氏 名
学 位1の 種 類
学 位 記 番 号学位授与年月日
学位授与の要件
学位論文題 目
あでる あぶでる あじず いすまいる はっさん はぐらす ＡＤＥＬ ＡＢＤＥＬ－ＡＺＩＺＩＳＭＡＩＬ ＨＡＳＳＡＮ ＨＡＧＲＡＳ博士（農学）
甲第380号
平成17年 9月22日
学位規則第4条第1項該当
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＵｔｉｌｉｔｙｏｆＢａｒｌｅｙＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ（ＥＳＴ）Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ．ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｌｉｅｎ ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓＡｄｄｅｄｔｏＷｈｅａｔＧｅｎｅｔｉｃＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ（コムギの遺伝的背景に添加された異種染色体用オオムギ
ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ（ＥＳＴ）マーカーの開発と利用）学位論文審査委員 （主査） 辻 本 寿
（副査）
富田因則
中 田 昇学位論文 の 内 容 の 要 旨
Ｒｅ1ａｔｅｄ ａｎｄ ｗｉｌｄ ｓｐｅｃｉｅｓｉｎ Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａ ｒｉｃｈ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｏｆ ｕｓｅｆｕｌ ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｅｘｐｌｏｉｔｅｄ ｆｏｒｗｈｅａｔｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｈｅａｔ ａｎｄ ｓｏｍｅｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｌｉｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ， ｃｏｖｅｒｉｎｇａｗｉ′ｄｅｒａｎｇｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎＴｒｉｔｉｃｅａｅ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，1，165ｂａｒｌｅｙＥＳＴｐｒｉｍｅｒｓｅｔｓ ＷａＳｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｓｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ・Ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｅｒｉｅｓ．ＳｅｒｉｅｓＩ ｗａｓ ｒａｎｄｏｍｌｙ Ｃｈｏｓｅｎｆｒｏｍｐｏｏｌｏｆ ｔｈｅｂａｒｌｅｙＥＳＴｐｒｉｍｅｒｓｅｔｓ．Ｗｈｉｌｅ，ｔｈｅｒｅｍａｉｎｉｎｇ ｔｈｒｅｅｗｅｒｅｐｒｅ－ＳＣｒｅｅｎｅｄ ｉｎ ａ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｓｔｕｄｙ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｎｄ ｃｏ－ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂａｒｌｅｙ ａｎｄ Ｗｈｅａｔ．Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ5ｅｔＳ ｔｈａｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ22ｔｏｌＯＯ％；ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｆｒｏｍ29ｔｏ75％ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｔｏ ｗｈｅａｔ．Ｔｈｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓｉｎ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ．ｉｒ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ ｂａｒｌｅｙ．Ａ ｌａｒｇｅ、ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒｓ（78－859）ｂｅｔｗｅｅｎ ｅａｃｈ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｗｅｒｅ Ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｓｅｍａｒｋｅｒｓｗｏｕｌｄｂｅａｖａｌｕａｂｌｅｔｏｂｌｉｎｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｈｅａｌｉｅｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓａｄｄｅｄ ｔｏｗｈｅａｔｇｅｎｅｔｉｃｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｙｗｏｕｌｄｂｅｕｓｅｆｕｌｉｎｔｈｅｂａｓｉｃａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｅｄ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｌｄ Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ ｓｐｅｃｉｅｓ． ＦｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｕｓｉｎｇｂｏｔｈｉＤＳｊｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎａｎｄｂａｒｌｅｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ（ＥＳＴ）ｍａｒｋｅｒｓｔｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅａｎｄｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｏｆ且ｃｈｌｌｅｎｓｅｗｉｔｈＥ ｖｕｌｇｗｅ． ＦＩＳＨｗｉｔｈ ｆｏｕｒ ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＡＧ，ＡＡＧ，5Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ45Ｓ ｒＤＮＡ，ＷａＳ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ且 Ｙｕｌｇａｒｅ，Ｅ ｃｈＩｌｅＤＳｅ ａｎｄ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｗｈｅａト且 ｃｈｊｌｅＤＳｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ 216ａｎｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅ ＡＡＧ ｒｅｐｅａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｔｈｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ且 ＣｈＩｌｅＤＳｅａｎｄ且 ｖｕｌｇａｒｅ．Ｔｈｅ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ＦＩＳＨ ｓｉｇｎａｌｓｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｉｆｆｅｒ ｇｒｅａｔｌｙ． Ｔｈｅ45Ｓ ｒＤＮＡ ｓｉｇｎａｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｏｎ ｔｗｏ ｐａｉｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｉｎ ｂｏｔｈ ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ 5Ｓ ｒＤＮＡ ｓｉｇｎａｌｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｏｎ ｆｏｕｒ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｉｎ Ｅ ｖＬ（1ｇａｒｅａｎｄ ｏｎ ｏｎｅ ｐａｉｒ ｉｎ 且 ｃｈｊｌｅＤＳｅ．Ｔｈｅ ＡＧ ｒｅｐｅａｔ ｓｈｏｗｅｄ ＦＩＳＨ ｓｉｇｎａｌｓ ａｔ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ 且 ｖｕｌｇａＩ・ｅ ｂｕｔ ｎｏｎｅ ｏｆ Ｈ ｃｂｌｌｅＤＳｅ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｒｅｈｉｇｈｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ．Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｈｏｍｏｅｏｌｏｇｙ ｂｅｔ甘ｅｅｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ，209ＥＳＴ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｅ ｖｕｌｇａｒｅｗｅｒｅ ａｌｌｏｃａｔｅｄ ｔｏｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｏｆ且 ｃｈＩＩｅｎｓｅ．Ｏｎｅ ｈｕｎｄｒｅｄ ａｎｄ ｆｏｒｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＥＳＴ ｍａｒｋｅｒｓ ｗｅｒｅ ａｌｌｏｃａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ Ｈ ｃｈＩｌｅＤＳｅｕＳｉｎｇ ｔｈｅ ｗｈｅａｔ，且 ｃｈｌｌｅＤＳｅａｄｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ占ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｌｉｎｅｓ． Ｔｗｅｎｔｙ－ＳｉｘＥＳＴｍａｒｋｅｒｓｏｎａｖｅｒａｇｅｗｅｒｅａｌｌｏｃａｔｅｄｔｏｅａｃｈｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｘｃｅｐｔ ｔｏｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ 2ＨＣｈｓ ｔｏ ｗｈｉｃｈ ｏｎｌｙｌＯｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅａｌｌｏｃａｔｅｄ．Ｎｉｎｅｔｙｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅａｌｌｏｃａｔｅｄＥＳＴｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ且 ｃｈｉｌｅｎｓｅ ｗｅｒｅ ｐｌａｃｅｄ ｏｎ 且 ｖｕ1821ｒｅ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｈｏｍｏｅｏｌｏｇｏｕｓ ｇｒｏｕｐ， ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ ｔｈｅｔｗｏｓｐｅｃｉｅｓ．ＴｈｅｓｅＥＳＴｍａｒｋｅｒｓｗｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｆｕｌｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｈｔｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｓｅ ｓｐｅｃｉｅｓｉｎｔｏ ｔｈｅ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｏｍｅ．
論 文審 査 の 結 果 の 要 旨
コムギ連（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）は、コムギ、オオムギ、ライムギ、および牧草を含む分類群であるが、 これらの栽培植物以外に300種以上の野生植物の種を含む。コムギやオオムギのような重要穀 類では、最近のゲノム科学研究の中で、ＤＮＡマーカーや長鎖ＤＮＡを含むクローンのライブラリ ーなど、遺伝子解析のための研究基盤が整備されており、全ゲノム解読に向けた取り組みがなさ れている。これに対し、野生種は、世界に広く分布し、多様な繁殖・生殖様式をもち、多くの生 物・環境ストレスに対する抵抗性遺伝子をもつため、コムギやオオムギを大幅に改良するために、 重要な遺伝資源であるにもかかわらず、研究基盤はおろか、系統関係さえ十分に把握されておら ず、そのため、これら野生種を栽培植物の遺伝資源として十分活用できていない。 最近、オオムギにおいて、発現遺伝子を部分解読するＥＳＴ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ）プロジ ェクトが進み、この塩基配列の情報を利用して多数のＰＣＲプライマーが作成された。この大量の ＥＳＴマーカーを利用して、オオムギの遺伝分析が進められ、オオムギ育種のために、きわめて重 要な研究基盤としての役割を果たしている。本学位論文は、このオオムギの‘ＥＳＴマーカー’の 中から、野生植物用においても用いることのできるＰＣＲマーカーを選抜し、さらに、それによっ て、野生種のゲノムが詳細に解析できることを示すものである。 第一章は、オオムギのＥＳＴマーカーの中から、野生種用として選抜するための研究について記 述している。コムギ連の種から、多様な生態的変異を示し、かつコムギの遺伝的背景に染色体添 加されているものを中心に、10種を選び、対象としてコムギとオオムギを加えた全12種のゲノ 217ムＤＮＡを鋳型として、オオムギのＥＳＴマーカーのプライマーを用いてＰＣＲを行ったいオオム ギＥＳＴプライマーは、プレスクリーニングめ結果に基づき4シリーズに分け、合計1，165のプラ イマーセットを調査した。その結果、多くのオオムギマーカーがオオムギ以外の種でも明瞭な ＤＮＡ断片を増幅することが明らかとなった。また、その中には、コムギと野生種間で多型を示す ものも多く含まれていた。これらマーカーの選抜の結果、野生種やライムギにおいて258～820 ものＰＣＲマーカーを一挙に作ることができた。コムギ連の植物のゲノム基本数は7であるので、 染色体当り、平均11・122マーカーを開発したことになる。マーカーとして使えるものは、オオム ギとの類縁度が高いものに多く、逆に、その結果から、用いた野生種の額縁度を議論している。 第二章では、野生種助ねび皿ｄＪゐ月βｅの染色体を添加したパンコムギ系統を用いて、第一章 で得た208マーカーを、各7本の染色体に割り振り、実際にこれらのマーカーの野生種ぺの適用 性を調査したものである。その結果、このうちの140マーカーの座乗染色体を決定することがで きた。全体の90％のＥＳＴマーカーが、オオムギと同じ同祖群に存在しており、とくに、第4同 祖群染色体のマーカーは両種で100％一致していたおり、両種ゲノムはきわめて類縁性の高いも のであることが明らかとなった。染色体を同定できなかったマーカーには、添加系統が利用でき なかった染色体上に座乗するものが多いものと推測される。一方、様々なプローブを用いた蛍光 元＝玩知ハイプリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）によって、同種とオオムギゲノムの染色体の形態を 調査した。まず、ＦＩＳＨによる染色体の研究では、用いたＡＡＧサテライト、ＡＧサテライト、お よび5ＳｒＤＮＡのいずれにおいても、両ゲノムがきわ、めて異なった形態を示すことが明らかになっ た。このように、発現遺伝子レベルと染色体レベルの分析結果は大きく異なった。その理由とし て、染色体形態の指標となる反復配列は、発現遺伝子に基づくＥＳＴマ∵カーより変異性が高いも のであると結論付けている。 これら研究の結果は、ゲノム科学が進展して整臆されてきた作物の分子マーカーを野生植物の 研究に適用できることを明瞭に示したことが評価される。また、この論文で大規模に開発した多 数のマーカーは、今後、野生植物の遺伝的変異をコムギへ利用促進のための、研究基盤としてか 活用されるものである。このような理由で、本論文は、学位論文として求められる水準に十分達 しているものと判断した。 最終試験の結果の要旨 本審査会（上記の主査および副査の5名）は、平成17年7月30日に、鳥取大学において、学位 論文公開審査会を開催し、学位申請者であるＡｄｅｌＨａｇｒａｓ氏に学位論文の説明を求め、その内容 について質疑応答を行った。さらに、関連事項に？いても諮問を行った結果、いずれについても 満足のいく回答が得られた。語学については、英語での論文執筆、論文発表での受け答えから判 断して、十分能力のあるものと判断できた。識見については、現在も自国の農業研究センターの 職員であり、自国の農業全般について深い認識がある。また、所属研究室内におけるシニア大学 218
院生としての役割も大きく果たし、教員、学生からの信望も厚い。以上のことから、本審査会は、 同人を大学院農学研究科論文博士としての学力、識見を有する一と認め、博士（農学）の学位を与える に十分な資格を持つものと判定した。
