025146 A B-12 C D-6 E/E+15 F+4 G H-36 MH025217 A-18/A B-12/B C D E/E+15 F G H MH025374 A-18/A B-12/B C D E F G-60 H MH025038 A-12 B-12 C-26/C-8 D+6 E+9/E+24 F+4 G-45 H-23 MH025045 A-18 B-12/B-8 C-12/C D/D+6 E+24 F G-35 H-28 MH025046 A-18/A-6 B-20/B-8 C-6 D-6 E+12 F+4 G-40 H-23/H MH025054 A-6 B-8 C-18 D E+9 F-4 G-40 H-23 MH025070 A-6/A+12 B-8 C-6 D-12 E+9 F G-40 H-36 MH025092 A-18 B-12/B-4 C D-6/D+6 E+15 F+4/F+8 G-45 H-23 MH025097 A-18 B-12 C-18/C-6 D+6 E-4/E F+4/F+18 G-55 H-34 MH025121 A-18/A-6 B-16 C-18 D+12 E-4/E+15 F G-60 H-20 MH025160 A-18/A-6 B-16/B-4 C-18 D+12 E+12 F-8 G-48 H+48 MH025339 A-18/A-12 B-12/B-8 C-12 D+18 E+15 F-4/F+4 G-40 H-23 MH025012 A-18/A B-12/B C-6 D E/E+15 F/F+4 G-40 H MH025064 A-18/A-12 B-12 C-18/C-6 D E-4/E F+4 G-60 H-36 MH025286 A B-12/B C-18/C-6 D E/E+24 F/F+4 G-60 H MH025288 A-12/A B-12 C-18 D-6 E-4/E+15 F+12 G-40 H-23 MH025362 A-18/A-12 B-12/B C-6 D+6 E F+4 G-60 H+4 MH025369 A-18/A-12 B-12/B-8 C-6 D+6 E/E+12 F+4 G-60 H-26/H+4 MH025397 A-18 B-16/B C D-6 E/E+15 F G-60/G H MH025462 A-12 B-12/B-8 C-18/C-6 D+6 E F/F+4 G-60 H-26 MH025463 A-12 B-8/B C-6 D E/E+24 F+4 G-60 H+4 MH025528 A B-12/B C-6 D E/E+15 F/F+4 G-40 H SSRマーカー SSRマーカー SSRマーカー SSRマーカーフラグメント長は 600LIZ サイズスタンダードに対しての相対値を表している。また、スラッシュ区切りで 2 つの数字が並んでいるものは、同一プライマーセットで 2 本の鎖長の異なるフラグメントが増幅することをあらわしている。

(33)

付属文書３．参考文献

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