研究報文
マ ウス抗 体 ク ラス ス ィ ッチ 過 程 の
速 度 論 に基 づ く解 析
宮 田 堅司
Analysis
for the Class Switching
Process
of mouse by Rate Theory
Kenji Miyata
Summary
The class-switching process of immunoglobulin(Ig) gene-transcribing cells was investigated in the thymus
of BALB/c female mice. The ratios of IgM,IgG1,IgG3 and IgE-transcripts were determined with aging by
realtime PCR. Logarithmic values of IgG1/1gM and IgG3/IgM increased rapidly from birth to several weeks
and then gradually. While that of IgE/IgM increased similarly to about 7.5 weeks and it decreased afterwards.
Rate theory was applied to analyze these results with supposing both that transcript-quantity was
proportional to the number of transcribing cells and that IgM-transcribing cells were supplied continually from
stem cells in vivo. On the first order differential concurrent model, in which IgM cells recombined Ig genes and
changed to other Ig class-transcribing with rate constants k, the rate equations were solved theoretically. The
calculated values of logIgGl/IgM and logIgG3/IgM were good agreement with experimental ones for periods
up to 400 days after birth. But, in the case of logIgE/IgM, which had a maximum, this theory could not agree
the maximum value.
( Received September 8, 2011)
1.は じ め に 胸腺 は,発 生期 に 原基 に流入 した 幹細 胞 に 由来 す るTリ ンパ 球 が ポ ジテ ィ ブ ーネ ガ テ ィブ選 択 を受 け 分 化 増 殖 す る一 次 リ ンパ 性 器 官 と され て い る1),z)。 しか し,マ ウス胸 腺 で は,胎 生 期 か ら抗 体 遺 伝 子 の 転 写 産物 が 検 出 され,生 後 に は ク ラス ス ィ ッチ 現象 も認 め られ る こ と3),ま た,少 な く と もlgE転 写 に 関 して は脾 臓 とは異 な る こ と を示 した4>。 ま た,抗 体 μ鎖 遺伝 子 の 転 写 産物 の う ち,膜 結 合 型lgMの 転 写 産 物 量 の加 齢 に伴 う変 化 を リ ア ル タ イ ムPCR法 で 調 べ,加 齢 に伴 うIgMの 膜 結 合 型 か ら分 泌 型 へ の 変 化 を,転 写 量 が 転 写細 胞 数 に比 例 す る と仮 定 す れ ば,細 胞 の分 化 過 程 を一 次 並列 反 応 の 速 度論 で解析 で きる こ と を示 した5)。 本 報 で は,リ ア ル タ イ ム PCR法 に よ り,マ ウス胸 腺 で のIgM, IgGl, IgG3お よびlgEの 転写 量 比 の加 齢 変 化 を測 定 し,そ の 結 果 を細 胞 分 化 の 速度 論 で説 明で きる こ とを明 らか に し た 。 また,胸 腺 で のT細 胞 受 容 体 の β鎖(TCR Q) とlgMの 転 写 量 比 も測 定 し,マ ウ ス胸 腺 に はTリ ン パ 球 だ け で な く,Bリ ンパ 球 系 の 細 胞 が存 在 し続 け る こ とを示 唆 した 。 II,方 法京都女子大学食物栄養学科栄養学第二研究室
1.材 料 コ ンベ ンシ ョナ ル な条 件 下 で飼 育 したBALB/c雌 マ ウス を用 い た。 出 生 後3週 間 は母 親 マ ウス と同 居 させ,21日 齢 で分 離 した。 固形 試料(MF,オ リエ ン タル酵 母)お よび水 道水 は 自由 に摂 取 させ た。 頚 椎 脱 臼 させ たマ ウ ス を開胸 し胸 腺 を摘 出 した。 摘 出 し た 試料 はサ ンプ ルチ ュー ブ に入 れ,直 ちに液 体 窒 素 中で 凍結 した 後 一80℃ で保 存 した。2. 卜一 タ ルRNAの 抽 出 お よ び 逆 転 写 反 応 凍 結 し た 組 織 よ り,酸 性 グ ア ニ ジ ン チ オ シ ア ン酸 一フ ェ ノ ー ル ーク ロ ロ ホ ル ム 法 に よ っ て ト ー タ ル RNAを 抽 出 し た6)。 精 製 し た トー タ ルRNAを,濃 100ng!,u 1に 調 整 し た 水 溶 液3μ1を 鋳 型 と し て 逆 転 写 反 応 を 行 っ た 。 逆 転 写 反 応 はM-MLUリ バ ー ス トラ ン ス ク リ プ タ ー ゼ(ReverTra Ace一 α,東 洋 紡), oligodT20プ ラ イ マ ー を 用 い,30℃ で10分 間,さ ら に42℃ で20分 間 行 っ た 。99℃ で5分 間 処 理 す る こ と に よ り反 応 を 停 止 さ せ る と と も に 鋳 型RNAを 分 解 し た 。 こ の 反 応 産 物 を 水 で15倍 に 希 釈 し た 溶 液 を リ ア ル タ イ ムPCRの 試 料 溶 液 と し た 。 3.リ ア ル タ イ ムPCR イ ン タ ー カ レ ー タ ー 法 リ ア ル タイ ムPCR(LineGene, BioFlux)の 反 応 溶 液 は メ ー カ ー の プ ロ トコ ー ル に 従 い, SYBR Green mix(Real time PCR Master Mix,東 洋 紡) 7.5μ ￠,forward primerお よ びreverse primer(4 pmol/
μ の を 各1.5μ2,試 料 溶 液4.5μ β,合 計15μ4と し た 。PCR反 応 は,95℃10分 の 前 処 理 後,変 性94℃ 15秒,ア ニ ー リ ン グ60℃15秒,伸 長 反 応72℃30秒 の サ イ ク ル を45回 行 い,各 サ イ ク ル の 伸 長 反 応 終 了 時 毎 に 蛍 光 強 度 を測 定 し増 幅 曲 線 を得 た 。 さ ら に,増 幅 反 応 終 了 後 に 増 幅 さ れ たDNAの 融 点 解 析 を 行 い,増 幅 さ れ たDNAが 均 一 な も の で あ る こ と を 確 認 し た 。 増 幅 反 応 に 用 い た プ ラ イ マ ー を 表1に 示 し た 。 い ず れ の プ ラ イ マ ー も,少 な く と も 一 つ の イ ン トロ ン 領 域 を 間 に 含 む エ ク ソ ン領 域 に 相 補 的 に 結 合 す る よ う に 設 定 し た 。 こ れ ら の プ ラ イ
マ ー に よ り,IgM, IgGl, IgG3, IgEお よ びTCR/3 の 場 合 と も に,110塩 基 対 のDNAフ ラ グ メ ン トが 増 幅 さ れ る 。 4.転 写 量 比 の 測 定 リ ア ル タ イ ムPCRの イ ン タ ー カ レ ー タ ー 法 で は, 増 幅 さ れ た2本 鎖DNAに 取 り 込 ま れ た 色 素 が 励 起 さ れ て 発 す る 蛍 光 強 度 を測 定 す る こ と に よ り,増 幅 曲 線 が リ ア ル タ イ ム に 得 ら れ る 。 増 幅 曲 線 よ り蛍 光 強度 が 一 定 値 に達 す る ま で に 要 したPCRの サ イ ク ル数nを 読 み 取 っ た。 た とえ ば,試 料 溶 液 中 に存 在 したIgGlとIgMと の コ ピー 数 比(転 写 量 比)の 常 嗣 雛1・ ・lgCIIgMは① 式 で 求 め る こ とカ・で きる5} IgCl log =(ηM‐ttc ;)log2… ① IgM こ こで,nMお よびnciは,そ れぞ れlgMの 増 幅 曲線 お よ びlgGlの 増 幅 曲線 の 蛍 光 強 度 が 一 定 値 に達 す るの に要 した サ イ ク ル数 で あ る。
皿.ク ラ ス ス ィ ッチ 過程 の 速 度 論
抗体 産生 細 胞 の分 化 過程 に おい て,抗 体 遺伝 子 は μ鎖 お よびL鎖 の 可変 領 域 の 再 編成 の後 に転 写 され 始 ぬ 膜 結 合 型 のlgMが 産 生 され る7)。そ の後,分 化 成 熟 す る 問 に分 泌 型 のIgMや,他 の ク ラス の抗 体 を産生 す る様 に な る。 転写 量 はそ の転 写細 胞 濃 度 に 比 例 す る と仮 定 し,IgM転 写 細 胞 か ら他 の ク ラス の 転 写 細 胞 へ と分 化 す る過 程 を並 列 反応 とみ な した 。 抗 体 の ク ラス ス ィ ッチ 過 程 は,1つ の抗 体 産生 細 胞 で は一 度 だ け起 こ る現 象 とさ れ てい るの で,IgM転 写 細 胞 か らIgGl転 写 細 胞 へ の 分 化 過 程 を図1の 様 に表 した。 IgMを 転 写 す るM細 胞 か らIgGlを 転 写 す るG1細 5」 至_Mk,_G1_墾 →Breakd。wn＼Z_B_k蜘
k, 図11gGl転 写 細 胞 の分 化 過程 IgM転 写細 胞 くM)か らク ラス ス ィッチ に よ りIgGl 転 写 細 胞(G1)へ 分 化 す る 過 程 お よびIgD以 外 の そ の他 の ク ラス の 転 写細 胞(Z)へ と分 化 す る過 程 を並 行 過 程 で 表 し た。Sは 躍 細 胞 の 前 駆 細 胞, あ る い は 幹 細 胞 を 表 し,M細 胞 を供 給 し続 け る と 仮 定 した。G1細 胞 お よ びZ細 胞 は,そ の 後 機 能 を 失 う か,破 壊 さ れ る。kは 各 過 程 の 分 化 の速 度 定 数 を表 す 。 IgM IgGl IgG3 1gE TCRβ For. Rev ACGTGTCCTCCACATGTGCT TGGCAAGGAGTTCAAATGCA AGGAGTTCAAATGCAAGGTC AAGAACTTCACATGCCACGT ACCCAAACCTGTCACACAGA ACAGGTCAGGTTAGCGGACT GAATGGTGTACACCTGTGGA GTGGGGGTATGGTGTATACT GATGAATGGAGTAGCTCCAA CATAGAGGATGGTTGCAGAC 表1PCR反 応 に も ちい た プ ライ マ ー こ れ らの プ ライ マ ー は,少 な くと も一 つ の イ ン トロ ン領 域 を間 に含 む エ ク ソ ン領域 に相 補 的 に結 合す る よ うに 設定 した。 い つ れの 場 合 に も110塩 基 対 のDNA鎖 が増 幅 され る。k, M-一 →>Gl
Z
図2 一 次並 行 反応 モ デ ル この 過 程 の 速度 式 を解 く場合 に,M細 胞 の濃 度[瑚 は初期 濃 度[胡oに 保 た れ る と仮 定す る。 う こ とが 可 能 で あ る。N.結
果 お よ び 考 察
IgGlの 場 合,・ ・留 は1・導 に対 して`まぼ 直 線 的 に 増 大 した(図3)。 胞 へ 分 化 す る 過 程 の速 度 定 数 をk,,lgGl以 外 の ク ラ ス の抗 体 を転 写 す る細 胞 へ 分化 す る過 程 の速 度 定 数 をkZと した 。 ko, k3お よびk4の 過 程 を含 む 速 度 式 を 解 くこ とは 困 難 な の で,図2に 示 した並 行 反 応 分 化 過 程 の速 度 式 を考 え る と,図31gGl転
写細胞分化過程速度定数の決定
1・鵜 測 定 値 を1・gtに 対 し て プ ・ ・ ト し た.1・gt≦ ウ 1の 領 域 で 傾 き1の 直 線 を 外 挿 しlogk1=-2.88と 求 め た ・ 訟 ・が 大 き い 徽 で1・・意 一一・).CiEiと求 め た ・ とな る。 これ らの速 度式 を解 く際 に,生 体 内 で は前 駆 細胞 あ る い は幹 細 胞 を表すS細 胞 か らM細 胞 は 供 給 され 続 け る と考 え られ るの で,M細 胞 の 濃 度[瑚 は ほ ぼ一 定 に保 た れ初 期 濃 度[瑚oに 等 しい とお くこ とに よ り,図1のko過 程 を考慮 す る と,bgl留 一bg毒{1一 囲
… ⑤
とな る。 この 式 の[Gl]お よび[瑚 をlgGlお よびlgM で 置 き換 え れ ば ① 式 とな り,こ の 式 が 転 写 量 比 の 理 論値 を与 え る。 ⑤ 式 は,t》1の 場 合, [Gl]-kllog [M]-logkl+k,… ⑥ t《1の 場 合, Gllog M]=logt・logkl… ⑦ と な り,加 齢 に 伴 いIU・[C;1]LMJは一 趨 ・近 づ く こ と が 予 測 され旧 齢 の高 い領域 の働 蒙 ちを求 め る こ とが 可 能 で あ る・ 一 方,・ ・留 を 亙・gtに対 して プ ・ 日齢tが 大 きい徽 よ]n・ 留 紫 梶一姻 ・とな りk'=0.248k,+kZが 得 ら れ た ・ ま た1・gtが1よ り小 さ い 領 域 に お い て,傾 き1の 直 線 と縦 軸 と の 交 点 よ り k,=0.0015(1/d)が 得 ら れ た く表2)。 loglgGl/lgM loglgG3/lgM loglgE/lgMkl(l!d)
kl/kl+kZ 0.0013 /11!・ 0.00021 0.22 0.035 0.038 ロ トす る と,日 齢 の低 い 領 域 で は傾 き1の 直 線 と な る こ とが 予 測 され,logtを0に 外 挿 す る こ と に よ り k,を 求 め る こ とが 可 能 で あ る 。 しか し,t《1の 領 域 で 精 度 の 高 い 測 定 値 を得 る こ と は 困 難 な の で, logt《1の 領 域 で 傾 き1の 直 線 を利 用 してk,の 値 を 求 め る。 IgG3お よ びlgE転 写細 胞 に 関 して も同様 に取 り扱 表2ク ラ ス ス ィ ッ チ 過 程 の 速 度 定 数 k, 図3 ,4,お よ び5よ り 求 め たklお よ びk, tk=の 値 を 示 し た 。 ・・留 お よ びto・[E][M]を1・gtに対 して プ ・ ・ ト し た 結 果 を図4お よび5に 示 した。 図41・ ・lgG31gM-1・gtプ ・ ・ ト …lgG31gMの値 は1・gtに 対 し て 直 線 的 に 増 大 し た ・ ・・[G3][M]は1蝟 の 場 合 と同様 に1まぼ直 線 的 に増 大図51・ 彊 一1・gtプ・ ・ ト ・彊 の値 は1・gtが1 .6付 近 で極 大 と なっ た・ 図7・ ・lgG31gMの加 齢 変 化 表1に 示 した速 度 定 数 を用 い て 計算 した 理論 値 と良 く一致 した 。 図6・ ・1,gGIIgMの加齢 変化 ・・lgGlgl gM値 は生 徽 週 齢 の 間 に急c6・ 轍 し,そ の 後 ほ ぼ一 定値 とな った 。 表1に 示 した 速 度定 数 を用 い て⑤ 式 に よ り計 算 した理 論 曲線 も示 した。 図8・ ・lgElgMの加 齢 変化
竃鞭 鵬 調 繁 鱒
在するために・理論
し た ・ し か し,ln・ 腸 の 場 合 に は,1・gtが1鮒 近, す な わち 生 後7∼8週 齢 あ た りまで 直 線 的 に増 大 し,その後緩や かに低下 し極大値 が存在 した・・鵜
お
よ び ・・[E][M]の場 合 に 求 め たk,お よ びk,k ,+k.の 値 も 表2 に示 した 。 表2の 値 を用 い て⑤ 式 に よ り計 算 した理 論 値 と測 定値 の 日齢 変化 を 図6,7お よび8に 示 した 。 ・・陽 お よ びto・[G3][ M]の 場 合 に は,調 べ た 日 齢 領 域 に お いて 良 く一 致 し,胸 腺 内 で の分 化 過 程 を速 度 論 で 説 明 す る こ とが 可 能 で あ っ た ・]o・楊 の 場 合 に1ま 極 大値 が 存 在 す る た め に,図1に 示 した様 な1次 並 行 反応 に基 づ く速 度 論 で は 説 明 で きなか っ た 。速 度 式 で は反 応 物 質 の濃 度 に依 存 す る項 が 反 応 の駆 動 力 とな る が,IgEの 転 写 に関 して は濃 度 項 の 他 に別 の 駆 動力,あ るい は濃 度 項 へ の 影 響 が無 視 で きな い 因 子 が存 在 す る こ とが示 唆 され た 。 日齢 が 十 分 大 きい領 域 す なわ ち ク ラ スス ィ ッチ 反 応 が 麟 的 に進 む と考 え られ る領 域 で の 、皇。の ユ る 値 は,胸 腺 で ク ラ ス ス ィ ッチ を 行 う細 胞 の う ち, IgM転 写細 胞 か らlgGl, IgG3あ る い はlgE転 写 細 胞 へ と分 化 す る比 率 を表 わす と見 な す こ とが 可 能 で あ る 。 こ の値 はlgGIの 場 合 が 最 も大 き く,約22%で あ っ た。IgE転 写細 胞 お よ びIgG3転 写細 胞 へ と分化 す る 比 率 は,そ れ ぞ れ 約3%で あ り,胸 腺 で のIgE 転 写 細 胞 へ の分 化 の 割合 は意 外 に大 きか っ た。 血 中 のlgE抗 体 量 は, IgGlやlgG3抗 体 量 と比 較 す る と 極 微 量 で あ る こ とが 知 ら れ て い る8)。 この こ とは, 胸 腺 で検 出 さ れたlgEの 転 写 が胸 腺 に分 布 す る血管 内 に存 在 す るBリ ンパ 球 に由 来 す る もの で は ない こ とを示 唆 して い る。 す なわ ち,胸 腺 はTリ ンパ 球 が 分 化 成熟 す る器 官 と され てい るけ れ ども,抗 体 遺 伝 子 を転 写 す る細 胞 が 存在 し,ク ラス ス ィ ッチ も起 き て い る こ とか らす る と,Bリ ンパ 球 系 の 細胞 も分 化 す る 器 官 で あ る こ とが示 唆 され る。TCR QをTリ ン パ 球 の 指標,IgMをBリ ンパ 球 の 指 標 と して,こ れらの転 写量比器
の値 は生後 直働
ら徐 々に増大
し,お よそ10倍 まで 増 大 した(図9)。 この こ と は 胸 腺 にBリ ンパ 球 が存 在 し続 け る こ とを示 唆 してい る。 V.要 約 マ ウス胸 腺 で の抗 体 遺伝 子 の転 写 量比 の経 時変 化 を測 定 し,胸 腺 で も抗 体 の クラ ス ス ィ ッチ過 程 が起図91・9器
の加齢変化
加 齢 に伴 い徐 々 に増 大 し,20週 齢 あ た りか らほ ぼ 一 定 とな っ た。 きて い る こ と を示 唆 した。 また,ク ラス ス ィッチ 過 程 の細 胞 分 化 を一 次 並 行 反 応 とみ な す こ と に よ り, 測 定 結 果 を速 度 論 で解 析 す る 方法 を示 した 。た だ し, IgEの 結 果 に 関 して は,濃 度 項 が 分 化 反応 の 駆 動 力 で あ る反応 速 度 論 で は説 明 で きず,他 の 因子 を考 慮 した方 法論 が 必 要 で あ る こ とが判 明 した 。文献
1) I. Roitt, J. Brostoff and D. Male : Immunology, 5th
ed. (Mosby)
) , 158 (1998)
2) R. Rugh : The Mouse, Its Reproduction and
Development (Burgess Publishing) , 265 (1968)
3)安 達 綾 希 子,井 上 摩 耶,大 野 理 絵,城 清 佳,長 尾 美 沙 子,宮 田 堅 司:本 誌,61,7-12(2006) 4)浅 貝 愛 美,木 下 裕 子,瀧 本 優 子,辻 朋 子,長 谷 麻 子,山 本 愛 子,宮 田 堅 司:本 誌,60,1-5(2005) 5)楠 本 瑠 美,長 尾 由 貴 子,橋 本 珠 実,舟 木 真 知 子, 三 仲 亜 季 子,森 林 さ や か,山 田 浄,宮 田 堅 司: 本 冨ま, 62,13-17(2007)
