サイクラミン酸、ズルチンのHPLCによる定量及びLC/MS/MSによる確認と8種甘味料の系統的分析
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(2) サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 26. 社会的意義：生活習慣病の予備軍であるメタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）の予防・ 改善を目的とする「特定健診・特定保健指導」 （通称メタボ健診）が 2008 年 4 月からスタート した。消費者の健康志向はさらに強まり、食生活を改善しようという機運が高まっている。こ れまでのダイエット志向とも相俟って、糖摂取を抑制してカロリー低減を図ろうと、低カロリ ーの人工甘味料を使用した食品のニーズが増加している。 我が国では、1948 年にサッカリンナトリウム（以下 SA と略す） 、1983 年にアスパルテーム （以下 APM）、1999 年にスクラロース（以下 SUC）、2000 年にアセスルファムカリウム（以 下 AK）、2007 年にネオテーム（以下 NE）がそれぞれ食品添加物に指定され、人工甘味料とし て使用することができる。この他に甘味料としては、糖アルコールの D-ソルビトール、キシリ トール、天然系甘味料としてステビア、グリチルリチン酸等がある。このように甘味料の選択 肢の多様化とともに、甘味料を複数組み合わせて使用するケースが見られるようになった。 一方、世界的にはサイクラミン酸（以下 CY と略す） 、アリテーム（以下 AL）といった人工 甘味料も使用されている。また、ズルチン（以下 DU）のように過去に使用されていたものが 検出される事例も見られる。これらは我が国では使用することができない指定外添加物である が、輸入食品の増加から、これらの検査需要も高まっている。このように国内で使用できる甘 味料の多様化と、指定外甘味料も視野に入れた多種甘味料の検査が求められている。 そこで、著者らはこれまでに、各種甘味料について前処理を透析法に統合し、系統化、省力 化した分析法を報告している（萩野他，2002）。また、CY については、CY を誘導体化するこ となく、電気伝導度検出器（以下 CD と略す）を用いて直接分析する方法を報告した（松本他， 2005）。今回は既報（萩野他，2002）、（松本他，2005）の改良として、CY 及び DU の固相抽 出カートリッジによる新たな精製方法について検討した。さらに、これら 2 種甘味料が指定外 添加物であることから、LC/MS/MS による確認法についても検討を行った。 また、最近報告した NE、AL 及び APM の同時分析法（松本他，2008）を、今回の CY、DU の一部改良法と合わせて、これまでの前処理を透析法に統合した甘味料の系統的分析法（萩野 他，2002）、（松本他，2005）に加えることとした。すなわち、指定添加物である SA、APM、 SUC、AK、NE の 5 種と指定外添加物である CY、DU、AL の 3 種を合わせた 8 種甘味料を透 析法により一括抽出し、透析外液を 5 系統に分けて HPLC により分析することとした。この透 析－HPLC 法による系統的分析法の再構築により、甘味料分析の大幅な省力化を図ることがで きた。. 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(3) サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 27. １．はじめに 生活習慣病の予備軍であるメタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群）の予防・改善を目 的とする「特定健診・特定保健指導」 （通称メタボ健診）が 2008 年 4 月からスタートした。消 費者の健康志向はさらに強まり、食生活を改善しようという機運が高まっている。これまでの ダイエット志向とも相俟って、糖摂取を抑制してカロリー低減を図ろうと、低カロリーの人工 甘味料を使用した食品のニーズが増加している。 我が国では、1948 年にサッカリンナトリウム（以下 SA と略す） 、1983 年にアスパルテーム（以 下 APM）、1999 年にスクラロース（以下 SUC）、2000 年にアセスルファムカリウム（以下 AK）、 2007 年にネオテーム（以下 NE）がそれぞれ食品添加物に指定され、人工甘味料として使用す ることができる。この他に甘味料としては、糖アルコールの D-ソルビトール、キシリトール、 天然系甘味料としてステビア、グリチルリチン酸等がある。このように甘味料の選択肢の多様 化とともに、甘味料を複数組み合わせて使用するケースが見られるようになった。 一方、世界的にはサイクラミン酸（以下 CY と略す） 、アリテーム（以下 AL）といった人工甘 味料も使用されている。また、ズルチン（以下 DU）のように過去に使用されていたものが検 出される事例も見られる。これらは我が国では使用することができない指定外添加物であるが、 輸入食品の増加から、これらの検査需要も高まっている。このように国内で使用できる甘味料 の多様化と、指定外甘味料も視野に入れた多種甘味料の検査が求められている。 そこで、著者らはこれまでに、各種甘味料について前処理を透析法に統合し、系統化、省力化 した分析法を報告している（萩野他，2002） 。また、CY については、CY を誘導体化すること なく、電気伝導度検出器（以下 CD と略す）を用いて直接分析する方法を報告した（松本他， 2005）。今回は既報（萩野他，2002）、（松本他，2005）の改良として、CY 及び DU の固相抽 出カートリッジによる新たな精製方法について検討した。さらに、これら 2 種甘味料が指定外 添加物であることから、LC/MS/MS による確認法についても検討を行った。 また、最近報告した NE、AL 及び APM の同時分析法（松本他，2008）を、今回の CY、DU の一部改良法と合わせて、これまでの前処理を透析法に統合した甘味料の系統的分析法（萩野 他，2002）、（松本他，2005）に加えることとした。すなわち、指定添加物である SA、APM、 SUC、AK、NE の 5 種と指定外添加物である CY、DU、AL の 3 種を合わせた 8 種甘味料を透 析法により一括抽出し、透析外液を 5 系統に分けて HPLC により分析することとした。この透 析－HPLC 法による系統的分析法の再構築により、甘味料分析の大幅な省力化を図ることがで きたので報告する。. ２．実験方法 8 種甘味料中、今回の実験方法は、CY と DU の 2 種甘味料に関する記述に止め、他の 6 種甘 味料の分析条件等については、後述の結果及び考察の「5．8 種甘味料の系統的分析」の中に記 述した。なお、透析方法については 8 種甘味料とも共通である。 ２ – １. 試料 東京都内で購入した干黒梅、酢こんぶ、しば漬け、ジャム、ジュース、フルーツ缶詰、ウス ターソース、クッキー、キムチを用いた。 ２ – ２. 標準品及び試薬等 1) 標準品及び標準溶液 CY（シクロヘキシルアミド硫酸ナトリウム、特級、和光純薬工業（株）製）112 mg、DU（食 品添加物用、ICN Biochemicals 社製）100 mg を精秤し、それぞれを 50％メタノール溶液に溶 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(4) 28. サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 解して全量を 100 mL としたものを標準原液（CY、DU として各 1,000 µg/mL）とし、これを 段階的に希釈して標準溶液とした。 2) 透析内液 塩化ナトリウム 100 g を 0.01 mol/L 塩酸に溶解して 1,000 mL とした。 3) 透析外液 0.01 mol/L 塩酸 4) 透析膜 透析用セルロースチューブ 36/32（平面幅 43 mm、直径 27 mm、膜厚 0.0203 mm、Viskase 社製） 5) 前処理用カートリッジカラム (1) HPLC 試験溶液用 CY 用として Oasis HLB（充填量 500 mg、Waters 社製）、DU 用とし て Sep-Pak Vac C18（充填量 500 mg、Waters 社製）を使用前にメタノール、水各 5 mL でコ ンディショニングして用いた。 (2) LC/MS/MS CY 試験溶液用 Maxi-Clean IC-Ag（交換容量 0.5 mL、Alltech 社製）を使用 前に水 3 mL でコンディショニングして用いた。 6) 試薬、溶媒 試薬は市販特級品を用い、メタノールは高速液体クロマトグラフィー用を用いた。 ２ – ３. HPLC 装置及び測定条件 1) HPLC 装置 日本分光(株)製 LC－900 シリ－ズ（送液ポンプ、デガッサー、恒温槽、オートサンプラー、 UV 検出器） 。CD には東亜電波工業（株）製 ICA-5220 を用いた。 2) 測定条件 (1) CY 用 カラム：Cosmosil 5NH２（4.6 mm i.d.× 150 mm、5 µm、ナカライテスク（株） 製） 、移動相： 1％リン酸－メタノール（3：2）混液、カラム温度：40℃、流速：1.0 mL/min、 注入量：100 µL、検出器：CD（セル温度 45℃、GAIN ×1） (2) DU 用 カラム：Cosmosil 5C18AR-Ⅱ（4.6 mm i.d.× 250 mm、5 µm、ナカライテスク（株） 製） 、移動相：40％メタノール、カラム温度：40℃、流速：0.8 mL/min、注入量：10 µL、検出 器：UV 240 nm ２ – ４. LC/MS/MS 装置および測定条件 1) LC/MS/MS 装置 LC 装置：Waters 社製 Column ACQUITY UPLC システム、 Column temperature Mobile phase タンデム質量分析装置： Waters 社製 Quattro Premier XE Flow rate Injection volume 2) 測定条件 Table 1 に示した。 Ionization. Analysis mode. 表 1. LC/MS/MS測定条件 CY. DU. ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm i.d.×100 mm, 1.7 µm) 40 ℃ 0.1% HCOOH - MeOH (7:3). 40％ MeOH. 0.2 mL/min 1 μL ESI negative. ESI positive. Product ion scanning ( m/z 50 - 200 ) 3.5 kV. Capillary voltage Desolvation gas flow. N2 800 L/hr. Cone gas flow. N2 50 L/hr 120 ℃. Source temperature. 400 ℃. Desolvation temperature Cone voltage. 40 V. 25 V. Collision voltage. 25 eV. 20 eV. Precursor ion. m/z 178. m/z 181. 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(5) サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 29. ２ – ５. 試験溶液の調製 液状試料はそのまま 20 g を、固形試料は細切した試料 20 g をとり、約 20 mL の透析内液を 加えて混和後、少量の透析内液で透析膜に充填し、上端を密封した。これをメスシリンダー内 に入れ、透析外液で全量を 200 mL とし、時々揺り動かしながら常温で 24 時間透析した。なお、 穀類、魚介類加工品などの一部食品では透析時間を 48 時間とした。 1) HPLC 用 CY 試験溶液の調製 透析外液 30 mL に 20%塩酸 0.6 mL を加え、この 25.5 mL（透析外液 25 mL 相当量）を Oasis HLB カートリッジに負荷した。これを水 5 mL で洗浄した後、50％メタノール溶液で溶出し、 5 mL に定容したものを HPLC 用 CY 試験溶液とした。 2) LC/MS/MS 用 CY 試験溶液の調製 HPLC 用 CY 試験溶液 4 mL を Maxi-Clean IC-Ag カートリッジに負荷した。初めに流出し た 2 mL を捨て、残りの流出液を捕集して LC/MS/MS 用 CY 試験溶液とした。 3) HPLC 及び LC/MS/MS 用 DU 試験溶液の調製 透析外液 5 mL を Sep-Pak Vac C18 カートリッジに負荷し、0.02 mol/L 水酸化ナトリウム溶 液 5 mL、水 5 mL で洗浄し、50％メタノール溶液で溶出し、5 mL に定容したものを HPLC 及 び LC/MS/MS 用 DU 試験溶液とした。 ２ – ６. 定量 CY 標準溶液及び HPLC 用 CY 試験溶液の各 100 µL、DU 標準溶液及び HPLC 用 DU 試験溶 液の各 10 µL を HPLC に注入し、あらかじめ作成した 2.5～100 µg/mL の CY 標準溶液の検量 線及び 0.5～100 µg/mL の DU 標準溶液の検量線から試験溶液中の CY、DU 濃度を求めた。. ３．結果及び考察 ３ – １. CY の HPLC 測定条件 1) カラム及び移動相 カラムには SA、AK の分析に用いるシリカゲルにアミノプロピル基が化学結合したシリカゲ ル NH２カラムを用いた。移動相については、既報（松本他，2005）で用いた 1％リン酸－メタ ノール混液（3：2）と、AK の通知検査法（厚生労働省，2001）で用いる 1％リン酸－アセト ニトリル混液（2：3）の 2 液について検討した。SA、AK 検出用の UV 検出器では、2 液とも 使用可能であったが、CY 検出用の CD 検出器ではメタノール混液の方が CY を感度良く測定で きた。そこで、移動相には 1％リン酸－メタノール混液（3：2）を用いることとした。 2) 検出器 CY は CD 検出器を用いることで、誘導体化することなく、標準溶液で 2.5 µg/mL まで測定 することができた。また、UV 検出器を直列に接続し、カラム、移動相を変えることなく SA、 AK を連続して測定することができた（HPLC クロマトグラムは既報（松本他，2005）掲載）。 ３ – ２. CY の精製 1) HPLC 用試験溶液の精製 CD 検出器による CY の検出限界は 2.5 µg/mL であり、通知検査法（厚生労働省，2003）の 定量限界である 0.005 g/kg まで検出するためには透析外液を少なくとも 5 倍濃縮する必要があ った。既報（松本他，2005）では溶媒抽出法を用いたが、使用する溶媒量を低減化するために 今回は固相抽出カートリッジを用いた透析外液の濃縮、精製方法について検討を行った。 CY はスルホン基を持つ強酸性物質であり、はじめに、陰イオン交換カートリッジに大量に保 持させ、溶出液を少量とする濃縮と精製を試みた。陰イオン交換カートリッジとして強陰イオ ン交換の Bond Elut SAX、弱陰イオン交換の Sep-Pak NH２、ポリマーベースの Oasis MAX 及 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(6) サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 30. び Oasis WAX の各々に pH を調整した CY 添加透析外液を負荷したところ、いずれのカートリ ッジも 10～20 mL の負荷で CY が漏出した。これは、透析外液中の塩化ナトリウムがイオン交 換固相への CY の保持を妨げているためであり、この塩化ナトリウムを除去しない限り、イオ ン交換モードによる精製は不可能であった。そこで、堀江（堀江他，2005）らが用いたポリマ ーベースの逆相系カラムである Oasis HLB カートリッジによる精製を試みた。非解離状態の CY をカートリッジに保持させるため、透析外液の塩酸濃度を 0.1 mol/L としたところ、5％塩 化ナトリウム含有透析外液（25％食塩含有試料 20 g を 50 mL 透析内液で透析した時）でも CY を十分に保持することができた。洗浄は水 5 mL が限界で、それ以上行うと CY が漏出してし まった。 Fig. 1 に CY 標準溶液及び CY を添加した酢こんぶの HPLC クロマトグラムを示した。溶媒 抽出法に比べて 10 分以降の夾雑ピークの除去が不完全ではあるが、おおむね CY 測定の妨害と はならなかった。CY の検出限界は試料中濃度として 0.005 g/kg であり、良好な感度を得るこ とができた。 CY A. B. C. D. 0. 5. 10. 15. 20. Retention time (min) 図1.. サイクラミン酸（0.2g/kg）を添加した酢昆布の試験溶液 （A、 B、 C）とサイクラミン標準溶液(100 µg/mL 、 D)の HPLCクロマトグラム A: Not treated with a cartridge or not extracted by solvent B: Extracted by solvent with ethyl acetate C: Treated with an Oasis HLB cartridge. 2) LC/MS/MS 用試験溶液の調製 Oasis HLB カートリッジによる精製では、HPLC クロマトグラム 10 分以降の夾雑ピーク、 特に塩素イオンのピークを完全に除去することはできなかった。LC/MS/MS への注入用試験溶 液としてはさらに精製する必要があった。そこで、Ag 型の陽イオン交換カートリッジによる精 製法の検討を行った。用いたのは Maxi-Clean IC-Ag（交換容量 0.5 mL）で、水 3 mL でコン ディショニングした後、Oasis HLB カートリッジで精製した HPLC 用 CY 試験溶液 4 mL を負 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(7) 31. サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 荷した。ハロゲンイオンはカートリッジに保持され、CY は保持されることなく流出することか ら、流出液を 1 mL ずつ捕集して CY 濃度を測定した。その結果、3 mL 以降の流出液の CY 回 収率は 97％以上と良好であったことから、初めに流出した 2 mL を捨て、残りの流出液 2 mL を捕集して LC/MS/MS 用 CY 試験溶液とした。 Fig. 2 に CY を添加したキムチ透析外液の Oasis HLB 及び Maxi-Clean IC-Ag カートリッジによる精製後の HPLC クロマトグラムを示したが、 10 分以降の夾雑ピークを良く除去することができた。 また、この精製は CD 検出でも効果的であった。ほとんどの食品では問題とならなかったが、 キムチなどの一部の食品で HPLC 用 CY 試験溶液を注入後、CD が大きくマイナスにドリフト したままとなり、CY の検出時間近辺になっても測定可能なレベルまで戻らないという現象が見 られた。これは試料中のイオン性物質が過剰であることに起因すると考えられた。そこで、 HPLC 用 CY 試験溶液では CD 測定が困難な試料のみ LC/MS/MS 用 CY 試験溶液と同様の精製 を行った。 DU CY. A. A. B. B. 0. 5. 10. 15. 20. Retention time (min). C 図2．サイクラミン酸（ 0.2 g/kg ）を添加したキムチ試験溶液 のHPLC クロマトグラム A: Treated with an Oasis HLB cartridge B: Treated with an Oasis HLB cartridge and a Maxi-Clean IC-Ag cartridge. 0. 5. 10. 15. Retention time (min) 図3．ズルチン（ 0.2 g/kg ）を添加した酢昆布の試験溶液 （ A、 B ）と ズルチン標準溶液（ 20 µg/mL、C ）の HPLC クロマトグラム A: Not treated with a cartridge B: Treated with a Sep-pak C18 cartridge. ３ – ３. DU の精製 透析外液を HPLC に直接注入した場合、食品の種類によって DU の直近に測定の妨害となる 夾雑ピークが出現した。小林らは、SA、APM、AK、AL、DU の 5 種甘味料を同時に精製する ことを目的としたイオンペア試薬と C18 カートリッジを用いる方法を報告している（小林他， 1999）。しかし、DU のみであれば、イオンペアにしなくても C18 カートリッジに保持される ことから、C18 充填量の少ない Sep-Pak Vac C18 カートリッジによる精製方法について検討し 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(8) 32. サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. た。洗浄液は水のみでは不十分で、0.02 mol/L 水酸化ナトリウム溶液を用いたところ、夾雑ピ ークを完全に除去することできた。 Fig. 3 に DU 標準溶液及び DU を添加した酢こんぶの HPLC クロマトグラムを示した。DU の検出限界は試料中濃度として 0.005 g/kg であり、良好な感度 と妨害物質による影響の少ないクロマトグラムを得ることができた。 ３ – ４. 添加回収試験 あらかじめ 2 種甘味料を含有していない ことを確認した干黒梅、酢こんぶ、しば漬け、 ジャム、ジュース、フルーツ缶詰、ウスター ソース、クッキー、キムチの 9 種類の食品に CY 及び DU を 0.2 g/kg となるように添加し、 本法に従い回収試験を行った（Table 2） 。 なお、キムチについては、透析外液を Oasis HLB カートリッジで処理後、さらに Maxi- Clean IC-Ag カートリッジで精製して HPLC に供した。平均回収率は CY が 96.1％、 DU が 96.7％といずれも良好な結果が得られ たことから、本法は種々の食品に適用できる ものと思われる。. 表2.．サイクラミン酸とズルチンの添加回収試験結果 （ 各0.2 g/kg添加） Samples. Recovery (％) CY. DU. Black hoshiume. 93.8 ± 2.1. 92.4 ± 1.1. Su-konbu. 98.1 ± 0.2. 95.9 ± 1.1. Shiba-zuke. 97.9 ± 1.1. 96.6 ± 0.6. Strawberry jam. 96.5 ± 2.0. 95.1 ± 0.5. Juice. 98.2 ± 1.7. 99.4 ± 0.7. Canned fruits. 95.4 ± 2.4. 94.0 ± 2.4. Worcester sauce. 93.8 ± 3.1. 98.6 ± 0.7. Cookie. 95.0 ± 4.4. 99.5 ± 2.2. Kim chee. 96.1 ± 0.4. 98.4 ±1.7. Values are means ± S.D. of three trials.. ３ – ５. LC/MS/MS による確認 添加した試料を用いて LC/MS/MS による確認法の検討を行った。LC 条件は CY、DU とも C18 カラムを用いた逆相系の分析条件を用いることとした。MS/MS による測定は、確認が目的 であることから Product ion scanning 法を用い、標準品と試料から生成されたプロダクトイオ ンのマススペクトルを比較することで同定を行うこととした。 CY が酸性物質であることから、HPLC 移動相にギ酸－メタノール混液を用い、イオン化にエ レクトロスプレー－イオン化法（ESI）のネガティブモードを選択したところ、[M－H] －の脱 プロトン化分子イオンを観察することができた。一方、DU の HPLC 移動相にもギ酸－メタノ ール混液を用いたところ、C18 カラムへの保持が悪かった。そこで定量用 HPLC と同じ 40％ メタノール溶液を移動相とし、イオン化にポジティブモードを選択したところ、[M＋H] ＋のプ ロトン化分子イオンを観察することができた。そこで、CY は m/z 178、DU は m/z 181 をプレ カーサーイオンとし、プロダクトイオンを観察するためのコーン電圧、コリジョンエネルギー 等の検討を行った結果、Table 1 に示すイオン化条件が最適であった。 Fig. 4 に CY、DU 各標準溶液のマススペクトルを示した。CY は m/z 79、DU は m/z 107 が最 も特徴的なプロダクトイオンであった。市販のキムチに CY、DU を各 0.2 g/kg となるように添 加したところ、試料溶液の保持時間、ピーク形状、マススペクトルは、標準溶液のそれらと良 く一致した。 ３ – ６. 8 種甘味料の系統的分析 8 種甘味料の透析－HPLC による系統的分析法の概要を Fig. 5 に分析条件の概要を Table 3 に示した。NE、APM、AL は著者らが作成した方法（松本他，2008）を用い、SUC は小林ら の方法（小林他，2001）、SA、AK は守安らの方法（守安他，1996）に準拠した。8 種の甘味 料は、前処理を透析法に統合し、透析外液を CY、DU、NE+APM+AL、SUC、SA+AK の 5 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(9) 33. サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 系統に分けて各試験溶液を調製し、HPLC により分析することとした。試料 20 g を本法により 透析した時に得られる透析外液はおよそ 100～150 mL であり、5 系統に分けても十分な量が確 保できた。1 回の透析操作で 8 種の甘味料を一括抽出すること、CY を誘導体化することなく直 接分析することなどの改良の結果、従来法に比べ、8 種甘味料の分析に要する試料量を少なく とも 1/5 以下に、試薬、器具、操作回数なども大幅に削減することができた。 100. 79. Cyclamate Precursor ion : m/z 178. 107. 100. Dulcin Precursor ion : m/z 181 135. %. % 181 178. 0. 0. 50. 100. 150. 200. 50. 100. m/z. 150. 200. m/z. 図 4. サイクラミン酸とズルチン標準溶液（1mg/mL）をLC/MS//MSで プロダクトイオンスキャン した時の各マススペクトル. Sample 20g pack into cellulose tube with 0.01 mol/L HCl containing 10% NaCl dialyze against 0.01 mol/L HCl for 24 – 48 hours. Dialyzate 25 mL Oasis HLB cleanup Maxi-Clean IC-Ag cleanup (for LC/MS/MS） Test solution. Dialyzate 5 mL. Dialyzate 10 mL. Dialyzate 50 mL. Sep-Pak C18 cleanup. Oasis MCX cleanup. Bond Elut ENV cleanup. Test solution. Test solution. UV － HPLC. UV － HPLC. DU. Test solution RI － HPLC＊２. NE＋APM＋AL. Dialyzate. Test solution UV － HPLC SA ＋AK. SUC. CD – HPLC＊１ ＊1HPLC with electro conductivity detector. CY. ＊2HPLC with refractive index detector. 図 5. 8種甘味料の系統的分析法の概要 CY:cyclamate, DU:dulcin, NE:neotame, APM:aspartame, AL:alitame, SUC:sucralose, SA:saccharin, AK:acesulfame K. Analysis details are shown in references 3), 8), 9) .. ４．まとめ すでに報告した CY を誘導体化することなく直接分析する方法（松本他，2005）の一部改良 として、固相抽出カートリッジを用いて透析外液を精製する方法の検討を行った。また、DU についても同様の検討を行った。 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(10) 34. サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 食品からの抽出には透析法を用い、透析外液の精製に CY では、逆相系の Oasis HLB カート リッジを、DU では Sep-Pak Vac C18 を用いた。市販の 9 種類の食品にこれら 2 種甘味料を 0.2 g/kg となるように添加して行った添加回収試験の平均回収率は、いずれも 96％以上と良好であ った。また、これらの方法による検出限界は、試料中濃度として 2 種甘味料とも 0.005 g/kg で あった。 CY 及び DU の LC/MS/MS による確認法についても検討を行い、 イオン化には CY は ESI（－）、 DU は ESI（＋）モードを選択し、Product ion scanning 法を用い、生成されたプロダクトイ オンのマススペクトルによる同定を行った。 また、最近報告した NE、AL 及び APM の同時分析法（松本他，2008）を、今回の CY、DU の一部改良法と合わせて、これまでの前処理を透析法に統合した甘味料の系統的分析法（萩野 他，2002）、 （松本他，2005）に加えることとした。すなわち、対象甘味料を指定添加物である SA、APM、SUC、AK、NE の 5 種と指定外添加物である CY、DU、AL の 3 種を合わせた 8 種甘味料とし、これらを 5 系統に分けて HPLC により分析することとした。透析－HPLC 法に よる系統的分析法の再構築により、8 種甘味料分析の大幅な省力化を図ることができた。 本報文は、東京都健康安全研究センター研究年報第 59 号(2008)に掲載された論文の内容を基 に、一部加筆・修正を加えたものである。 表 3．8種甘味料のHPLC分析条件と固相抽出精製法の概要 HPLC conditions Sweetener. CY. DU ＊2. NE + APM + AL. SUC. ＊2. SA + AK. ＊2. Solid phase extraction method Washing solvent2. Column type. Mobile phase. Detector. Cartridge. Washing solvent1. NH2. 1%H3PO4 －MeOH(3:2). CD. Oasis HLB. H 2O. C18. 40％MeOH. UV240nm. Sep-pak C18. 0.02 mol/L NaOH. H 2O. 50％MeOH. C18. 0.01 mol/L PBS －MeCN (gradient). UV210nm. Oasis MCX. H 2O. MeOH. 0.5 mol/L NH4Cl －MeCN (3:2). C18. 15％ MeCN. RI. Bond Elut ENV. 0.2 mol/L NaOH. H 2O. MeOH. NH2. 1%H3PO4 －MeOH (3:2). UV230nm. Elution solvent. 50％MeOH. (Maxi-Clean IC-Ag) ＊1. ＊1 ＊2. For the additional purification of cyclamate for the LC/MS/MS analysis. Details are shown in references 3)，8)，9).. 参考資料： １．萩野賀世，松本ひろ子，坂牧成恵，中里光男，安田和男 (2002)．乾燥梅製品に使用され た甘味料の分析，東京衛研年報，53, 73-77． ２．松本ひろ子，萩野賀世，坂牧成恵，粕谷陽子，永山敏廣 (2005)．電気伝導度検出器付き HPLC によるサイクラミン酸の直接分析と 7 種甘味料の系統的分析，東京健安研セ年報， 56, 153-156． ３．松本ひろ子，平田恵子，坂牧成恵，萩野賀世，牛山博文 (2008)．HPLC による食品中の ネオテーム，アリテームおよびアスパルテームの同時分析法，食衛誌，49, 31-36． 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
(11) サイクラミン酸、ズルチンの HPLC による定量及び LC/MS/MS による確認と 8 種甘味料の系統的分析. 35. ４．厚生労働省医薬局食品保健部基準課長 (2001)．食品中のアセスルファムカリウムの分析 法について(通知) 食基発第 58 号． ５．厚生労働省医薬局食品安全部監視安全課長 (2003)．サイクラミン酸に係わる試験法につ いて (通知) 食安監発第 0829009 号． ６．堀江正男，大石充男，石川ふさ子，新藤哲也，安井明子，伊東弘一 (2005)．キャピラリ ー電気泳動による食品中のサイクラミン酸の分析，日本食品衛生学会第 90 回学術講演要旨 集，40． ７．小林千種，中里光男，牛山博文，川合由華，立石恭也，安田和男 (1999)．HPLC による 食品中の合成甘味料の一斉分析法，食衛誌，40, 166-171． ８．小林千種，中里光男，山嶋裕季子，大野郁子，河野美幸，安田和男 (2001)．HPLC によ る食品中のスクラロースの分析法，食衛誌，42, 139-143． ９．守安貴子，中里光男，小林千種，菊池洋子，早野公実 (1996)．HPLC による食品中のア セスルファム K，サッカリン及びアスパルテームの分析法，食衛誌，37, 91-96．. 化学生物総合管理 第 6 巻第 1 号 (2010.3) 25-35 頁 連絡先：〒190-0023 立川市柴崎町 3-16-25 E-mail: Hiroko_Matsumoto@member.metro.tokyo.jp 受理日：2010 年 1 月 12 日.
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