界 面 活 性 剤(Tween)のLegionella属
の 生 存 ・発 育 お よ び
Esterase産
生 能 に お よ ぼ す 影 響
長崎大学医学部第2内科
猿 渡 克 比 孔
伊 藤
直 美
長 沢
正 夫
中 里
博 子
古 賀
宏 延
渡 辺
講 一
田 中
光
藤 田
紀 代
重 野
芳 輝
山 口
恵 三
泉 川
欣 一
斉 藤
厚
原
耕 平
(昭和59年5月7日受付)
(昭和59年7月10日
受理)
Key words:
Surfactant, Tween, Legionella
要 旨
界 面 活 性 剤 で あ るTweenは 細 菌 学 的 に 用 い られ る場 合 は菌 の 均 一 化,材 料 の 分 散 剤 ま た はesterase 活 性 の 測 定 の 際 の 基 質 と し て 用 い ら れ,そ の 中 でTween60は 土 壌 か らLegionellaを 分 離 す る 際 の 土 壌
の 処 理 剤 と し て 用 い られ て い る.ま たTween80は あ る種 の 菌 の 発 育 を 阻 害 す る作 用 が あ る こ とは 知 ら れ て い た が,私 達 は 各 種TweenのLegionellaの 生 存 や 発 育 に及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た.
Legionellaの 生 存 に お よぼ す 影 響 で は,L.pneumophila,serogroup1(Philadelphial)は 各 種Tween に よ っ て ほ と ん ど影 響 を 受 け な か った が,他 の 菌 種 で は6時 間 作 用 後 よ り,生 菌 数 は 減 少 し,そ の 程 度 はTween濃 度 と相 関 々 係 に あ った.特 にTween20はL.bozemanii,L.gormanii,お よ びL.tongbea-chaeに 対 して0.1%以 上 の 濃 度 で 殺 菌 的 に 作 用 した. Tween60は 他 のTweenに 比 較 し て 発 育 阻 害 作 用 は 少 な か った が,本 剤 の0。5%濃 度 以 上 で は,L. pneumophilaの 一 部 の 菌 株 を 除 い て は ほ とん どす べ て の 菌 株 の 発 育 を 阻 害 した. 以 上 の こ と よ り,土 壌 か らのLegionella属 の 検 出 に 際 して 用 い る 場 合 に は,そ の 濃 度 を0.1∼0.2%に し,且 つ6時 間 以 内 に 処 理 を 行 な う こ とが 重 要 で あ る と結 論 した. 1.は じ め に 界 面 活 性 剤 は,乳 化 分 散 剤,浸 透 剤 な ど と し て 化 学 分 野 で は 広 く 使 用 さ れ て い る.そ の 中 で Tweenは 細 菌 学 の 分 野 で も 菌 の 均 一 化,材 料 の 前 処 理 ま た は 菌 のesterase活 性 の 測 定 に お け る 基 質(substrate)と し て 広 く利 用 さ れ て い る.特 に Tweenを 基 質 と し たesterase活 性 の 測 定 は, Mycobacterium,Pseudomonas aeruginosaな ど の 菌 種 を 同 定 す る た め に は 欠 か す こ と の 出 来 な い 試 験 で あ る92). Legionellaの 細 菌 学 的 検 査 で もTweenは 応 用
され,Morrisら3)は
自然 界,特
に 土 壌 か らの 本 菌
の 検 出 に 際 し て,土
壌 の 処 理 剤 と し て0.5%の
Tween60水
溶 液 を用 い て い る.本 菌 は 元 来,土 壌
あ る い は 水 中 の ア メ ーバ をnatural hostと
し て
棲 息 す る 菌 で あ る が4),私 達 がMorrisら
の 方 法 に
準 じ て行 な った 本 菌 の 分 布 調 査 で は,冷 却 水 か ら
の 本 菌 の検 出 に 比 較 して,土 壌 か らの検 出 が 低 率
で あ った5).こ の こ とか ら土 壌 の 前 処 理 剤 と し て
用 い たTween60の
影 響 を 無 視 で きな い も の と考
え,本 菌 に対 す る各 種Tweenの
影 響 を検 討 した.
そ の成 績 を 報 告 す る.
II. 材 料 お よ び方 法
1. 供 試 菌 株 お よ び界 面 活 性 剤
別刷 請 求 先(〒852)長 崎市 坂 本 町7の1 長 崎 大 学 医学 部 第2内 科 猿 渡 克 比 孔供 試 菌 株 は,当 教 室 保 存 の 標 準 菌 株L.Pneu-mophila, serogroup 1∼6(ATCC 33152, ATCC 33154, ATCC 33155, ATCC 33156, ATCC 33216, ATCC 33215),L. micdadei (ATCC 33218), L. bozemanii (ATCC 33217),L. dumoffli (ATCC 33279),L. longbeachae (ATCC 33469),L . gormanii (ATCC 33297),L. jonlanis (ATCC 33623) お よ びL.wadsworthii (ATCC 33877)の8菌 種,13 株 お よ び 環 境 分 離 株15株 の 計28株 で あ っ た.
界 面 活 性 剤 は,Tween20 (polyoxyethylen sor-bitan laurate), Tween 40 (polyoxyethylen mono-palmitate ), Tween 60 (polyoxyethylen monoste-arate), Tween 80 (polyoxyethylen sorbitan mono-oleat)(和 光 純 薬 工 業 株 式 会 社)の4種 類 を 使 用 し た. 2. 各 種TweenのLegionella属 の 生 菌 数 に 及 ぼ す 影 響. 供 試 菌 株 の24時 間B-CYE寒 天 平 板 培 養 菌 を, 滅 菌PBS(pH7.2)を 用 い てMcFarland # 4∼5 (108∼109CFU/mI)濃 度 の 菌 浮 遊 液 を 作 製 し た. そ の0.1mlを 高 圧 滅 菌 し た0.01%,0.1%お よ び 1.0%の 濃 度 に 調 整 し た 各 種Tween加B-CYE溶 液9.9mlお よ び 対 照 と し てPBSの み9.9mlに 接 種 し,室 温 で1時 間,3時 間,6時 間,24時 間 お よ び48時 間 作 用 さ せ た 後,そ の0.3mlを 採 取 し,10 倍 希 釈 を 行 な い,そ れ ぞ れ の 希 釈 液0.1mlを buffered charcol-yeast extract (B-CYE)寒 天 培 地 に 接 種 し,35℃,4日 間 培 養 後 発 育 し た コ ロ ニ ー 数 か ら 生 菌 数 を 測 定 し た. 3. 発 育 に 及 ぼ す 影 響 供 試 菌 株 の24時 間B-CYE寒 天 平 板 培 養 菌 を 滅 菌PBS(pH7.2)を 用 い てMcFarland # 5(2.0 ∼8 .5×109CFU/ml)の 濁 度 に 浮 遊 さ せ,さ ら に こ れ をPBSに て10-1か ら10-6ま で10倍 希 釈 を 行 な っ た.そ れ ぞ れ の 菌 液 を 各 種Tweenを0.01%,0.1 %お よ び1.0%に 加 え たB-CYE寒 天 培 地(pH6.9 -0 .05)に ミ ク ロ プ ラ ン タ ー(佐 久 間 製 作 所)を 用 い て5.0μl接 種 し,35℃,4日 間 好 気 培 養 を 行 な い,集 落 形 成 の 有 無 を 観 察 し た .対 照 と し てTween を 含 ま な いB-CYE寒 天 培 地(pH6.9-0.05)を 使 用 し た. 4. Esterase活 性 の 検 討 esterase活 性 の 検 討 に 供 し た 菌 液 は 上 記3に よ っ て 希 釈 調 整 し た 菌 浮 遊 液 を 用 い た .esterase 活 性 用 培 地 はTween40お よ び60を そ れ ぞ れ 0.01%,0.1%お よ び1.0%に 加 え たB-CYE寒 天 培 地(pH6.9-0.05)を 用 い た. esterase試 験 は 供 試 菌 浮 遊 液 を ミ ク ロ プ ラ ン タ ー を 用 い て 測 定 用 培 地 に 接 種 し,35℃,4日 間 培 養 を 行 な い,集 落 の 周 囲 に 生 じ る 脂 肪 酸 カ ル シ ウ ム の 晶 析 に よ り,接 種 菌 量 お よ び 基 質 濃 度 と の 関 係 を 比 較 検 討 し た. III. 成 績 1. 生 菌 数 に 及 ぼ す 影 響
Legionella pneumopma, L. bozemanii . L. long-beachaeお よ びL. gormaniiに 対 し て の 各 種Tween の 影 響 を 経 時 的 に み た 生 菌 数 と し て 表 し た も の が Fig.1,2,3,4で あ る.図 表 を 簡 明 に す る た め に 各 Tweenの 濃 度 を0.01%を 実 線 で,1.0%を 破 線 で 示 し,こ れ ら と 同 様 の 傾 向 を 示 し た0.1%濃 度 に お け る 成 績 は 図 示 し な か っ た. L. pneumophila, Philadelphia1株 に 対 す る 各 種Tweenの 影 響 をFig.1に 呈 示 し た.本 菌 は, Tween20,40,60お よ び80に 対 し て 抵 抗 性 を 示 し, Tweenの 濃 度 を0.1∼1.0%に 変 化 さ せ て も24時 間 ま で の 観 察 で は,そ の 生 菌 数 に 何 ら影 響 を 受 け な か っ た.
L. bozemaniiに 対 す る 各Tweenの 影 響 をFig. 2に 呈 示 し た.Tween20お よ びTween40の 0.01%の 低 濃 度 でL.bozemaniiは 影 響 を 受 け,生 菌 数 は 経 時 的 に 減 少 し た.ま たTween60で は 濃 度 を あ げ る こ と に よ り,6時 間 作 用 後 よ り菌 数 の 減 少 化 傾 向 が み ら れ,特 にTween20の1.0%濃 度 は,本 菌 に 対 し て 殺 菌 的 に 作 用 し,当 初106CFU/ mlオ ー ダ ー あ っ た 菌 数 が24時 間 後 に は103CFU/ mlオ ー ダ ー に ま で 減 少 し て い た.Tween80に 対 し て,本 菌 は 抵 抗 性 を 示 し,0.01%か ら1.0%の 濃 度 内 で は,24時 間 作 用 で も そ の 生 菌 数 に 何 ら変 化 は 認 め ら れ な か っ た. Fig.3に 呈 示 し た よ う に,L.longbeachaeは 各 Tweenに 感 受 性 を 示 し,Tween80の0.01%濃 度 を 除 い て は,他 のTweenの0.01%濃 度 で も 生 菌
Fig. 1 Inhibitory Activity of Various Tween Against Legionella pneumophila
Fig. 3 Inhibitory Activity of Various Tween Against Legionella longbeachae
数 は 経 時 的 に 減 少 が み ら れ た.1.0%各Tween濃 度 で は す べ て のTweenで 殺 菌 作 用 が み ら れ,そ の 作 用 はTween20が 最 も 強 く,次 い でTween 40,Tween80,Tween60,の 順 で 殺 菌 作 用 が 強 い 傾 向 で あ っ た. L.gormaniiに 対 す る 各 種Tweenの 影 響 を Fig.4に 呈 示 し た.本 菌 はTween60に 対 し て は 抵 抗 性 を 示 し,0.01%お よ び1.0%濃 度 で も ほ と ん ど 菌 数 は48時 間 作 用 で も 変 化 は 認 め ら れ な か っ た.し か し,他 のTweenに は 感 受 性 を 示 し, Tween20お よ びTween80の0.01%濃 度 で は24 時 間 以 後 よ り菌 数 が 減 少 し,Tween40の0.01%お よ び1.0%濃 度,Tween20お よ びTween80の 1.0%濃 度 で は6時 間 作 用 よ り生 菌 数 が 減 少 し,特 に1.0%Tween20で は48時 間 作 用 で 生 菌 数 は 認 め ら れ な か っ た. 2. 各 種TweenのLegionellaに 対 す る 発 育 抑 制 作 用 各 種Tweenを0.01%,0.1%お よ び1.0%に 加 え たB-CYE寒 天 培 地 を 用 い,各 種Tweenの Legionellaの 各 菌 種 に 対 す る 発 育 阻 止 作 用 を 検 討 し た 成 績 をTable1,2に 示 し た.表 中 に は10綱6希 釈 で 発 育 し た も の を4+,10-5希 釈 で 発 育 し た も の を3+,10-4か ら10轍3希 釈 で 発 育 し た も の を' 2+,10-2か ら10-1希 釈 で 発 育 し た も の を 十,原 液 接 種 で 発 育 し た も の を ± で 表 示 し た. Table1に は 標 準 菌 株 の 発 育 状 態 を 呈 示 し た. L.pneumophi勉 お よ びL.gormaniiは 同 様 な 発 育 傾 向 を 示 し,Tween20を 除 い て は,他 のTween の 各 濃 度 で も ほ と ん ど の 菌 株 が そ の 発 育 を 阻 止 さ
Table 1 Growth of Legionella strains on various concentration of Tween 20, Tween 40, Tween 60 and Tween 80 in the B-CYE Medium
++++: Growth on 10-6 dilution, +++: Growth on 10-5 dilution, ++: Growth on 10-3-10-4 dilution, +: Growth on 10-1-10-2 dilution, ±: Growth on conc solution (McFarland #5),-: No growth, *: results are after incubate at 35℃ for 4 days
Table 2 Growth of environmental isolates on various concentration of Tween 20, Tween 40, Tween 60 and Tween 80 in the B-CYE medium
++++; Growth on 10-6 dilution, +++: Growth on 10-5 dilution, ++: Growth on 10-3-10-4 dilution +: Growthon 10-1-10-2 dilution, ±: Growth on conc solution (McFarland #5),-: No growth *: results are after incubate at 35℃ for 4 days
Table 3 Relationship between Concentration of Tween 40 and lnoculum Size of Bacterium to test Esterase Activity of Legionella Species
+ : Positive reaction,— : Negative reacfion, W : Week positive reaction, NG No growth *after incubate at 35•Ž
, for 4 days
Table 4 Relationship between Concentration of Tween 60 and Inoculum Size of Bacterium to test Esterase Activities of Legionella Species
+ : Positive reaction,— : Negative reaction, w: Week positive reaction NG : No growth *After incubate at 35•Ž
, for 4 days
れ な か っ た.し か し,0.1%濃 度 以 上 のTween20 で は 両 菌 種 と も 発 育 が 抑 制 さ れ た.
L. micdadei, L. bozemanii, L.dumoffii
お よ び
L. jordanis
は す べ て のTweenで0.01%の 低 濃 度で も発 育 が 阻 止 され る傾 向 で あ った.
環 境 分 離 株 に 対 す る成 績 をTable2に
呈 示 し
た.L.
pneumophila
3
株 の 各種Tween加B-CYE寒
天 培 地 上 で の 発 育 状 態 は 標 準 菌 株 とは 異
な り,ほ とん ど の菌 株 が 各Tweenの0.1%濃
度 で
も 発 育 が 抑 制 さ れ,特
に80-019株
は0.01%
Tween
40加B-CYE寒
天 培 地 に 原 液 接 種 で 発 育
した の み で,す
べ て のTweenの
各 濃 度 で 発 育 が
阻 止 され た.そ
れ とは逆 に L. bozemanii82-192
株 は,Tween80の0.1%お よ び1.0%濃 度 を 除 く他 のTweenに 対 し て は1.0%濃 度 で も 抵 抗 性 を 示 し,発 育 が 抑 制 さ れ な か っ た.Legionella-like
organism
(LLO)
と同様 な 傾 向 が み られ,各
種
Tweenに
よ る 発 育 阻 止 作 用 は 菌 株 に よ って 異
な った 成 績 で あ っ た.
3。Esterase活
性 に お け る 接 種 菌 量 と 各 種
Tweenの
濃 度 との関 係
Legionella
の 各 菌 種 はesterase活 性 を 有 す るた め,本 菌 のesterase活
性 を測 定 す る際 の 基 質 の
濃 度 と接 種 菌 量 と の 関 係 を 検 討 し,そ の 成 績 を
Table 3,4に 示 した.Table3に
はTween40を
基 質 と した 場 合 の結 果 を 示 した が,0。01%濃
度 で
は,少 な い接 種 菌 量 で もesterase活
性 が観 察 され
た が,そ
の反 応 は弱 く,判 定 が非 常 に困 難 で あ っ
た.0.1%濃
度 で は,菌 量 が 少 な い場 合 に は 菌 の 発
菌 株 が発 育 し,そ のesterase活
性 も明 瞭 に観 察 で
きた.1.0%に
濃 度 を 上 げ る と106CFU接
種 で も
発 育 が抑 制 され る菌 株 が 存 在 した.
Tween60(Table4)に
お い て もTween40と
同 様 な傾 向 が 得 られ た.
IV.考
案
Tweenは
乳 化 剤 また は 分散 剤 と し て,化 学 お よ
び 医薬 な どの 分 野 で 広 く用 い られ る ソル ビ タ ン ポ
リオ キ シ ア ル カ ラ ン誘 導 体 で あ り,ソ ル ビ トー ル
を 強 鉱 酸 で 処 理 し,生-じ た ソル ビ タ ソ と脂 肪 酸 と
を 水 酸 化 ナ ト リウ ム を触 媒 と して不 活 性 ガ ス 中 で
加 熱 を 行 な うこ とに よ り脂 肪 酸 エ ス テ ル(span)
が 生 成 され,こ
のspanを
酸 化 エ チ レ ンで 処 理 す
る こ とに よ り作 られ る.さ
らにTweenは
こ の エ
ス テ ル結 合 に 用 い られ る脂 肪 酸 の 種 類 に よ って 細
分 さ れ る.
Tweenの
細 菌 学 的応 用 は,乳 化,分 散 あ るい は
浸 透 な どの 性 質 を 利 用 し,材 料 あ る い は 菌 の 懸 濁
化,均
一 化 な ど に 用 い られ,特
にTween80は
Dubosの
結 核 菌 培 養 基 で は 脂 肪 の 乳 化 剤 と し て
利 用 さ れ て い る6).さ ら に細 菌 の生 化 学 的 性 状 を
検 討 す る上 で,Tweenは
脂 肪 酸 エ ス テ ル 結 合 が加
水 分 解 さ れ る と脂 肪 酸 を 遊 離 す るが,こ れ を利 用
し て 菌 が 産 生 す るesterase活
性 を 測 定 す る 際 の
基 質 と して 多 くの細 菌 で 利 用 され て い る.
Legionella
の 生 理 学 的 特 性 も近 年 明 らか に な っ
て きた が,未
だ 多 くの未 解 決 な 部 分 もあ る.栄 養
要 求 性 の 面 で は,本 菌 は 多 くの 脂 肪 酸,特
に オ レ
イ ン酸 に よ って 発 育 を 阻 害 され る こ とが 明 らか と
な り7),Tween
80の 本 菌 に 対 す る発 育 抑 制 作 用 は
Pineら
に よ って 一 部 確 認 され て は い る7)が,詳 細
な検 討 は未 だ 行 なわ れ て い な い.私 達 は本 菌 に対
す る各 種Tweenの
影 響 を 検 討 し た が,本 菌 の 生
菌 数 に 及 ぼ す 影 響 は,菌 種 に よ って 異 な り,L.
pnemophilc
は 各 種Tweenに
よ って 殆 ん ど 影 響
され な か った.し
か し,他 の 菌 種 は ほ とん どす べ
て のTweenに
よ っ て6時
間 作 用 よ り経 時 的 に 菌
数 は 減 少 し,-菌 数 の減 少 傾 向 とTween濃
度 とは
相 関 々 係 に あ っ た.特 にTween20はL.
boze-manii,
L. gormanii
お よ び L. longbeachae
に 対
し て殺 菌 的 に 作 用 し,1.0%濃
度 で は24時 間 作 用
で は3オ
ー ダ ー 以上 の 菌 数 減 少 が み られ た.発
育
阻 害 作 用 で も菌 株 に よ っ て 異 な る が,各Tween
と も0:01%濃
度 で も阻 害 作 用 を有 す る結 果 が得 ら
れ た.そ の 中 で もTween
60は-Legionellaに 対 す
る 阻 害 作 用 は少 な い が,Morrisら
が報 告 した 土 壌
の 前 処 理 剤 と して 使 用 す る 本 剤 の0.5%濃
度 で は
L. pneumophila
の1部
の 菌 株 を 除 い て ほ と ん ど
す べ て の 菌 が 発 育 を 阻 害 され た.
本 菌 が 各 種 脂 肪 酸 に よ っ て発 育 が 阻 害 され る こ
とを 考 え る と,各 種Tweenが
脂 肪 酸 の エ ス テ ル
結 合 物 で あ る 以上,本
菌 に対 して 有 害 に働 くこ と
は 否 定 で き な い もの と思 わ れ る.し か し,上 述 し
た よ うに各 種Tweenの
中 で,Tween60が
低 濃 度
で は本 菌 に対 して 阻 害 作 用 が 少 な く,ま た6時
間
作 用 で は殆 ん どす べ て の菌 種 に対 して 生 菌 数 に与
え る影 響 が 少 な い こ とか ら,少 な く と も土 壌 の前
処 理 剤 と して 使 用 す る場 合 に は6時 間 以 内 に処 理
を行 な うと,菌 の検 出 に は そ れ ほ ど影 響 を及 ぼ さ
な い も の と 考 え られ た.さ
ら に 濃 度 の 面 で は,
Morrisら
が 指 定 した0.5%濃
度 で は菌 に 与 え る影
響 が 大 で あ り,ま た 界 面 活 性 作 用(0.1%濃
度 で 水
の表 面 張 力 を低 下 させ,0.2%以
上 で は濃 度 に 関 係
な く表 面 張 力 を 一 定 に させ る作 用)の
面 か ら考 え
る な らば,0.1%な
い し0.2%濃
度 が適 切 で あ ろ う
と考 え る.
さ らにLegiondlaはesterase活
性 を有 し,各 種
Tweenの
中 でTween40お
よ びTween60を
加 水
分 解 す る こ と が 判 明 し た の で,こ
れ ら のTween
を 基 質 と してesterase活
性 を 測 定 す る 場 合 の 基
質 の濃 度 お よび接 種 菌 量 の検 討 を 行 な った.こ
の
結 果,基 質 の濃 度 を0.01%に
す る と,少 な い 接 種
菌 量 で もesterase活
性 が 観 察 で き るが,そ の反 応
は 弱 く,判 定 が 非 常 に 困難 で あ った.ま
た 濃 度 を
1.0%に
あ げ る とほ と ん どの 菌 株 が 発 育 を 阻 害 さ
れ,0.1%濃
度 で は菌 量 が 少 な い場 合 に は発 育 しな
い こ とが あ る が,106CFU以
上 の菌 量 を接 種 す る
とほ とん どす べ て の 菌 株 が 発 育 し,そ のesterase
活 性 も 明 瞭 に 観 察 で き た こ と か ら,こ れ ら の
Tweenを
基 質 と し てesterase活
性 を 測 定 す る際
に は 基 質 の濃 度 を0.1%に
し,接 種 菌 量 を 多 くし て
試 験 す る こ とが 望 ま しい と考 え られ た.
V.結 語
Legionella
species
に 対 す るTween20,40,60お よ び80に よ る影 響 を検 討 し,次 の よ うな結 果 を
得 た.
1.生 菌 数 に 及 ぼ す 影 響 は,菌
種 に よ っ て 異 な
り,L. pneumophila
は 各 種Tweenに よ っ て ほ とん ど影 響 さ れ な か った.し
か し,他 の 菌種 は ほ と
ん どす べ て のTweenに
よ って 経 時 的 に 生 菌 数 は
減 少 し,そ の 程 度 とTween濃
度 と は 相 関 々 係 に
あ った.
2. L.
pneumophila
の 約 半 数 の 菌株 お よ びL.
gormaniiはTween40,60お よ び80含B-CYE寒 天 培 地 上 で は 発 育 を 阻 害 さ れ な か っ た が,他 の 菌 種 で は,0.01%濃 度 で も そ の 発 育 が 阻 止 さ れ た. 3.土 壌 か ら の 本 菌 の 検 出 にTween 60を 用 い る 場 合 に は,濃 度 を0.1∼0.2%と し,処 理 時 間 は 6時 間 以 内 に 止 ど め る べ き と 考 え ら れ た . 4. Legionella は 菌 量 が 多 い とesterase活 性 を 示 し,Tween 40お よ びTween 60を 加 水 分 解 す る が,本 剤 を 基 質 と し てesterase活 性 を 試 験 す る 場 合 に は,濃 度 を0.1%に し,接 種 菌 量 を 多 く し た 方 が よ い と 思 わ れ た. 文 献1) Wayne, L. G., Donbek, J. R. & Russel , R .L.:
