糸 状 菌 に対 す る 菌 糸 発 育 抑 制 効 果 を 指 標 に し た 再 現 性 良 好 な
抗 真 菌 剤 の 感 受 性 試 験 法
牧
克 之 ・小 山
芳 子 ・俵
修 一 ・上 村
利 明
藤沢薬品工業新薬研究所の
五 島 瑳 智 子
東邦大学医学部微生物学教室
(平成5年3月8日
受付 ・平成5年6月8日
受理)
糸 状 菌 に対 す る 抗 真 菌 剤 の 再 現 性 良 好 なIC50値 測 定 法 に つ い て報 告 す る 。 これ はペ ー パ ー デ ィ ス ク に試 験 菌 を浸 漬 さ せ て 寒 天 平 板 上 に 置 き円 形 に 成 長 し た コ ロ ニ ー の 半 径 を測 る方 法 で あ る。 この 方 法 で,Aspergillus fumigatusの 接 種 菌 量,温 度 の 影 響 を4種 類 の 培 地 を 用 い て 検 討 し た。 試 験 中,コ ロ ニ ー の 伸 長 は直 線 的 で,接 種 菌 量 の 影 響 は 受 け な か っ た 。 さ らに,4種 類 の 抗 真 菌 剤,amphotericin B,miconazole,fluconazoleお よびflucytosineのAspergillus fumigatusに 対 す る抑 制 効 果 を検 討 し た 結 果,薬 剤 に よ り菌 の 増 殖 が 容 量 依 存 的 に 抑 制 さ れ, IC50値 を 得 る こ と が で き た 。 特 に,fluconazoleで は10μg/ml以 下 の 濃 度 で 感 度 良 く活 性 を 測 る こ とが で き た 。 こ れ ら の 結 果 は重 量 法 よ り も濁 度 法 に近 似 す る値 で あ っ た。Key words:抗 真 菌 剤,糸 状 菌,感 受 性 試 験 法,IC50,菌 糸 発 育 抑 制
真菌感 染症 は,免 疫 低 下患 者 に とっ て,ま す ます 重 要 な 問題 とな ってい る。 この増 加 は抗生 物 質 の汎 用,臓 器 移 植 における免 疫抑 制 剤,AIDS感 染 お よび そ の他 が,主 要因 である。 主 な病 原真 菌 と して はCandida albicans(C.al-bicans),Cryptococcus neoformans(C.neoformans),お よ びAspergillus fumigatus(A.fumigatus)が あ げ ら れ る。 したが って,こ れ らの病 原 真 菌 に対 し,幅 広 い活 性 を もち,し か もよ り有 効 に全 身 投 与 が で きる抗 真 菌 剤 の 開発 が待 たれ る。 しか し,抗 真 菌 剤 の感 受 性 測 定 法 は統 一 され て いない1∼3)。か な りの進 展 は み られ た もの の,azole剤 で はin vitroとin vivoと の乖 離 が み られ る1,4,5)。お そ ら く, in vivo効 果 の 主 要 因 とな る抗 菌 剤 の標 的 部 位 に 対 す る抑 制作用 をin vitroで 適 正 に評 価 で きて い な いの か もしれ な い。 こう した相 関性,再 現 性,お よび感 度 を改 良 す るた め に,C.albicansで 多 くの報 告 が な さ れ て い る3,6∼9)。し か し,糸 状 菌で は,液 体培 地 で増 殖 させ る と菌 糸 は 自己凝 集 し塊 まりを形 成 し,不 均 一 な懸 濁液 とな る。 そ の た め精 度 の良 い感 受性 測 定 に 支 障 を きた して い る と思 わ れ る。一 方,糸 状菌 の 菌糸 は隔壁 で分 画 され る"細 胞 単 位(unit)" からな り,各 単 位 は病 原性 が 異 な る と推 定 され る。Yana-gidaら10)はin vitroに お い て もAspergillus niger(A. niger)の 円形 な コ ロニ ー は加齢(aging)や 分 化 の程 度 に よ っ て,4つ の 領 域 に 分 類 で き る と報 告 し て い る。 我々 は,こ れ らの う ち菌 糸 の伸長 が その先 端 部 で行 わ れ る事 実 に着 目 し11,12),抗真菌 活 性 を菌 糸 の発 育 抑制 で測 定 した。 I.材 料 と 方 法 菌 株 用 い た 菌 株 はす べ て 臨 床 分 離 由 来 株 で,藤 沢 薬 品 で 保 管 し,サ ブ ロ ー(2%デ キ ス トロ ー ス,SDA)斜 面 寒 天 培 地 で 継 代,維 持 さ れ た。 次 に あ げ る菌 株 を試 験 し た 。Aspergillus fumigatus FP 1305,8004,10001, Aspergillus niger FP 1398,お よ びAspergillus flavus FP 1022。 培 地 培 地 は す べ て,用 時 調 整 さ れ,次 に あ げ る培 地 で検 討 し た。SDA,ポ テ ト デ キ ス ト ロ ー ス 寒 天 培 地 (PDA,ニ ッ ス イ),デ キ ス トロ ー ス 添 加 イ ー ス ト ナ イ トロ ゲ ンベ ー ス寒 天 培 地(YNBDA,Difco Labo-ratories,Detroit,Mich.),な らび に0.5%酵 母 エ キ ス(Difco)添 加SDA(PYGA)も し く は そ の プ ロ ス (PYGB)。 接 種 菌 液 の調 整 Aspergillus spp.はPDA斜 面 寒 天 培 地 で30℃,7 ∼10日 間 培 養 し た。 その斜面 部 に0.1% Tween 80添 *大 阪 市 淀 川 区 加 島2 -1-6
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CHEMOTHERAPY
SEPT. 1993加 生理食 塩水5m1を
入 れ,白 金耳 で斜 面部 を擦 って,
分 生子 を採 取 した。得 られ た懸 濁液 を金網 で 濾 過 し,
生 理食塩 水 で洗 浄後,再 懸濁 させ た。 接種 菌液 は生 薗
数 を指標 に所 定菌量 に調整 した。
薬
剤
Amphotericin B (AMPH-B),
flucytosine
(5-FC), miconazole (MCZ),お よ びfluconazole (FLCZ)の4種 の 薬 剤 に つ い て 検 討 し た。AMPH-B,お よ びMCZはdimethylsulfoxide (DMSO)に 溶 解 し,滅 菌 水 で 希 釈 し た。 こ の 場 合,DMSOは 最 終 濃 度 で1%を 越 え な い よ う に し た。 ま た,5-FCは 滅 菌 水 の み で 溶 解 し た 。 デ ィ ス ク法 寒 天 平 板 希 釈 法 に した が っ て,抗 真 菌 剤 の2段 階 連 続 希 釈 液1mlを 含 む10m1の 寒 天 培 地 を シ ャ ー レ (85mm径)に 入 れ 平 板 と し,薬 剤 希 釈 液 を 含 ま な い 寒 天 培 地 を対 照 と した 。 プ レー トは,約1時 間 乾 燥 さ せ,滅 菌 ペ ー パ ー デ ィ ス ク(Toyo Roshi; 8M/M DIA,Thin)を 接 種 菌 液 に 浸 し,過 剰 の 液 は 濾 紙 で 除 き,た だ ち に 寒 天 培 地 上 に 張 りつ け た 。 そ の後,プ レ ー トを30℃ も し くは37℃ で 培 養 し た。 培 養 後,増 殖 し た菌 の 最 長 半 径 を ノ ギ ス で 計 測 し,こ の 値 を薬 剤 濃 度 の 対 数 値 に 対 し て プ ロ ッ ト し,IC5。 値 を 求 め た 。 IC5。値 は,対 照 の 菌 糸 発 育 を50%以 下 に 抑 制 す る 薬 剤 の 最 小 濃 度 と し た 。 微 量 液 体 希 釈 法
Procedure for disk method 1. Prepare agar plates containing
two-fold dilutions of drugs and dry agar surface at room
temperature for 1 h 2. Immerse a paper
disk in an inoculum suspension and place it on the agar medium 3. Incubate at 30 t for
3 days
4. Measure the radius of growth zone of fungi (excluding the 8 mm disk)
5. Prepare dose-response curves based on the radius at each drug concentration and estimate IC,D values of
antifungals for filamentous fungi
Fig. 1. Procedure for disk method. Details are described in Methods. A.fumigatusFP 1305の 分 生 子 液 を1×106 coni-dia/m1と な る よ う にPYGBに 接 種 した 。 次 に 各 種 濃 度 に 調 整 し た 薬 剤 の20μ1/we11を 入 れ た マ イ ク ロ プ レ ー ト(SUMILON(R), sumitomo)にPYG菌 液 の 180μ1/we11を 添 加 し マ イ ク ロ ミ キ サ ー(SANKO JUNYAKU)で 撹 絆 し,プ レ ー トは30℃ で3日 聞 饗 静 置 培 養 し た。 発 育 し た 菌 糸 の 濁 度 は マ イ ク ロ プ レー
ト リー ダ ー(lmmuno Reader, NJ-2001, Japan Inter Med)でAmを 測 り,IC50値 は デ ィ ス ク 法 と 同様 に 求 め た 。 重 量 法 液 体 希 釈 法 に 準 じて 行 っ た 。 実 験 条 件 は,試 験 管 に 最 終 量5m1と い う こ と を 除 い て微 量 液 体 希 釈 法 と同 様 に 行 っ た 。 所 定 培 養 後,試 験 管 内 容 液 を ミ リポ ア フ ィ ル タ ー で 濾 過 し,減 菌 水 で 洗 浄 後,120℃ で 一 晩, 乾 燥 させ た。 フ ィ ル タ ー 上 の 菌 体 は 績 子 天 秤 で 秤 量 し,菌 体 重 量 を 測 定 し た。IC5。 値 は デ ィ ス ク 法 と同 Test condition; SDA PYGA PDA YNBDA
Fig. 2. Effects of inoculum size, incubation
tem-perature
and agar medium on mycelium
growth of Aspergillus fumigatus 8004.
Read-ings were made daily for 2 to 6 days. The
averages of triplicate measurements are
plot-ted.
Table 1. Effects of inoculum size, incubation tem-perature and agar medium on mycelium growth 4 days after inoculation of Asper-gillus niger FP 1398
Zone radius (mm)
Inoculum size: 0 1 •~ 104, h) 1 •~ 108 conidia/ml. Averages of triplicate measurements are given.
様 に 求 め た。 画 線 法 寒 天 プ レ ー トは デ ィス ク 法 と 同様 に 鯛 整 し,こ れ に 1×106conidia/mlの 菌 液 を 画 線 幣 抹 器 で 接 種 し た 。 プ レ ー ト は30℃,3日 間 培 養 し,MICは 増 殖 が 抑 制 され て い る 薬 剤 の 最 小 濃 度 と し た 。 II,結 果 デ ィス ク 法 の 操 作 手 順 糸 状 菌 の 分 生 子 を デ ィ ス ク を用 い て 寒 天 培 地 に接 種 す る と,放 射 状 に 菌 糸 が 発 育 す る の で,培 地 上 の 菌 の 増 殖 域 の 最 長 半 径 を ノ ギ ス で 測 定 し た。 詳 細 は方 法 の 項 お よ びFig,1説 明 文 に記 載 した 。 A.fumigetusの 菌 糸 発 育 Aspergillus spp,の3株 に つ い て,4種 類 の 寒 天 培 地 上 で のA.fumigatus8004の 菌 糸 発 育 に 対 す る 温 度,お よ び 接 種 菌 量 の 影 響 を検 討 し た(Fig.2)。 使
Fig. 3. Outgrowth pattern of Aspergillus spp. on disk-inoculated plates and its regres-sive response to amphotericin (AMPH) and flucytosine. Disks contained Asper-gillus fumigatus FP 1305 (upper), Aspergillus niger FP 1398 (left) and Aspergillus flavus FP 1022 (right). Tests were made on SDA medium with an inoculum of 1 x 106 conidia/ml incubated at 30•Ž for 3 days.
944
CHEMOTHERAPY
SEPT.1993 用 し た培 地 種 に よ っ て 菌 糸 の 発 育 速 度 が か な り異 な っ た 。 し か し,い ず れ の 培 地 に お い て も増 殖 は接 租 菌 量 の 影 響 を 大 き く受 け な か っ た。 成 艮 速 度 は30℃ よ り 37℃ の ほ うが 速 か っ た が,2∼6日 目 ま で 直 線 的 で あ っ た。 これ らの 結 果 は菌 糸 発 育 が 試 験 期 間 中,初 期 の 速 度 の ま ま進 ん だ こ と,さ ら に菌 糸 の 成 長 が 一 点 で の み お こ る と い う こ と を 示 唆 す る 。 同 様 の 結 果 はA. fumigatus FP1305で もみ られ た が,37℃,PYG培 地 で は そ の 速 度 は 減 少 し た 。Table1はA.nigerの4 日 目 の 菌 糸 半 径 を 示 し た が,A.fumigatusの 場 合 と は 異 な り,37℃ よ り も30℃ の 方 が 成 畏 は速 く,か つ, 接 種 菌 量 の 影 響 は ほ とん ど み られ な か っ た 。 抗 真 菌 剤 の 菌 糸 発 育 抑 制 とIC5。 値 Aspergillus spP.の3株 の 菌 糸 発 育 に 対 す るAMPH -Bお よ び5-FCの 抑 制 の 様 子 をFig .3に 示 した。実 験 は,SDA培 地 で30℃,3日 間 で 行 っ た が,3株 と も,薬 剤 の 有 無 に か か わ ら ず 放 射 状 の 菌 糸 を形 成 し た 。 対 照 の 発 育 半 径 はA.fumigatus FP1305,17.8 mm;a.niger FP1398,24,1mm;A.flavus FP1022, 10.9mmで あ っ た 。 これ に対 し,AMPH-B0.2μg/ mlで は 菌 糸 は 対 照 とほ ぼ 同 じ 発 育 を 示 し,抑 制 効 果 は認 め ら れ な か っ た 。 さ ら に1.56μg/mlで 部 分 抑 制 を,12,5μg/mlで は 完 全 抑 制 を 示 し た 。 薬 剤 が5-FCの 場 合 も 同 様 に 用 量 依 存 的 な 抑 制 効 果 が み ら れ た 。SDAお よ びYNBDAを 用 い た 場 合 のA.fumiga-tus FP1305に 対 す るAMPH-B,MCZ,FLCZお よ び5-FCの 用 量 反 応 曲 線 をFig.4に 示 し た。 各 培 地 の 抑 制 曲 線 は両 培 地 間 で 異 な り,特 に5-FCはYNBDA 培 地 で 強 く拮 抗 さ れ1),曲 線 が 高 濃 度 側 に移 動 した 。 デ ィス ク法 と他 の 方 法 との 比 較 デ ィス ク法 と従 来 法(微 量 液 体 希 釈 法,重 量 法,寒 天 平 板 希 釈 法)問 の 測 定 値 を 比 較 し た 。 こ の 場 合, PYG培 地 を使 用 しA.fumigatusに 対 す る各 種 抗 真 菌 剤 のIC5。 値 な らび にMICをTable2に 示 し た。 そ れ ぞ れ の 方 法 で 得 たIC、。値 を 薬 剤 別 に 比 較 す る と, AMPH-Bお よ びMCZの 場 合,3方 法 の う ち,デ ィ ス ク法 と微 量 液 体 希 釈 法 の値 が2倍 以 内 で 近 似 し相 関 が み られ た の に 対 し,5-FCは 菌 株 に よ っ て 両 方 法 間 で 値 が 大 き く乖 離 す る株 が み られ 相 関 しな か っ た 。5-FCの 場 合,い ず れ の 方 法 間 で も,測 定 値 の 相 関 性 は 認 め ら れ な か っ た 。 また,試 験 菌3株 に対 す る 各 真 菌 剤 のIC50値 を 測 定 方 法 別 で み る と,デ ィ ス ク 法 の 場 合 い ず れ の 薬 剤 で も2倍 以 内 の 変 動 で あ っ た が,他 の 2方 法 で は値 の変 動 幅 が 大 き くな り,株 に よ る測 定 誤 差 と思 わ れ た。 SDA YNBDA
Fig. 4. Dose-response curves of amphotericin (AMPH), fluconazole (FLCZ), miconazole (MCZ) and flucytosine for Aspergillus
fumi-g atus FP 1305. Test was made on an inoculum of 1 x 106 conidia/ml incubated at 30•Ž for 3 dyas. IC50 values were estimated as 50% inhi-biti on points on the curves and are indicated
in Table2.●,AMPH;■,FLCZ;★,MCZ;▲, 5-FC. デ ィ ス ク 法 の 感 度 FLCZのA.fumigatus FP1305に 対 す る 用 量 依 存 曲 線 に つ い て3方 法 間 で 比 較 しFig.5に 示 し た。 FLCZの 静 菌 的 な 作 用 を デ ィ ス ク法 が も っ と も鋭 敏 に と ら え(<10μg/ml)て い る 。 し た が っ て,デ ィス ク法 は感 度 の 良 い試 験 法 で あ る こ とが 明 ら か で あ る。 III.考 察 今 回 の 報 告 で は,菌 糸 成 長 の 抑 制 を 薬 剤 活 性 の指標 と し た 。 糸 状 菌 は個 体 培 地 上 で,接 種 点 を 中 心 に し て,放 射 状 に 発 達 し た 菌 糸 を 形 成 す る の で,真 菌 の成 長 速 度 は そ の 半 径 で 表 す こ とが で きる 。 また,デ ィス ク 法 は 円 形 の 菌 糸 を 形 成 す る こ とが 前 提 で あ る の で, 不 規 則 な コ ロ ニ ー を形 成 す る菌 に は適 さ な い。 菌 糸 は本 質 的 に は そ の 先 端 で伸 長 す る た め,細 胞膜 や 細 胞 壁 に対 し て 阻 害 活 性 を有 す る抗 真 菌 剤 は これ ら
Table 2. A comparison of various IC,. and MIC values for 3 strains
of Aspergillus funsigatus
(ƒÊg/m1)
Tests were made on PYG medium with an inoculum of 1•~ 10' conidia/ml at 30t for 3 days.
Disk; Disk method, A,20; turbidmetric method, wt; dry weight method, MIC; streak method.
Fluconazole
Fig. 5. A comparison of dose-response curves of
fluconazole for Aspergillus fumigatus FP 1305
obtained by the disk method and traditional
mycological methods. Details are described in
the legend to Table 2. disk, disk; wt., dry
weight; A620, turbidmetric method.
の過 程 で最 大 限 に そ の 活 性 を発 揮 し て い る と推 定 さ れ る。AfUm細t粥 の 菌 糸 発 育 は 一 定 速 度 で 進 み,接 種 菌 量 の 影 響 を ほ と ん ど 受 け な か っ た(104vs106 conidia/m1)こ と か ら,我 々 の デ ー タ ー は 部 分 的 に で はあ るが 先 端 発 育 を 支 持 す る。 こ れ ら の 結 果 は菌 糸 先端 で の伸 長 速 度 は接 種 さ れ た 分 生 子 の 量 で は な くて その部 位 で の 菌 の"生 育 力(viability)"に 依 存 す る こ とを示 唆 す る。 し た が っ て,デ ィ ス ク 法 で 得 ら れ た IC5。値 は菌 糸 が そ の 先 端 で 伸 長 し よ う と す る 生 育 力 を50%抑 制 す る 薬 剤 濃 度 と解 釈 さ れ,IC50値 も接 種 菌 量 に 影 響 され な か っ た(デ ー タ ー 示 さ ず)。 次 に,デ ィス ク 法 に お い て 使 用 し た菌 が 直 線 的 に 成 長 す る事 実 は,薬 剤 が 絶 え ず 一 定 の 生 育 力 を もつ 成 長 点 に接 し続 け る とい う特 長 を 有 す る。 また,測 定 感 度 の 点 か ら はFLCZの 例 で 示 し た 通 り,微 量 液 体 希 釈 法 や 菌 体 重 量 法 に比 べ て 感 度 良 く測 定 で き る こ とを 示 した 。 一 方,A. fumatusの 病 原 性 は,病 原 因 子 と 免 疫 反 応 に よ っ て,規 定 さ れ る と さ れ て お り13,14),病原 因 子 と し て は組 織 へ の 侵 入 を促 進 す る と考 え られ る 各 種 の 酵 素 や 毒 素 を 分 泌 し て い る15∼17)。ま た,Arruda ら 玉鱒)は 細 胞 毒 性 活 性 を 有 し,炎 症 反 応 を 引 き起 こ すA.fumigatusのAsp fIは 増 殖 の 初 期 の 過 程 で 放 出 さ れ,胞 子 に は ほ と ん ど 含 ま れ な い こ と を,さ ら に,Wostenら20)はA.nigerの グ ル コ サ ミ ラ ー ゼ の 分 泌 が 主 と して,成 長 し て い る菌 糸 の 先 端 で お こ り, 増 殖 を止 め る と 分 泌 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し て い る。 こ の よ うな 観 点 か ら,も し 糸状 菌 の プ ロ テ ア ー ゼ や 毒 素 が 同 じ よ う な 機 構 で 分 泌 さ れ る な ら ば,菌 糸 先 端 の 発 育 速 度 を測 定 す る こ と は抗 真 菌 剤 の ス ク リー ニ ン グ や 評 価 に と っ て,よ り重 要 な 意 義 を も つ と考 え て い る 。
文
献
Anti-946
CHEMOTHERAPY
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