二三酵素製剤のナリンギナーゼ活性

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(1)九州大学学術情報リポジトリ Kyushu University Institutional Repository. 二三酵素製剤のナリンギナーゼ活性 大村, 浩久 九州大学農学部. 石崎, 勝也 全国農業販売同組合連合会. 筬島, 豊 九州大学農学部. 山藤, 一雄 九州大学農学部. https://doi.org/10.15017/21615 出版情報:九州大學農學部學藝雜誌. 20 (2), pp.169-177, 1963-01. 九州大學農學部 バージョン: 権利関係:.

(2) 二 三 酵 素 製 剤 の ナ リン ギ ナ ー ゼ 活 性 大 村 浩 久 ・石 崎 勝 也*・筬島. On the naringinase H. Omura,. activity. 詰 等 へ の 利 用 は 従 来 著 し く制 限 さ れ て. いた.し か し この苦 味 質 の 本 体 が ナ リン ギ ン(ナ. リン. ゲ ニ ンー7一 ラ ム ノグ ル コ シ ド)で あ り そ の ア グ リコ ン で あ る ナ リンゲ ニ ンは苦 味 を 呈 しない こと は知 られ て い た.従 つ て若 し何 等 か の 方 法 で この 配糖 体 を 分 解 す れ ば 夏 ミカ ンの苦 味 は除 か れ そ の 利 用 の 途 が 大 き く開. and K. Yamafuji. 行 な つ た. a)ペ. クチ ナ ーゼ:市 販"三. この ナ リンギ ンが市 販 の ペ クチ ナ ー ゼ製. 共 ス ク ラーゼ"で. つ て1959年11月Sclerotinialibertianaか. あ. ら調 製 し. た 乾燥 製 品. b)ナ 年4月 c)ナ. リン ギ ナ ーゼ 標 品A:Asp,nigerか. ら1961. 調製 した試 作 品. リンギ ナ ー ゼ 標 品B:Asp.usamimut.shi‑. rousamiiか. か れ る ことが 期 待 され る. Ting11)は. of some enzyme preparations. K. Ishizaki. Y. Osajima. 我 が 国 で豊 富 に産 す る夏 ミカ ンは 苦 味物 質 を 含 む た め に果 汁,缶. 豊 ・山 藤 一・ 雄. ら1962年1月. 調製 した試 作 品.. 通 常」pH4の0.1MMcIlvaine緩. 衝 液 で 抽 出 し5. 剤 に含 まれ る酵 素 に よつ て 加 水分 解 され る こと を 認. 分 間6,000r.P.m.で. め,反 応 温度,最 適pH,温. を 酵 素 液 と した が場 合 によ つ て は水 で 抽 出 した.酵 素. 度耐 性 そ の他 酵 素 の一 般 性. 遠 心 分離 した褐 色 の透 明 な 上澄 液. 質 を 倹 討 し,更 に 同 じ くナ リンギ ンを 含 む た め苦 味 を. 濃 度 に つ い て は力 価 に応 じて適 宜 定 め たが,こ れ等 の. 呈 す る グ レー プ フル ー ツ 中 の ナ リン ギ ン除 去 を試 み て. 酵 素標 品 は いつ れ も多 量 の不 溶 物(濾 過 助 剤 等)を 含. そ の 可 能性 を示 した.一 方 野 村 氏6》も我 が 国 で市 販 さ. ん で い るの で,こ れ を含 め た酵 素 製 剤 の%濃 度 で表 わ. れ て い る ペ ク チナ ー ゼ標 品"三. した.. 共 ス ク ラー ゼ"中. に. も同 様 の 酵 素 が 存 在 す る こ とを 確 めた.し か し実 用 的. 基. に は 出来 るだ け強 い活 性 を持 つ 酵 素 標 品 を使 用 す る こ. 市 販 品(ハ. とが 望 ま しい.近 年 酵 素 製 造 化 学 の 顕 著 な発 展 に伴 い この 要 望 を満 す こ と も可能 に な り,特 に岸,2・3・4・5)中 林' 7)滝 口 ・10)等 の 諸氏 に よつ て そ れ ぞ れ そ の豊 富 な 経 験 に基 づ い て研 究 が 行 な わ れ た.こ. う して 強 力 な ナ リン. 質 タ製 薬)を 用 い た.水 に は50mg%で. も溶 け に くい の で50〜60℃. に温 めて 溶 解 した.. 反 応 条 件 一 般 に反 応 の最 適 温度 は40〜50℃. ,pH4.0〜4.5で. あ る と いわ れ て い るの で,本 実 験 で は 特 記 しな い限 り. ギ ナ ーゼ を 生 ず る菌 株 が検 索 分 離 され,更 に酵 素 の産. pH4.O,40℃. 生 に関 す る基 礎研 究 な らび に そ の諸 性 質 の検 討等 も進. 用 時間 等 は適 宜 定 め た の で そ の都 度 記載 す る.. め られ 試 作 品 の一 部 は 入手 し得 る よ うにな つ た.こ れ 等 は何 れ も糸 状 菌 に よ り産 生 され るも ので あつ て 更 に そ の精 製,反 応 機 作 の 解 明等 酵 素 化 学 的 な研 究 は岡 田 氏等8)に よつ て 行 な われ てい る.我. 々は これ等 酵 素 剤. を 実 際 に加 工 等 に利 用す るた め に必 要 な基 礎 知 識 を 求 め るた め に本 実 験 を 行 な つ た. 実 酵. で 作 用 させ た.酵 素 濃 度,基 質 濃度,作. 活性の測定法 岸 氏,・3・4・5)岡 田氏 等8)は ナ リンギ ナ ー ゼの 作 用 に よ りナ リンギ ンか ら生 ず る糖 の 量 をSomogyi法. で測定. し又 場 合 によ つ て は還 元 力 の 増 加 を 測 定 した.一 方 中 林 氏7)は ナ リンギ ン の減 少 を 以 て酵 素 活 性 を求 め た. 我 々 も この両 者 に つ いて 先 ず 検 討 した が酵 素 剤 が 粗 標. 験. 素. 次 の3種 の 市 販 又 は試 作 酵 素 標 品 に つ い て 試 験 を *勤 務 先:全 国農 業 購 売 協 同 組合 連 合 会. 品 で あ るの でSomogyi法. で は酵 素 液 だ け で も か な り. 顕 著 に呈 色 した の で ナ リンギ ンの減 少 を測 定 す る簡便 な方 法 を 採 つ た. ナ リンギ ンはDavis法1)の. 一 部 を 改 良 した 中林 氏 の. 記 載 に よつ て測 定 した.即 ち試 料1mlに90%ジ. エ.

(3) 上 述 の よ うに ナ リンゲ ニ ン も同 一 試 薬 で 同 様 に発 色 す る ので 酵 素 活性 を ナ リンギ ンの 減 少 で 測 定 す る場 合 に は ナ リンゲ ニ ンの 雪1色を補 正 しな けれ ば な らな い. そ の た め ナ リン ギ ンの 分 解 率 は 次式 か ら近 似 的 に算 出 す る.. こ こでAは 反 応 液 中に 初 め 含 ま れ て い た ナ リンギ ン の 吸 光度 即 ち反 応 時 間 零 の場 合 の反 応 液 の 吸 光度,C は反 応 後 の反 応 液 につ い て 皇 色 した場 合 の 吸 光 度 で あ る.又Bは Fig.. 1.. Coloration by. SP : Color EC:. Davis's intensity. of. naringin. and. naringenin. 率100%の. method. was. estimated. by. 吸光 度Aを 示 す ナ リンギ ンか ら生 ず べ き即. ち これ と等 モ ル の ナ リンゲ ニ ンに よ る吸 光 度 或 は 分 解 場 合 の 反 応 液 に よ る吸 光 度 で あ つて 第1図. か ら求 め られ る.ナ. spectro-. リン ギ ンの ラム ノー ズ だ けが 除 か. れ た プ ルニ ンは 糸状 菌 の産 生 す る ナ リンギ ナ ー ゼ作 用. photometer at 420 mg. Color intensity was estimated colorimeter with blue filter.. by. electric. の中間 体 で あ つ てDavis法. に よ り同 じ く黄 色 に呈 色 し. そ の程 度 は ナ リンギ ン と ナ リンゲ ニ ン との 中間 で あ チ レン グ ライ コー ル10ml及 添加 し30℃. に30分. び1NNaOHlm1を. る.従 つ て 厳 密 に は上 記 計 算 式 は完 全 で は な く反 応 液. 保 持 した 後 生 成 した 黄 色 の強 さ. 中 の プ ルニ ンに よ る県 色 も考 慮 しな け れ ば な らない.. を測 定 した.比 色 は通 常 日立 光 電 比色 計EPO‑A型,. しか しプ ル ニ ンの 量 を求 め る こ とは 甚 だ 困難 で あ り多. 青色 フ ィ ル ター,厚 さ10mmの. 量 の試 料 を 測 定 す る酵 素実 験 に は適 しな い.勿 論 岡 田. セ ル を用 い たが 第1. 図 に示 す よ うに 供試 液 の ナ リンギ ン濃度4×10‑4Mま. 氏 等8)に よ つ て得 られ た結晶 酵 素 の場 合 には プ ル ニ ン. で は直 線 関 係 を 示 した.比 色 計 の 代 りに 日立 分 光 光 度. で 反応 が停 止 す るの で 上 式 のBは 当然 プ ルニ ンの値 で. 計EPU‑‑2型. なけ れ ば な ら ない が 加 工 に使 用 す る よ うな 粗酵 素 で は. を 用 い420mμ. で そ の 吸光 度 を 測 定 す る. と精度 は更 に高 くな り しか も試 験 した最 高 濃 度10‑3M. 所 謂 サ リシ ナ ー ゼ も同 時 に 共存 し反 応 は プル ニ ンで止. まで 完 全 に 比 例 した.酵 素 の 作 用 に よ りナ リンギ ンか. る こと な くナ リンゲ ニ ン まで 進 行 す る.更 に ナ リンゲ. ら生 ず る ナ リンゲ ニ ン も本 法 で 同 様 に呈 色 す るが そ の. ニ ンの 呈色 率 は プ ルニ ンの もの よ りも低 い の でBの 値. 呈 色 率 は ナ リンギ ン に比 べ て 低 く同一 濃度 の ナ リンゲ. は 共存 す るプ ルニ ンに よ る 甲色 を低 く見 て い る こと に. ニ ンに よ る吸光 度 は 同 じ く第1図. な り従 つ て ナ リンギ ンの分 解 率 も プ ル ニ ンの 存 在 量 に. に 示 す 通 りで あ つ. て,比 色 計 及 び分 光 光 度 計 の 何 れ を用 い て も10一3Mま. 応 じて 実 際 よ りは 低 くな つ て い て,過 大 に見 るよ りは. で は同 様 に直 線 関係 を示 しその 濃 度 と吸光 度 と の関 係. 安 全 で あ る.. はそ れ ぞ れ 次 の近 似 式 で 求 め られ る. 光電比色計. 酵 素 標 品 の活 性. ナ リンギ ンC÷14.43E. 先 ず 酵 素活 性 の測 定 に適 当 な 条件 を定 め るた め に ナ. ナ リンゲ ニ ンC÷85.96E 分光光度計. リンギ ンの分 解 を経 時 的 に求 め第2図. ナ リンギ ンC÷5.58E ナ リンゲ ニ ンC÷22.96E. こ こでCは 濃 度(10‑4M),Eは. に示 した.. ナ リンギ ナ ー ゼ標 品Aは0.25%酵. 一logTを. 0.05%ナ 示 す.. 測定 は勿 論 単 波 長 で行 な う こ とが 望 ま しい が 酵 素 反. 素 液(pH4)と. リン ギ ン溶 液 と を等 量 宛 混 合 した反 応 液 で あ. り,標 品Bは0.75%又 緩 衝 液5m1及. は0.5%酵. び0.05%ナ. 素 水 溶 液1mlを. リンギ ン 溶 液2m1の. 応 の 精度 や本 実 験 の 日的 か らよ り手軽 な光 電 比 色 計 を. 合 液 に添 加 した.従 つ て 基 質 濃 度 は それ ぞ れ0.025%. 使 用 して も差 支 え な い.こ の 場合 吸光 値 は0.150付. 又 は0.0125%で. 近. あ り 一 方 酵 素 の 濃度 はA標. %,B標. 基 質 は反 応 液 中の 終 濃度0.025%又. して ペ ク チ ナー ゼ製 剤 ス ク ラーゼ は ナ リンギ ンの 分解. もよ く用 いた が,こ の場 合 そ れ ぞ れO.5ml及 につ い て発 色 させ た.. び1ml. 最. は0.063%で. あつ た.こ. 品0.125. にな るよ うに反 応 液 を 設定 した.即 ち後述 す る よ うに はO.0125%を. 品0.094又. 混. れ に対. を 目的 と して 製造 され た 標 品 よ りは勿 論 活性 が低 い の で酵 素量 を 多 くす る必 要 が あ る.第2図. の実 験 は5%.

(4) 4.0な い し4.5で. あ る こ とは岸 氏 に よ り既 に報 告 され. て い るので こ こで は 標 品B及 び ス ク ラー ゼ の も の につ い て 測定 した.標 品Bに つ いて は第2図 の条 件 と 同様 に種 々 のpHの で60分. 緩 衝 液 を用 い て 反 応液 を 調 製 し40℃. 間 作 用 させ た.こ. れ に対 してペ クチ ナ ー ゼ標. 品 で は反 応 液 の 基 質 及 び酵 素 の 終 濃 度 は 同一 で あ るが 酵 素 は緩 衝 液 の代 り に水 で抽 出 し0.075%ナ 溶 液,7.5%酵. リンギ ン. 素 水 溶 液 及 び 緩衝 液 を等 量 宛 混 合 して反. 応 液 と した.. Fig. 2.. Decomposition enzymes.. of naringin. by some. I: Naringinase preparation A (naringin 0.025 %, enzyme 0.125 %) II: Naringinase preparation B (naringin 0.0125 %, enzyme 0.094 %) III: Naringinase preparation B (naringin 0.0125 %, enzyme 0.063 9) IV: Pectinase preparation (naringin 0.025 %, enzyme 5.0 %) V: Pectinase preparation (naringin 0.025 %, enzyme 2.5 %) Concentrations were expressed by final concentration in reaction mixture. 又 は10%酵. 素液(pH4)を. 等 量 の0.05%基. 質溶液. と混 合 した も ので あつ て ナ リンギ ナ ー ゼAの20倍 い し40倍 使 用 した こ とに な る.こ. な. の場 合 酵 素 の 濃 度. が 高 く酵 素 液 自体 が濃 褐 色 を 呈 す るの で比 色 に際 して. Fig. 3.. Effect of pH on the reaction.. I: Naringinase preparation B (naringin 0.0125 %, enzyme 0.05 %, 40°C, 60 min.) II: Pectinase preparation (naringin 0.025 %, enzyme 2.5 %, 40°C, 120 min.) 第3図 に示 す よ う に 両 酵 素 標 品 と もに何 れ もpH4 付 近 に 最 高値 を持 つ が特 に ナ リン ギ ナー ゼBは4か 5に か けて か な り広 い 最 適pH反. ら. 応 域 を 持 ち,そ れ か. ら徐 々に作 用 力は 低 下 し8前 後 で は 殆 ど作 用 は起 こ ら. 多 少 影 響 す る.そ のた め ナ リンギ ン測定 に際 して は反. な くな つ た.こ れ に対 し酸 性 側 で は比 較 的速 や か に活. 応 液 と同 じ濃度 の酵 素 液 の み に つ い て盲 験 を 行 な い 補. 性 を 低 下 し,こ のpH一. 正 した(0.5mlに. 似 して い る.一. つ い て 吸光 値 約0.02).ナ. リンギ ナ. 活 性 曲線 は 標 品Aの も の に酷. 方 ペ ク チナ ー ゼ標 品 中の もの はpH4. ー ゼ標 品A及 びBに つ い て は 酵 素 濃 度 が低 い の で補正. よ り 中性 側 で もか な り速 や か に活 性 が 低 くな る傾 向が. す る必 要 は な か つ た.. 認 め られ た.. こ う して 基質 濃 度0.0125%な 濃 度0.05又 は0.1%程 ば正 常 条 件pH4.0,40℃. い し0.05%を. 用い終. 度 の ナ リン ギ ナー ゼ で 測定 す れ で30分. な い し60分 作 用 させ. 最 適 温 度 ナ リンギ ナ ー ゼAの 最 適 温度 は40。 な い し45℃. の. 間 に あ ると報 告 され て い る.こ れ に対 し標 品Bの も の. れ ば十 分 に活 性 の 測 定 が 出来 る.こ れ に対 してペ ク チ. は第4図 に 明 らか な よ うに50。 ない し60℃. ナ ー ゼ標 品 中 の ナ リンギ ン分 解 力 は弱 い の で反 応 液 中. 活 性 を 示 し70℃. の酵 素濃 度 は 少 な く とも2.5%は. 比 ベ ス ク ラー ゼ の もの は50。Cで 最 高 値 を 示 し40℃ で. 必 要 で あ り,し か も. で最 高 の. で は 急激 に活 性 を 低下 す る.こ れ に. この 条件 で1時 間 で は 不十 分 で あ り2時 間 な い し3時. も 比較 的 に強 く作 用 す るが60℃. 間 反 応 させ な けれ ば な らな い.し か しこの条 件 を 用 い. の 場合 酵 素 活 性 は 第2図 の も の と同 じ反応 液組 成 の も. れ ば 市販 ペ ク チ ナー ゼ標 品 中 の ナ リンギ ナ ー ゼ活 性 を. の で あつ て特 に ナ リンギ ナー ゼBで は30分 及 び60分. 分 に 測 定す る こ とが 出来 る.又 反 応 は 各酵 素 標 品十 と も これ 等 の条 件 で は時 間 とと もに直 線 的 に 進行 した. 最. の も のを 測 定 した.こ こで 温 度 一活 性 曲線 はほ ぼ 類 似 の 傾 向を 示 した が反 応 時 間30分. の 場 合 に は50℃ 及 び. 60℃ で の分 解 率 は殆 ど同一 で あつ た.こ. 適pH. ナ リンギ ナ ーゼ 標 品Aの. で は極 め て 弱 い.こ. 最 適pHは40℃. に於て. れ に対 して. 60分 で は前 者 が 後者 よ り 若 干 上回 つ て い るが これ は.

(5) pH4に. 戻 し更 にpH4のMcIlvaine緩. に した.こ れ に0.1%ナ 法 通 り40℃. よ る分解 率 を求 めた.pHを. 酸 又 は ア ル カ リだ けで 調. 間 後 に 若干 の変 動 が 認 め られ る.. そ こで ナ リンギ ナ ・ ・‑tfBは5%水 の緩 衝 液3m1を 補 正 した.こ. Effect of temperature. on the. reaction.. I: Naringinase preparation B (naringin 0.0125 %, enzyme 0.05 %, pH 4.0, 60 min.) II : Naringinase preparation B (naringin 0.0125 %, enzyme 0.05 %, pH 4.0, 30 min.) III : Pectinase preparation (naringin 0.025 %, enzyme 2,5%, pH 4.0, 120 min.). 溶 液1m1に. 加 え更 にNaOH又 うす る と20℃. 正 しく. はNaOHでpH4に. 緩 衝 液 で10m1に. で処 理 したO.5%ex素. 各pH. はHCIで. に一 晩 放 置 して も正確 に. 保 持 した.以 下HC1又. し更 にpH4の. Fig. 4.. 加 え常. に2時 間反 応 させ て 残 存 す る酵 素 活 性 に. 節 した の で は20時. pHを. 衝 液 で6ml. リンギ ン溶 液2mlを. 戻. して そ れぞ れ のpH. 液 を得,第2図. と同 一条 件 で反. 応 液 を調 製 し残 存 活 性 を 測 定 した.一 方 ナ リンギ ナ ー ゼAは1%酵. 素 液 に緩衝 液3m1を. 理 した後 最 終 的 に6mlと 溶 液2mlを. 加 え以 下 同 様 に 処. しこれ に0.1%ナ. リン ギ ン. 加 え て活 性 の測 定 に供 した.. 第5図 か ら明 らか な よ うに ペ ク チ ン分 解 酵 素 剤 中 の 反 応 時 間が 長 くな るた め反 応 温 度 で の酵 素 の 失 活 の 影 響 が 現 われ て きた もの と思 われ る. pH耐. りpH3付. 性. 安 定 で あ つ て1.7以. い し6の 間 で. 下 で は 殆 ど失 活 す る こと を認 めた. が6以 上 につ い て は試 験 を 行 な つ て い ない. ク ラー ゼ酵 素 液5m1に. 又 は1NNaOHで 25℃)に20時. 所定 のpHに. そ れ ぞ れINHCl 調節 した 後室 温(20。〜. 間 放 置 した 後 再 び 酸 又 は ア ル カ リで. ら6の 間 は安 定 で あ. 近 で や や 低 くな りpH2.2で. を 失 つ た.ナ. 岸 氏2)は ナ リンギ ナー ゼAがpH4な. 4%ス. ナ リンギ ナ ーゼ 活性 はpH3.5か. は殆 ど活 性. リン ギ ナー ゼ 標 品 の も の につ い て は よ り. 広 汎 にア ル カ リ側 迄 試 験 した がB標 品 の酵 素 の 安 定 域 が最 も 広 くpH2.9付 pH8な. 近 か ら 中性 付 近 迄 は 変化 な く. い し9で 多 少 低 くpH10を. 標 品Aの もの も 同様 にpH8付 pH9で. は 半 減,pH10で. 越 す と失 活 した.. 近 迄 は 安 定 で あ るが. は1/4に. 低 下 した.. 温 度 耐 性 次 に各 酵 素 液(pH4)10mlを. 試 験 管 に採 り所 定 の. 温 度 に一 定 時 間 浸 漬 した後 ナ リンギ ン分 解 力 を 測 定 し 第6図. に示 した.何 れ の酵 素 に 於 て もほ ぼ類 似 した 耐. 熱性 を持 ち40℃ 及 び50℃ で は半 分 以 下 に,70℃. で は安 定 で あ り60℃30分. で は殆 ど完全 に活 性 を 失 う こと. が 認 め られ た.試 験 した3種 の酵 素 標 品 の 耐 熱性 につ い て は顕 著 な 差 異 は 認 め られ ない が60℃30分 ス ク ラー ゼ,標 品B,標. の場 合. 品Aの 順 に強 い よ うで あ る と. 思 わ れ る. 酵 素耐 性 に 対 す るpHと. 温 度 の関 係. 前 項 の試 験 で 酵 素 の 活 性 に対 す るpH或. Fig. 5.. Effect of pH on the stability the enzyme.. of. Activities were estimated after 20 hrs. at room temperature (20°C to 25°C) I: Naringinase preparation A (naringin 0.025 %, enzyme 0.125 %, pH 4.0, 40°C, 40 min.) II: Naringinase preparation B (naringin 0.0125 %, enzyme 0.0625 %, pH 4.0, 40°C, 60 min.) III : Pectinase preparation (naringin 0.025 %, enzyme 2.5 %, pH 4.0, 40°C, 120 min.). は温度それ. ぞ れ 単 独 の 影響 につ いて は一 応 の 知見 が得 られ た が こ の両 者 の酵 素 活 性 に対 す る影響 は元 来 切 り離 して 考 え るべ き もの で は な い ので 更 に 若 干 の実 験 を 行 な つ た. ナ リンギ ナ ー ゼB溶 液 を 第5図 30℃ で20時. の 条 件 で20。 及 び. 間 処理 した後 活 性 を 測 定 し第7図. た,こ う して20℃. で はpH9ま. に示 し. で は 比較 的 に安定 で. あつ て極 め て徐 々に 活 性 を 低 下 す るに過 ぎ ない がpH 9を 越 す と急 激 に 失 活す る こ とは 既 に第5図 に認 め た.

(6) Fig. 8. Fig. 6.. Effect fo temperature on the stability of the enzyme.. I-40: Naringinase preparation A treated at 40°C. II-50: Naringinase preparation B treated at 50°C. III-60: Pectinase preparation treated at 60°C. Estimation of activity was carried out at pH 4.0 and 40°C for 60 min. Naringinase preparation A (I) : naringin 0.0125 %, enzyme 0.03 % Naringinase preparation B (II) : naringin 0.0125 %, enzyme 0.063 % Pectinase preparation (III) : naringin 0.05 %, enzyme 5.0 %. Effect of temperature on the stability of the naringinase activity of preparation A at various pHs.. Activities were estimated after 20 hrs. Estimating condition of activity: naringin 0.0125 %, enzyme 0.063 %, pH 4.0, 40°C, 60 min. よ り詳 細 に試 験 しそ の結 果 を 第8図 に示 した. 酵 素 活 性 の耐 性 に対 す る第3の 因 子 は時 間 で あ るが これ 迄 の 耐 性 試 験 はす べ て 長 時 間 で行 なつ た もの で あ る.そ こで 次 に 比 較 的短 時 間 に中性 よ りア ル カ リ側 で の耐 性 を 検 討 した.ナ リンギ ナー ゼA5%水 を常 法 通 り緩 衝 液及 びNaOH又 に調 節 し全 量 を25mlと 置 し経 時 的 に5ml宛 でpH4に 0.5%酵. はHCIで. 溶 液5m1 所 定 のpH. した.こ の状 態 で10℃. に放. 採 り出 し直 ち に 酸 及 び ア ル カ リ. 戻 し 更 にpH4の 素 液 と した.こ. 緩 衝 液 で10mlに. し. の酵 素 液 の 保持 す る活 性 を 測. 定 し第9図 に示 した.pH10で. の失活 は比較的速や. か に起 り2時 間 で 殆 ど達 成 され た.こ. れ に対 してpH. 9で は2時 間迄 は殆 ど影響 を受 けず これ よ り急 速 に失 活 が 進 み4時. 間で は大部 分 の 活 性 が失 わ れ た.pH7. Fig. 7. Effect of temperature on the stability of the naringinase activity of preparation B at various pHs. Activities were estimated after 20 hrs. Estimating condition of activity : naringin 0.0125 %, enzyme 0.063 %, pH 4.0, 40°C, 60 min. 所 で あ る.こ れ に対 して30℃ くな りpH8迄. で は酵 素 の 安 定 域 は 狭. で あ つ てpH8.8で. は活 性 は 約25%. に低 下 した.こ の よ う にア ル カ リ性 で の酵 素 の 安定 性 は 温 度 に よ つて も影 響 され温 度 が高 い 程 安 定 域 は狭 く な りそ の限 界 は 中性 側 に移 る.し か しpH6な. い し8. の 安 定 な範 囲で は 温 度 の影 響 は受 け な かつ た. 同様 の こ とは ナ リンギ ナ ーゼAで. も認 め られ る所 で. Fig. 9. Effect of treating time at 10°C on the stability of the naringase activity of preparation A. Estimating condition of activity: naringin 0.0125 %, enzyme 0.03 %, pH 4.0, 40°C, 60 min..

(7) な い し8で は 勿 論活 性 は保 持 され た. pH7及. され るの で 苦 味 の除 去 には何 か特 別 の 処 理 法 を考 え る. び8付 近 の酵 素 耐 性 は 後 述 す るペ クチ ン分. 必 要 が あ る と述 べ て い る.そ の た め別 の 甘 味源 を用 い. 解 酵 素 の もの との 関 係 に於 て特 に重 要 で あ る.第8図. る こと も一 つ の手 段 か と考 え られ るの で先 ず 最 近 市 場. に示す よ う にpH8で. に 出 て い る ソル ビ トー ル につ い て 検 討 した.尚 比 較 の. は30℃. 迄 は安 定 で あ るが37℃. に一 晩 処 理 す るとか な り活 性 を 低下 す る.し か し第9. た め に蔗糖 及 び葡 萄 糖 につ い て も 試験 した.. 図 か ら推 定 され る よ うに この よ うな条 件 で も少 な くと. 反応 液 はO.5%酵. も2時 間 ない し4時 間程 度 まで は 活性 を保 持 す る もの. 液2ml及. と思 わ れ る点 第10図. 加 えpH4,40℃. の 実験 は これ を支 持す る もの で. あ つ て ナ リンギ ナ ー ゼAの 耐 性 を30℃. 及 び37℃. で. 素 液1m1,0.05%ナ. リンギ ン溶. び 表 示 の終 濃 度 に な るよ う に 糖 液1mlを で30分. 作 用 させ 糖 の 代 りに 水 を 加. えた 対 照 との分 解 率 を 比 較 した.. もの は水 抽. こ う して 葡 萄糖 が低 濃 度 で 極 め て高 い阻 害 作 用 を 示. 出 液で あつ て そ の まま温 水 に浸 漬 した 後他 の も の と同. す こ とは 岸 氏,中 林 氏 等 に よつ て 示 され た通 りで あ る. 様 にpH4に. が ソ ル ビ トー ル は比 較 的 に 低 い 阻害 効 果 を示 し蔗糖 よ. 追 跡 した もの で あ る.尚 こ こでpH6.5の. 調 節 し緩 衝 液(pH4)を. 測定 した.こ う してpH8ま. 加 え た後 活 性 を. で は37℃. で も少 な くと. も4時 間 は安 定 で あ り酵 素水 溶 液 も同 様 に 活性 を保 持. りも若 干 よい よ うで あ る.、果糖 もか な り強 い 阻 害 作 用 を特 に高 濃 度 で示 した.. す る ことが 確 め られ た. 考. 察. 供 試 した両 標 品A及 びBの 酵 素 反応 特 性 に は顕 著 な 相 違 は認 め られ な い よ うで あ る.即. ち反 応 の 最 適pH. は4.0〜4.5付 近 に あ り 最 適 温 度 は50℃ な い し60℃ に 認 め られ る.他 方 我 が 国 で 市販 され てい るペ クチ ナ ー ゼ 製 剤 に も ナ リンギ ナ ー ゼ活 性 が 含 まれ て い るが その 活 性 は ナ リン ギ ナー ゼ を 目的 と して 特 別 に調 製 され た 標 品 の活 性 よ り は勿 論 遙 か に 弱 い.し か しそ の酵 素反 応 の特 性 は比 較 的 に よ く似 て お りpH4.2,50℃. で最. 高 の 作用 力 を示 す.た だ 最 適 温 度 は何 れ も50℃. では. あ るが ナ リン ギ ナ ーゼ 製 剤 の も のが60℃. Fig. 10.. 較 的 に 強 い作 用 力を 示 す の に対 しペ ク チ ナ ーゼ 標 品 の. Effect of treating time on the stability of the naringinase activity of preparation A.. Estimating condition of activity: naringin 0.0125 %, enzyme 0.063%, 4.0, 40°C, 60 min.. 付 近 まで 比. も の はや や 低 温 即 ち40℃. な い し50℃. で 活性 が 強 く. これ を 越 す と急 速 に作 用 力を 失 う.又 酵 素 の安 定 性 に つ い て も試 験 した3標 品 の も の は何 れ も類 似 の性 質 を. pH. 持 つ て お りpH4な 性 も50℃. 糖類の影響. い し8付 近 まで は安 定 で あ り耐 熱. 迄 は 安 定,60℃30分. 低 下 し70℃. で 半 分 以下 に 活 性 は. で は完 全 に 失 活す る.こ れ 等 の安 定 性 に. 本 酵 素 に よ るナ リンギ ン の分 解 生 成 物 で あ る ラム ノ ー ズ及 び 葡 萄 糖 が 酵 素 作用 を強 く阻 害 す る こと は既 に. つ い て も厳 密 に は多 少 の 相違 は観 察 され る もの で あ つ. 岸氏5)に よ り報 告 され て い る.又. 範 囲 は広 い よ うで あ るが 例 え ばpH2付. 中林 氏7)も蔗糖 及 び. 葡 萄 糖 の阻 害 度 を 測定 し実 際 の 缶 詰製 造 で は80℃. 前. 後 に加 熱 され ると と も に糖 濃 度 も高 く酵 素 作 用 が抑 制 Table. 1.. Inhibition. of. て標 品B,標. の低pHで. 品A,ス. ク ラー ゼ の順 に酵 素 の 安定pH. の2者 は急 激 に 活性 を失 う.又60℃ activity. by. 近 の安 定 域 外. は 標 品Aは 比 較 的 に 活性 を保 持 す るの に他. some. sugars.. で の 耐 熱 性 もス.

(8) ク ラー ゼ,標 品B,標 され た.し. 品Aの 順 に強 い こ とが一 応 観 察. る ペ クチ ン分 解 酵 素 との 関連 か らア ル カ リ性 に つ い て. か しこれ 等 の 相 違 は 顕著 な もの で は な く一. のみ 行 な つ た が酸 性 側 に つ いて も必 要 で は ない か と思. 括 して 述 べ れ ば 類似 性 が 強 調 され る.こ の こと は3種. われ る.更 に この よ うな ア ル カ リ耐 性 或 は 酸耐 性 の問. の標 品 が何 れ も糸 状 菌 に よ つ て産 生 され る こと に基 く. 題 は実 用 上 の価 値 が あ るだ け で な く,特 に 比較 的温 和. もの,換 言 す ると糸 状 菌 の ナ リンギ ナー ゼ は本 質 的 に. な温 度 に も影 響 され る事 実 とと も に酵 素 活性 の解 明 に. は 同一 の もの で あ ると云 う こ と は過 早 で あ る.更 に指. も有 力 な端 緒 を与 え る可 能性 が あ る と も推 定 され る.. 摘 され た 若 干 の 相違 も無 視 す るか 否 か に は慎 重 で なけ. 糖 に よ る阻 害 は 中林 氏 が 指摘 して い るよ うに実 用 上. れ ばな らな い.滝 口氏10)は実 用的 立 場 か ら最 適pHで. の 見 地 か ら特 に酵 素 の有 用 性 に重 大 な影 響 を 及 ぼ す 問. の酵 素 活性 を比 較 す る とと もに果 汁 のpHで. の活 性 も. 題 で あ るの で この解 決 は早 急 に行 な わ れ な けれ ば な ら. 比 較 す る こと は優 良 菌 株 の分 離 選 択 に 際 して 重 要 な こ. な い.特 に糖 の 化学 構 造 が酵 素 阻 害 に 密接 な関 係 を持. とを 指 摘 して い る.同 様 な こ とは 温度 の影 響 につ い て. つ か否 か は反 応 機 構 の解 明 に も役 立 つ も の と思 わ れ る. も缶 詰 製造 の立 場 か ら考 慮 す べ きで あ ろ う.従 つ て ペ. が,逆 に反 応 機構 の解 明 が 糖 の 阻 害 問題 の解 決 に有 効. クチ ナ ー ゼ製 剤 は別 と して,試 作 品A及 びBに つ い て. な手 段 を 提 供 す るも の と考 え られ る.ソ ル ビ トー ル の. 何 れ が可 何 れ が 否 と 結 論 を 出 す こと は不 十 分 で あ つ. 試 験 結 果 は これ に対 す る解 答 を与 え る もの で は ない が. て,酵 素を 利 用 す るそ れ ぞ れ の立 場 か らそ の条 件 に応. 研 究 の 第 一 歩 で あつ て 引続 い て継 続 され な け れ ば な ら. じて検 討 しなけ れ ば な らな い.我 々の 実験 は そ の検 討. ない の は 当 然 で あ る.し か し ここで 食 品 添 加剤 で あ る. に 際 して採 用 す る試験 の 条件 を提 供 す るに と ど ま る も. 事実 と経 済 性 とを 忘 れ て は な らない の で 多 くの制 限 も. の と思 われ る.. 予 想 され る.. 温 度 と の関 係 を 考慮 して特 に詳 細 に検 討 した 酵 素 の ア ル カ リ耐 性 は 特 に興 味 深 い もの で あ つ て酵 素 の 失 活 は ア ル カ リ処 理 の温 度 に も比 較 的 に 強 く影 響 され る. 温 度 が低 い 程 酵 素 が安 定 で あ る こ とは一 般 に云 え る こ とで あつ て ナ リンギ ナ ー ゼの アル カ リ耐 性 も勿 論 これ に従 うが比 較 的 に 鋭 敏 で あつ た.し か もpH8以. 上の. 木 研究 は文 部 省 試 験 研究 費(代 表 者 野 村 男次)で 行 な つ た もの で あ る.研 究 に際 し種 々御 助言 を 頂 き又貴 重 な試 料 を頂 戴 した 山 口大 学 農 学 部 野村 男次 博 士,静 岡 大学 農 学 部 中林 敏郎 博 士 及 び 三 共 株 式 会社 石 橋 慶 次 郎 博士 に心 か ら感 謝 申 し上 げ る.. 不 安定 部 で この 影響 は顕 著 で あ るが 少 な くと も30℃ で はpH6な. い し8の. かつ た.し か し37℃. 総. 安 定 域 で は影 響 は以下 受けな. で の標 品A,或. は30℃. 括. で の標. 市 販 ペ ク チナ ー ゼ製 剤 三 共 ス ク ラー ゼ及 び 優 良 糸状. 品Bの 耐性 を それ よ り低 温 に於 け る耐 性 と比 較す る と. 菌 か ら試 作 した2種 の ナ リンギ ナ ー ゼ標 品 につ い て ナ. き,温 度 の上 昇 に伴 つ て酵 素 の安 定 な限 界 も狭 くなつ. リンギ ナ ー ゼ作 用 を 試 験 し若干 の観 察 を行 な つた.. て 中性 側 に移 る傾 向 が 認 め られ る.特 に この安 定 性 が. (1)酵. 素活 性 は基 質 ナ リンギ ン の 減 少 を 比色 的 に. 狭 くな り始 め る温度 の相 違 は両 酵 素 標 品 の特 性 の 差 と. Davis法. で 測定 して 求 め た.こ の 場 合 ナ リンゲ ニ ンの. して 木 質 的 な も ので あ るか 否 か は明 らか で な いが,少. 呈 色 を 補 正す る近 似 式 を 求 め これ に よつ て分 解 率 を 算. な くと も30℃. 出 した.. 以 下 の我 国 で の日 常経 験 す る温 度 範 囲. 内 で の この 両 者 の 相違 は実 用 上 重 要 な も の と して留意. (2)測. 定 条 件 を検 討 し ナ リンギ ナ ー ゼ 標 品 の場 合. して お く価値 は あ る と思 わ れ る.酵 素 耐 性 に対 す る時. 基 質 濃度0.0125%な. 間 の影 響 も また 無 視 出来 ない が ア ル カ リによ る失 活 は. い し0.1%の. 比 較 的速 や か に進 行 す る.こ の場 合 厳 密 には 例 え ば第. 分 で活 性 を 測 定 出来 た が,ス ク ラー ゼ の場 合 更 に大 量. 9図 の 例 が 示 す よ うにpH9で. の酵 素(終 濃度2.5%)と. 10で の30分. の 最 初 の2時. 間,pH. は 比較 的に 安定であ りそれよ り急速 に. 不 活 性 化 が進 み前 者 で は4時 間,後 者 で は2時 間で 殆 ど完 了 す る.従 つ て37℃. に於 け るpH7な. い し8で. の 不 活 性 化 も ご く初 期 の 安定 時間 内で は 起 こ らない 筈. い し0.05%,酵. 素濃 度0.05な. 反 応 液 でpH4.0,40℃30分. ない し60. 長 い反 応 時 間(2な. い し3. 時 間)と を 要 した. (3)反 pH7・5よ (4)反. 応 の最 適pHは. 何 れ もpH4.0付. 近に あ り. りア ル カ リ側 で は殆 ど反 応 しなか つ た. 応 の最 適 温 度 は 何 れ もpH4.0で50℃. 付. で あつ て 少 な くと も4時 間 は こ の範 囲 に 属す る こ とを. 近 に 認 め られ た が ナ リンギ ナ ー ゼ 製 剤 の もの は60℃. 第10図. で も殆 ど 同 じ程 度 の 作 用 力 を示 し70℃. の結 果 は示 して い る.こ れ 等 の実 験 は後 述 す. で 急激 に活 性.

(9) を 低 下 した.一 方 ス ク ラー ゼ標 品 の酵 素 は40℃ 50℃ の もの に近 く強 く作 用 した が60℃. でも. で は か な り弱. く阻 害 した.こ. れ に 対 して ソ ル ビ トー ル の 阻 害 作 用 は. か な り 低 か つ た.. か つ た. (5)酵. 素 は何 れ もpH4な. い し8で 安 定 で あ つ た. が そ の安 定 の 範 囲 は酵 素 標 品 に よつ て若 干 異 な つ た. しか しpH2付. 近 よ り酸 性側 及 びpH9付. 近よ りア. 文. 献. 1)Davis,W.B.,1947.AnaLChem.,19,476. 2)岸. 清,1955.科. 学 と 工 業,29,140.. 3)岸. 清,1957.科. 学 と 工 業,31,329.. 4)岸. 清,1958.科. 学 と 工 業,32,389,. 5)岸. 清,1959.科. 学 と 工 業,33,185.. 6)野. 村 男 次,1961.私. 素 の ア ル カ リ耐 性 に 対 す る温 度 の 影 響 を 更. 7)中. 林 敏 郎,1961.缶. に詳 細 に検 討 した.一 般 にア ル カ リ性 で の酵 素 の安 定. 8)岡. 田 茂 孝,岸. 性 は 温 度 に よつ て も影 響 され 温 度 が 高 い程 活 性 を 低 下. 学 シ ン ポ ジ ウ ム(福 9)滝 口 洋,1961.日. ル カ リ側 で はか な り顕 著 に失 活 した. (6)酵. 素 活 性 は何 れ も50℃. 30分 で は半 減,70℃ (7)酵. で安 定 で あ るが60℃. で は殆 ど完全 に失 活 した.. した.又 或 る温 度 以 上 で は 酵 素 の安 定 域 も狭 くな つた. (8)酵. 素 の ア ル カ リに よ る 失 活 は 時 間 に よつ て も. 回 講 演. 10)滝 口. 影 響 され るが比 較 的 速 や か に進 行 した.こ の場 合 ア ル. (9)数. 詰 時 報,40(7),1. 清,福. 本寿. 一郎,1962.酵. 素化. 岡)予 講 集,P.10。 本 農 芸 化 学 会 関 東 支 部 第212. 木 農 芸 化 学 会1962年. 大 会講. 演.. 11). カ リ処 理 の初 期 に比 較 的安 定 な 時 期 が認 め られ た.. 洋,1962.日. 信.. Ting, S. V., 1958. Agr. Food Chem., 6, 546.. 種 の糖 類 に よ る反応 の 阻 害度 を測 定 した が,. 葡 萄 糖 が 最 も顕 著 な阻 害 効 果 を 示 し果 糖 も比 較 的 に強. Summary Naringin (naringenin-7-rhamnoglucoside), a bitter substance in some kinds of citrus fruits such as C. Natsudaidai and grapefruit, can be hydrolysed by the action of naringinase, resulting in loss of bitterness. It was already reported that some commercial pectinase preparations contain naringinase too. Recently, a few excellent strains of molts, which produce naringinase of high activity, were selected and isolated by several Japanese authors and trial preparations of enzyme were prepared by them. In order to obtain the fundamental basis for employing the enzyme preparation to agricultural manufacture, naringinase was examined using a typical Japanese commercial pectinase preparation, " Sankyo Sucrase " from Seler-otinia libertiana as well as two kinds of trial naringinase preparations, A from Asp. niger and B from Asp. usami mut. shirousamii. Naringinase activity of preparations was estimated by determining decrease of naringin and expressed with the rate of its decomposition. Determination of naringin was carried out colorimetrically by Davis's method using a Hitachi electric colorimeter, type EPO-A, with blue filter or a Hitachi spectrophotometer, type EPU-2, at 420 mu. Since the reaction product, naringenin, also develops the similar yellow color by the Davis's reagents, coloration of the reaction mixture must be corrected for naringenin to calculate the degree of naringin decompostion by means of the equation of approximation. It was found that "Sucrase" contains naringinase activity even though it was less active than that in the naringinase preparations. Then the conditions for estimating the activity of three enzyme preparations cited above were discussed. The final concentration of naringinase preparations A and B in the reaction mixture was suitable from 0.05 % to 0.10 % and that of substrate, naringin, from 0.0125 % to 0.05 %, when the reaction was performed at 40°C and pH 4.0 for 30 to 60 min. However, since the naringinase activity of the pectinase preparation is much less than that of the naringinase preparations, concentration of enzyme must be at least from 2.5 % to 5.0 % and reaction time from 120 to 180 min. Under these conditions, decomposition of naringin by enzyme was directly proportional to reaction time as shown in Fig. 2. Naringinase of the preparation A was already reported to hydrolyse naringin most actively between pH 4.0 and 4,5. Similary, naringinase of the preparation B and " Sucrase " was reactive between pH 4.0 and 5.0. However, activity was gradually reduced over pH 5.0 and below.

(10) pH 4.0, as indicated in Fig. 3. It had been also reported that optimum temperature of naringinase of the preparation A was from 40°C to 45°C. However, Fig. 4 showed that naringinase of the preparation B decomposed naringin most actively at 50°C to 60°C but not at 70°C. On the contrary, "Sucrase " exhibited the maximum activity at 50°C and rather pretty high activity at 40°C too, but very low at 60°C. Activity of the preparation A was also established to be stable from pH 4.0 to 6.0, upper limit tested, but inactivated almost completely below pH 1.7. From Fig. 5, it was indicated that activity of the preparation B was stable between pH 2.9 and about 7.0, decreased a little from pH 8.0 to 9.0 and inactivated at pH 10.0 at room temperature (20°C to 25°C). Stable pH range of naringinase of " Sucrase " was a little narrower, with lower limit at pH 3.5, than that of the preparation B and activity was inactivated at pH 2.2. Whereas activity of the preparation A was stable at pH 8.0 while that was fallen to about 50 % at pH 9.0 and to about 25 % at pH 10.0. Of course naringinase activity of all three preparations was similary diminished by heating. As obvious from Fig. 6, activity was retained at 40°C and 50°C but reduced to below 50 % at 60°C for 30 min., while that was inactivated at 70°C. Stability of naringinase at various pHs was varied with treating temperature and time. For example, Fig. 7 showed that naringinase of preparation B was fairly stable until pH 9 and inactivated sharply over pH 9 at 20°C, whereas that was stable until pH 8 but reduced to about 25 % of original activity at pH 8.8 at 30°C. Similar phenomena were also indicated in Fig. 8 in more detail at 5°C, 20°C, 30°C and 37°C concerning the preparation A. Fig. 9 showed that inactivation of naringinase in alkaline media proceeded in short time. At pH 10.0, naringinase activity was diminished within 120 min. even at 10°C. However, at pH 9.0, activity was retained during first 120 min., but falling of activity was carried out for successive 120 min. Of course lowering of activity did not take place at pH 7.0 and 8.0 within 4 hrs. even at 30°C and 37°C as pointed out in Fig. 10. Rhamnose and glucose were formed from naringin by molt's naringinase and enzymatic reaction was strongly retarded by these sugars. Such sugar inhibition disturbs the employment of the naringinase in agricultural manufacture, since sugar was preferentially used. Therefore, fructose, glucose, sucrose and sorbitol were also examined. As shown in Table 1, all sugars tested inhibited remarkably the reaction, but sorbitol had the most least inhibiting ability..

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