The Journal of AIDS Research Vol.10 No.4 2008
P-001
HIV-1 Pr55Gagの ミ リス トイ ル基 非 依 存 性 ウ イル ス 粒 子 産 生 と感 染 性 青 木 徹12、 清 水 佐 紀1、 浦 野 恵 美 子1,4、浜 武 牧 子1、 寺 嶋 一 夫3、 玉 村 啓 和2、村 上 努1、森 川 裕 子4、 山本 直 樹1、駒 野 淳1 (1国立 感 染 症 研 究 所 ・エ イズ 研 究 セ ン タ ー 、2東京 医 科 歯 科 大 学 生 体 材 料 研 究 所 、3東京 医 科 歯 科 大 学 抱 括 病 理 学 教 室 、4北里 大 学 北 里 生 命 科 学 研 究所) HIV-1 gagの ミ リス トイ ル 化 シ グ ナ ル は効 率 的 な ウ イル ス 粒 子 産 生 に 必須 で あ る。 しか し、 ウ イ ル ス 侵 入 過 程 に お け る ミ リス トイル 化 の 役 割 は ほ と ん ど解 析 され て い な い 。 これ は ミ リス トイ ル 化 非 依 存 的 に ウ イル ス粒 子 を効 率 的 に 産 生 させ る方 法 が 欠 如 して い た こ と が大 き な 原 因 で あ る。 我 々 はgagの ミ リス トイ ル 化 シ グ ナ ル を他 の膜 移 行 シ グ ナ ル 置 換 して も GagのVLP産 生 能 力 を維 持 す る こ とが で き る こ と を示 して き た 。 作 出 した 数 々 の 置 換 変 異 体 か ら高 いVLP産 生 効 率 を与 え るphospholipase C(PLC) delta 1のpleckstrin homology (PH) domainを ミ リス トイル 化 シ グ ナル と置 換 し たPH-gagに 注 目 し解 析 した 。PH-gag-GFP お よ びPH-gag-po1を 用 い た解 析 に よ る と 、PH変 異 体 は野 生 型Gagと よ く似 た細 胞 内 局 在 を 示 し、VLP産 生 効 率 は 野 生 型 の3-4倍 あ り、 ウ イル ス産 生 メ カ ニ ズ ム は野 生 型 と同様 にVps4 依 存 的 で あ っ た 。velocity sedimentation assayに よ る とPH変 異 体VLPの 直 径 はGag-GFPと 比 較 して や や大 き い が、equihbrium density gradient assayに よ る と密 度 はGag-GFP型1 .16g/ml、 gag-pol型1.139/mlで 野 生 型 と ほ ぼ 同 じ比 重 で あ っ た 。 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 の 観 察 に よ る と、 PH-gag-pol変 異 体 の 成 熟 形 態 は野 生 型 と同 様 で あ る こ と が 判 明 した 。VS平Gでpseudotype した レ ン チ ウ イル ス ベ ク タ ー シ ス テ ム を利 用 してPH-gag-polウ イル ス の感 染 性 を調 べ る と 野 生 型 と ほ ぼ 同 程 度 で あ っ た。 本 研 究 に て我 々 は ウ イル ス 侵 入 過 程 に お け るGagの ミ リス トイル 化 の役 割 を初 め て 実 験 的 に証 明 す る こ とに 成 功 した 。 それ はGagの ミ リス トイル 基 が成 熟 ウ イル ス の 形 態 お よ び ウ イル ス感 染 性 に 必 須 で は な い とい うこ とで あ っ た 。 レ トロ ウ イ ル ス 進 化 に お け る ミ リス トイ ル 化 シグ ナル のselective advantageに つ い て 考 察 を加 え る。P-002
Incorporation of non-susceptible bystander cells into HIV-1 Syncytia Hoque Sk Ariful、大 上 厚 志 、 清 水 宣 明 、 田 中 淳 、 大 槻 貴 博 、 星 野 洪 郎 (群馬 大 学 医 学 部)HIV-1 infects cells that express CD4 receptor and a coreceptor, mainly CCR5 or CXCR4, on their surface. Infected cells expressing the viral envelope proteins on their surface interact with uninfected target cells and frequently form syncytia or multinucleated giant cells . Cells lacking CD4 receptor or a proper coreceptor are almost completely non-susceptible to HIV-I infection and have not been thought to be involved in syncytia formation. In this study we examined whether some types of these non-susceptible cells can preferentially be incorporated into syncytia. We transfected HIV-1-LTR-GFP genes to HIV-I-non-susceptible cells and cell clones that were mostly negative for GFP but expressed GFP in the presence of HIV-I Tat protein were isolated. Co-cultures of these non-susceptible cells harboring GFP genes and HIV-1-susceptible cells were infected with HIV-1 and were observed for syncytia formation and GFP expression for up to one week . HIV-1-non-susceptible NP-2 cells expressing CD4 and an inappropriate coreceptor were incorporated into 4-12% of syncytia . NP-2 cells expressing either CD4 or a proper coreceptor alone or NP-2 cells lacking both CD4 and HIV-I coreceptors were similarly incorporated into syncytia. Other cells, HOS, U251 and HeLa, were also incorporated into 1-9% of syncytia formed in NP-2 cells . We showed that several types of cells lacking the expression of either CD4 or HIV-1 coreceptors or both were frequently incorporated into syncytia induced by HIV-I, suggesting that non-susceptible bystander cells may also be incorporated into syncytia formed in vivo.
P-003
GB virus-C (GBV-C)感 染 は如 何 に してHIV感 染 を 抑 制 す るか?:タ イ 北 部 ラ ンパ ー ン県 コ ホ ー ト調 査 とin vitro感 染 実 験 に よる 検 討森内昌子1、森 内浩幸1、有吉紅 也2
(1長崎大学大 学院医歯 薬学総合 研究科感 染免疫 学、2長
崎大 学熱帯 医学研
究所臨床医学部 門)
【背 景 と 目的 】 昨 年 我 々 は 、 タ イ 北 部HIV感 染 者 コ ホ ー ト調 査 の 結 果 、HIV陽 性 者712名 中GBV-C 陽 性 率 は67名(9.4%)で 、GBV-C感 染 者 は 非 感 染 者 と比 べ 有 意 にHIV loadが 低 く 、CD4+T細 胞 数 が 多 く、AIDS発 症 率 が 低 く 、 生 存 予 後 が 良 好 で あ る こ と を 示 した 。 今 回 は 、GBV-Cのgenotypeの 違 い がHIV感 染 に 及 ぼ す 影 響 を コ ホ ー ト調 査 と 感 染 実 験 の 両 面 で 検 討 した 。 【材 料 と方 法 】 コ ホ ー トのGBV-C陽 性 例 でEnv領 域 のsequencingに よ る遺 伝 子 型 同 定 を 行 い 、 型 別 にHIV感 染 との 関 わ り を 検 討 した 。 ま たGBV-C genotype 2 (G2)の 感 染 性 分 子 ク ロ ー ン を 元 に 、 Env領 域 の み をG3ま た はG4と 置 換 し た 感 染 性 ク ロ ー ン(G3Env-in-G2, G4Env-in-G2)を 作 成 し 、 健 康 人 末 梢 血 単 核 球 にNucleofectionで 導 入 し2週 間 培 養 後 にNL43Luc-R(-)E(-)/JRFL-Env(R5-tropic)ま た は/MLV-Env(amphotropic)に よ る 単 回 感 染 実 験 を 行 い 、HIV-1 proviral DNA/RNAをreal-time (RT-)PCRで 測 定 し た 。
【結 果 】GBVC陽 性 者67名 中G2(欧 米 型)が19名(28%)、G3(東 ア ジ ア 型)が33名(49%)、G4(東 南 ア ジ ア 型)が15名(22%)で あ っ た 。ARV未 使 用 者 に 限 り解 析 す る と 、G2感 染 者 で はCD4+T細 胞
数 もHIVloadも 非 感 染 者 と の 比 較 で 有 意 差 が あ っ た が 、G3ま た はG4感 染 者 で は 明 ら か で な か っ た 。 一 方、GBVC/HIV-1重 感 染 実 験 で はG2, G3Env-in-G2, G4Env-in-G2の い ず れ も 同 等 にHIV感 染 初 期 過 程 に 抑 制 作 用 が あ り、R5-HIV-1だ け で は な くamphotropicに 改 変 したHIVに も 及 ん だ 。 【考 察 】 コ ホ ー ト調 査 か ら は 、GBV-Cの 中 で もG2の 抗Hrv作 用 が 最 も 強 い こ と が 示 唆 さ れ た 。 一
方 感 染 実 験 で 用 い たGBV-Cク ロ ー ン間 で 顕 著 な 差 が 認 め ら れ な か っ た 理 由 と し て 、Env以 外 の 領 域 に 抗HIV因 子 が コ ー ド さ れ て い る か 、 ま た はin vivoの 単 純 な 感 染 実 験 で は 反 映 さ れ な い 宿 主 と の 複 雑 な 相 互 作 用 か ら抗HIV作 用 を発 揮 して い る の か も知 れ な い 。
【共 同 研 究 者 】 冨 永 典 男 、 長 沼 成 子 、H. Thaisri, A. Rojanawiwat, P. Sawanpanyalert, P. Pathipvanich
P-004
Hierarchical actions of HIV-1 Nef on Hck determine maturation arrest of cytokine receptor, FmsRanyaHassan、 鈴 伸 也 、 日吉 真 照 、 岡 田誠 治 (熊本 大 学 エ イ ズ 学 研 究 セ ンタ ー予 防 開 発 分 野)
HIV-1 Nef binds and activates a Src kinase Hck, causing the progression to AIDS through
uncharacterized
processes. We recently identified an Hck-dependent function of Nef, the
inhibition of N-glycosylation maturation and transport to the cell surface of Fms, the receptor
for macrophage-specific
cytokine M-CSF. Interestingly, mutant studies revealed that the
activation of Hck was necessary but not enough for the Nef-induced Fms maturation arrest.
Here, we show that direct Nef-Hck binding is another factor requisite for Fms maturation
arrest. PP2, a pharmacological inhibitor of Src kinases, blocked the Nef/Hck-induced Fms
maturation arrest. Importantly, a recently isolated small molecule compound 2c also blocked
the Fms maturation arrest by inhibiting Nef-Hck binding but not by directly inhibiting the
kinase activity of Hck. Furthermore, studies with Nef alleles derived from different HIV-1
strains (NL43 and SF2) revealed a clear correlation between their affinity for Hck and their
abilities to induce activation of Hck and Fms maturation arrest. All these activities of NL43
Nef, a less potent allele, became almost equivalent to those of SF2 Nef, when an amino-acid
residue within the proline-rich region of NL43 Nef was changed to the SF2-type residue. We
previously demonstrated that Hck activated by Nef mainly localized to the Golgi apparatus
where a pool of Nef pre-localized. Therefore, the data presented here support the idea that
the hierarchical actions of Nef, i.e. the direct binding to Hck followed by the activation of Hck
at the Golgi, determine Fms maturation arrest.
The Journal of AIDS Research Vol.10 No.4 2008
P-005
Down-regulation of CD1 lipid/glycolipid antigen presentation by HIV-1 Nef in immature dendritic cells新 谷 英 滋 、 大 脇 敦 子 、清 水 真 澄 、 渡 邊 恵 理 、松 村 次 郎 、 八 木 幸 恵 、 高 久 千 鶴 乃 、高 橋 秀 実
(日本 医 科 大 学 微 生 物 学 ・免 疫 学 教 室)
HIV-1 seems to be captured, maintained and expanded in dendritic cells (DCs) rather than
CD4-positive T lymphocytes. Therefore, to control HIV-1 infected/captured
DCs might
provide another strategy to conquer the fatal virus. Such DCs are expressing not only
conventional MHCs but CD1s, non-MHC lipid/glycolipid antigen-presenting molecules . We
have already reported that, in addition to the MHC molecules , HIV-1 Nef down-modulated
surface expression of CD1a and CD1d that present lipid/glycolipid antigens to CD1-restricted
CTLs and NKT cells, respectively.
Moreover, using CD1a-restricted CTL clone, we have
shown that HIV-1 Nef actually down-regulated CD1a lipid antigen presentation. In this study,
we have designed a series of mutant HIV-1 nef gene to analyze the interference of HIV-1 Nef
with CD1 lipid antigen presentation. The effect of Nef and its mutants on CD1a surface
expression was analyzed by fluorescence activated cell sorting (FACS) analysis and their
intracellular localization was observed using laser scanning confocal microscope to clarify the
molecular basis of the intra-molecular interaction between Nef mutants and CD1 . The results
would support the involvement of such CD1-restricted immune effectors in the protective
immunity against infected DCs that seem to be the principal targets for controlling
HIV-infection.
P-006
A MOLECULAR MECHANISM BY WHICH TAT AFFECTS THE GROWTH OF TOMATO PLANTSMarni Cueno1、 唐 松 克 夫2,3、保 富 康 宏2,3、Antonio Laurena4、 岡本 尚1 (1名古 屋 市 立 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 細 胞 分 子 生 物 学 、2医薬 基 盤 研 究 所 霊 長 類 医 科 学 研 究 セ ン タ ー 、3三重 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 免 疫 制 御 分 野 、
4Biochemistry Laboratory
, Institute of Plant Breeding, University of the
Philippines Los Banos)
Plant-made vaccines have grown to be an ideal method for vaccine production due to its
ability to induce mucosal immunity, relatively cheaper production cost and affordability.
These reasons have justified the concept of producing an AIDS edible vaccine . We had
previously shown that a naturalized expression of the tat gene in tomato, made through
codon-optimization and suppressor mutation, is capable of inducing both humoral and cellular
immunogenic responses in mice. However, noticeable abnormalities were seen in the tomato
plantlet starting at 3 weeks-old which includes tissue whitening, absence of root formation
and stunted growth which eventually leads to death at 8 weeks-old , an observation also seen
when tat was expressed in transgenic mouse. In an attempt to avoid the observed plant
abnormalities, protein analysis of the likely affected enzyme, cytokinin oxidase, and sequence
profiling for mutagenic studies were performed. Western blot assay on tat- and
m-tat-bombarded tomato using anti-CKO produced a smaller CKO band size compared to the
control suggesting that CKO is affected by the presence of Tat. Further analysis using 3'
RACE shows the absence of one of the gene isoforms of CKO possibly as a consequence of
Tat. Sequence comparison of the tat gene and the chloroplast genome showed a similar
Arg-rich motif in both sequence profiles. In addition, the RGD motif found in the tat gene which is
known to be extracellularly excreted outside the mammalian cell has the same affect on
tomato tissues.
P-007
グラム陰性嫌気性菌 感染症 による クロマチ ン修飾 を介す る潜伏HIVの 賦
活化
今井健一 、 岡本
尚
(名古屋市立 大学大学院医学研究科 細胞分子生物)
【目的 】HIV潜 伏 感 染 の 維 持 と そ の破 綻 機 構 の 解 明 は エ イ ズ の 蔓 延 防 止 を考 え る上 で重 要 で あ る。 転 写 抑 制 因 子 に よ っ てLTR周 辺 に 呼 び 込 まれ たHDACは 近 傍 の ヒ ス トン を脱 ア セ チ ル 化 す る こ とに よ り 、HIVの 転 写 を積 極 的 に抑 制 して潜 伏 感 染 を維 持 す る 。 しか しな が ら、 潜 伏 感 染 の 破 綻 が い つ 、 ま た ど の よ う な状 況 下 で 起 こ る か に つ い て は報 告 が な い 。今 回 、 成 人 の 多 くが罹 患 して い る歯 周 病 の 原 因 菌 で あ るPorphyromonas gingivalisが 酪 酸 を 産 生 して 潜伏 感 染HIVを 活 性 化 す る こ と を見 出 した の で 報 告 す る 。 【結 果 】HIV潜 伏 感 染 細 胞 に 、P.g菌 体 やLPS、 線 毛 な ど を作 用 させ て もHIVの 活 性 化 は 認 め られ な か った が 、P.gの 培 養 上 清 に よ りHIVの 複 製 が 強 く活 性 化 され た 。 培 養 上 清 中 のHIV 活 性 化 能 を有 す る分 画 が低 分 子 で あ る こ とが 示 唆 され た の で 低 分 子 脂 肪 酸 に着 目 した 。 ガ ス ク ロ に よ る 定 量 の 結 果 、P.g培 養 上 清 中 に は種 々 の 短 鎖 脂 肪 酸 が認 め られ 、 解 析 を進 め た と こ ろ酪 酸 がHIVの 活 性 化 を引 き起 こす 事 を 見 出 し た 。 実 際 に酪 酸 に はHDAC阻 害 作 用 が あ る こ とが 報 告 され て い るの で 詳 細 な 分 子 機 構 を検 討 した 。 そ の 結 果 、P.g上 清 は ヒ ス トンの ア セ チ ル 化 を促 進 す る こ と に よ りLTRを 転 写 レ ベ ル で 活 性 化 した 。ChIP assayの 結 果 、P.g上 清 処 理 に よ りHADCと 転 写 抑 制 因 子 のLTRか らの 遊 離 と、 ヒ ス トンの ア セ チ ル 化 やPolIIのLTRへ の リ クル ー トな どが認 め られ た 。 【結 論 と考 察 】 歯 周 病 菌 が 酪 酸 を介 して ク ロ マ チ ン を非 活 性 化 型 か ら活 性 型 に 構造 変 換 す る こ と に よ りHIVを 活 性 化 す る こ とが 明 らか と な っ た 。 以 上 の 結 果 は 、 細 菌 感 染 症 とHIV が 転 写 レベ ル で 密 接 に 関 連 して い る こ と を示 す 。 最 近 、 腸 管 で のHIV活 性 化 が初 期 の エ イ ズ 進 展 に重 要 で あ る こ とが示 され て い るが 、 腸 管 細 菌 も歯 周 病 菌 同様 に酪 酸 を 放 出 す る こ とか ら 、細 菌 感 染 症 の 治 療 が エ イ ズ の進 展 予 防 につ な が る可 能 性 が 強 く示 唆 され る。 (本研 究 は 日本 大 学 歯 学 部 細 菌 学 落 合邦 康 教 授 との 共 同研 究 で あ る)P-008
SIV Gag CAのN domainの 変 異 に 対 す るC domainの 代 償 性 変 異稲垣奈都子 、川 田真幹、俣野哲朗
(東京大学 医科 学研 究所感染症 国際研 究セ ンター)
【目的 】HIV感 染 症 に お け る宿 主 免 疫 反 応 の 影 響 を考 え る う えで 、 そ の抑 制 に 中心 的働 き を して い る細 胞 傷 害 性Tリ ンパ 球(CTL)が 、 どの 程 度 多 様 な ウ イル ス の 複 製 に抑 制 効 果 を 与 え う るか と い う こ と を知 る こ とは 重 要 で あ る 。 わ れ わ れ は これ ま で 、MHG-Iハ プ ロ タ イ プ90-120-Iaを 有 す る ア カ ゲ ザ ル で 、 サ ル 免 疫 不 全 ウ イル スSIVmac239に 強 い抑 制 効 果 を有 す るGag206-216特 異 的CTLを 同 定 し た が 、 このCTLは 、 同 じGag206-216配 列 を有 す る Sr▽emE543-3を 認識 で きな か った 。 その 原 因 は 、エ ピ トー プ近 傍 の1ア ミノ酸 の 違 い(Gag205D →E)に よ る も の と考 え られ た 。本研究 では、 このGag CA内 の1ア ミノ酸 の違い がSIV複 製 に 及 ぼ す 影 響 を知 る 目的 で 、Gag205D→E置 換 を行 っ たSIVmac239Gag205Eを 作 製 し、 そ の複 製 能 を検 討 した。 【方 法 】SIVmac239感 染 性 分 子 ク ロ ー ン を 基 に 、Gag205DがEに 置 換 され た 変 異 体 SIVmac239Gag205Eを 作 製 し、 サ ルT細 胞 株 お よび ヒ トT細 胞 株 の 培養 系 に お い て 、 そ の 複 製 能 を解 析 した 。 【結 果 】SIVmac239にGag205D→E置 換 を加 え る こ と に よ り複 製 能 が損 な わ れ た 。 そ こで 、 SIVmac239とSIVsmE543-3のCA内 の 配 列 の 異 な る ア ミ ノ酸 につ い て 、 各 々 をSIVsmE543-3 配 列 に置 換 す る 変 異 をSIVmac239Gag205に 加 え た 変 異 体 を作 製 した 。 これ らの複 製 能 を検 討 し た と こ ろ 、Gag205に 加 えGag312又 はGag340をSIVsmE543-3由 来 に 置 換 し た SIVmac239Gag205E312Pお よびGag205E340Mの 複 製 能 は回 復 す る こ とが 判 明 した 。 【考 察 】Gag205D→E置 換 に よ るSIVmac239の 複 製 能 の低 下 が 、Gag312A→P置 換 あ るい は Gag340V→M置 換 に よ り回 復 す る こ とが 明 ら か と な っ た 。Gag205はCAのNド メ イ ン 、 Gag312お よ びGag340はCド メ イ ン に位 置 す る こ と か ら、異 な る ドメ イ ン間 の相 補 的 な 関係 が 示 唆 され た 。The Journal of AIDS Research Vol.10 No.4 2008
P-009
HIV-1ゲ ノ ムRNAに お け るpoly(A)付 加 部 位 に関 す る研 究 柴 田潤 子1,2、岩 谷 靖 雅1、 任 鳳 蓉2、 田 中 博2、 杉 浦 亙1(1国立 病 院 機 構 名 古 屋 医療 セ ン ター 臨 床 研 究 セ ン ター 、2東京 医科 歯 科 大 学 大 学 院 生 命 情 報 科 学 教 育 部)
【目 的 】HIV-1ゲ ノ ムRNAは 宿 主 細 胞 のmRNAの プ ロ セ シ ング を利 用 して い る た め 、 転 写 後 、 5'末 端 はCap化 、3'末 端 は ポ リア デ ニ ル 化 され る。 こ の た め 、真 核 細 胞 のmRNA同 様 、 HIV-1ゲ ノ ムRNAに お け る ポ リア デ ニ ル 化 は 、3' LTRのR領 域 に 存 在 す るpoly(A)付 加 シ グ ナ ル[AAUAAA】 が宿 主 因子 に 認 識 され る こ とに よ り、その約20bp下 流 に存在 す るCA配 列 が エ ン ドヌ ク レア ー ゼ に よ り切 断 され た後 、 アデニ ンの連続 的付加 が生 じると考 え られてい る。HIV-1の 場 合 、 エ ン ドヌ ク レ ア ー ゼ切 断 部 位 がLTRのR領 域 の3'側 で あ る と規 定 され て い るが 、切 断 部 位 や 切 断 の 規 則 性 に つ い て は 必 ず し も明 らか に な って い ない 。 そこで我々 は 、poly(A)付 加 に お け る遺 伝 子 配 列 の 規 則 性 に つ い て 解 析 した 。
【方 法 】NL4-3の 培 養 上 清 また はHIV感 染 者 血 漿 よ り ウ イ ル ス ゲ ノ ムRNAを 抽 出 し、poly d(T)16プ ラ イマ ー を用 い て逆 転 写 反 応 を行 い 、HIV-1 cDNAを 合 成 し た。 その後 、PCRに よ りcDNA3'末 端 を増 幅 し、3' LTR領 域 の 配 列 解 析 を行 っ た 。 【結 果 ・考 察 】HIV-1遺 伝 子 配 列 情 報 バ ン ク か ら配 列 を比 較 した と こ ろ、poly(A)付 加 シ グ ナル は よ く保 存 され て い る に も関 わ らず 、R領 域 とU5領 域 の 遺 伝 子 配 列 は保 存 性 が 低 い こ と を見 出 した。NL4-3(25ク ロ ー ン)、HIV感 染 者 検 体(7検 体 、34ク ローン)の配列解析 を行 っ た と こ ろ、 全 て の ク ロ ー ン に お い てpoly(A)付 加 シ グ ナ ル は保 存 され て い た 。 それに対 し、 NL4-3分 子 ク ロー ンで は25ク ロー ン 中22ク ロ ー ンで 、 シ グ ナ ル 配 列 よ り17bp下 流 のCA配 列 がpoly(A)付 加 部 位 と な っ て お り、 また 、HIV感 染 者 検 体 で は34ク ロ ー ン 中25ク ロー ンで 、 シグ ナル 配 列 よ り15-18bp下 流 のCA配 列 がpoly(A)付 加 部 位 とな って い たの に対 し、残 りの ク ロ ー ンは 異 な る配 列 が ポ リア デ ニ ル 化 され て い た 。 以 上 の 結 果 は 、poly(A)付 加部位 、 つ ま り3' LTRのR領 域 とU5領 域 の 境 の配 列 に は ゆ ら ぎ が存 在 す る こ と を示 した。今 後 、 ク ロ ー ン数 を増 や し、 さ らに 解 析 を行 う予 定 で あ る。
P-010
感 染 細 胞 内 でHIVコ ンポ ー ネ ン トの 自壊 を もた らす 機 序 の解 明 天 野 将 之1、 〓 康 博1、 田 宮 貞 宏2、 満 屋 裕 明1,3 (1熊 本 大 学 大 学 院 医 学 薬 学 研 究 部 血 液 内 科 学 ・感 染 免 疫 診 療 部 、2玉名 中 央 病 院 内 科 、3Experimental Retrovirology Secdon, HIV and AIDS Malignancy Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health)HIV-1感 染 細 胞 内 にお いて 合 成 され たGag前 駆 体 は 、 ウ イ ル ス 粒 子 と して 出芽 す る間 も し く は 出芽 直 後 にHIV-1プ ロ テ ア ー ゼ(PR)に よ っ て切 断 され 、 成 熟 した ウ イル ス蛋 白 とな る。 我 々 は 以 前 、 長 期 間HAART療 法 を受 け て 治 療 不 応 性 と な っ た 患 者 よ り分 離 され た複 数 の 多 剤 耐 性 臨床 分 離HIV-1株 を用 い て 、Gag領 域 のcleavage site周辺 に挿 入 変 異 が 入 る こ とで 、 基 質 で あ るGag蛋 白 に対 す る耐 性 変 異HIV-1PRの 酵 素 活 性 が 改 善 す る こ と を報 告 した 。 今 回 我 々 は これ らの 複 数 の 多 剤 耐 性 臨 床 分 離HIV-1株 由来 の 挿 入 変 異 を有 す るGag領 域 を導 入 した 感 染 性 変 異HIV-1NL4-3 plasmidsお よび 人 工 的 にGag領 域 の ラ ン ダ ム な位 置 に ア ミ ノ酸 配 列 を挿 入 した 感 染 性 変 異HIV-1 NL4-3 plasmidsを 多 数 作 成 して 、 挿 入 変 異 のHIV-1の 構 造 的 特 性 へ の 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 作 成 したplasmidsをCos7細 胞 お よ びHEK293細 胞 に transfectionし 、 そのcell lysateを用 い てHIV-1 P24抗 体 でwestern blottingを行 っ た と こ ろ 、 異 常 なGagの 変 性 が 起 こ り、degaradation(自 壊 又 は破 壊)productsが 出現 した 。 この 事 よ りGag領 域 の 挿 入 変 異 がGag前 駆 蛋 白のprocessingに 影 響 を与 え 、Gag蛋 白 を分 解 の 方 向 に 進 ま せ る何 ら か の機 序 が 存 在 す る と考 え られ た 。 新 た な創 薬 の タ ーゲ ッ トとな り う る 当現 象 の機 序 を解 析 し、更 にGagdegradationとGag挿 入 変 異 部 位 との 関 連性 、ELISA法 を用 い た 各 変 異 体 に お け る 経 時 的 なGag蛋 白 抗 原 性 の 変 化 、 阻 害 剤 を用 い る こ と に よ りGag degradationへ の 宿 主 細 胞 側PRや プ ロ テ オ ソ ー ム の 関 与 の 有 無 な ど に つ い て 検 討 を行 っ た の で 報 告 す る 。
P-011
HIV-1プ ロテ ア ー ゼ にお け る 耐性 変 異L89Vの 立 体 的 影 響 大 出裕 高1、横 山 勝1、 佐 藤 裕 徳1、 伊 部 史 朗2、 藤 崎 誠 一 郎2、 間 宮 均 人2、 濱 口元 洋2、 杉 浦 亙2,3、横 幕 能 行2 (1国立 感 染 症 研 究 所 病 原 体 ゲ ノ ム解 析 研 究 セ ン タ ー 、2国立 病 院 機 構 名 古 屋 医 療 セ ン ター臨 床 研 究 セ ンタ ー、3国立 感 染症 研 究 所 エ イ ズ研 究 セ ン ター) 【目的 】HIV-1プ ロ テ ア ー ゼ にお け る さ ま ざ ま な変 異 が 阻 害 薬 へ の 耐 性 に 関 わ る こ と が知 ら れ て い る。L89V変 異 は非 薬 物 結 合 部 位 で 生 じる耐 性 変 異 の ひ とつ で 、DRV耐 性 へ の 関連 が 報 告 され て い る 。本 研 究 で は 、L89V変 異 に よ る、DRVお よ び 、DRVと 構 造 の 類 似 したAPV のHIV-1プ ロ テ ア ー ゼ との 結 合 へ の 影 響 を 、 コ ン ピュ ー タ シ ミ ュ レ ー シ ョン を 用 い て調 査 した 。 【方 法 】 分 子 動 力 学 シ ミュ レ ー シ ョ ンを適 用 し、subtype B wild-type (HXB2)プ ロテ ア ーゼ お よびL89Vプ ロ テ ア ー ゼ の 阻 害 薬 と の複 合 体 構 造 を予 測 した 。阻 害 薬 と して 、DRVお よび APVを 対 象 と し た 。 シ ミュ レ ー シ ョン プ ロ グ ラ ム に はAMBER9、 力 場 パ ラ メ ー タ ー に は ff03お よびgaffを 用 い 、3.0ナ ノ秒 の シ ミュ レ ー シ ョ ン を行 った 。 初 期 構 造 に は 、HIV-1プ ロ テ ア ー ゼ とDRVあ るい はAPVと の 複 合 体 のX線 結 晶 構 造(PDB code:1 T3R、1HPV)を 用 い た 。 予 測 した複 合 体 構 造 を も と に 、MM/PBSA法 を 用 い て 、 阻 害 薬 の 親 和 性 を 推 定 した 。 【結 果 】 シ ミュ レ ー シ ョ ンの 結 果 、L89V変 異 は 、DRV結 合 時 に 、 変 異 箇 所 か ら遠 く離 れ た 80ル ー フ.付近 の 構 造 に 間 接 的 に影 響 を与 え る こ と が示 唆 され た 。 こ の構 造 変 化 は 、DRVの 親 和 性 をわ ず か な が ら低 下 させ た 。 一 方 、APVの 結 合 時 に お い て も、DRV結 合 時 と比 べ る と小 さい もの の 、 同様 に80ル ー プ で の 構 造 変 化 が 見 られ た 。 しか し、L89Vの 単 独 変 異 で は 、 DRVの よ うなAPVへ の 親 和 性 の低 下 は見 られ な か っ た。 こ れ らの 親 和 性 予 測 の 結 果 は 、耐 性 変 異 情 報 を ま と め た最 新 のIntemational AIDS Society (IAS)-USAの 報 告 と も一 致 す る。【結 論 】L89Vが 、非 薬 物 結 合 部 位 で の 変 異 に も 関 わ らず 、DRVの 親 和 性 に影 響 す る こ と を 示 唆 した 。
P-012
HIV-1薬 剤 耐 性 変 異 の 感 染 者 集 団 に お け る固 定/消 失 時 間 の 解 析 椎 野 禎 一 郎1、 貞 升 健 志2、 長 島 真 美2、 杉 浦 亙1,3 (1国立 感 染 症 研 究 所 エ イ ズ研 究 セ ン ター 、2東京 都 健 康 安 全 研 究 セ ン タ ー 微 生 物 部 、3国立 病 院 機 構 名 古 屋 医 療 セ ン タ ー臨 床 研 究 セ ン タ ー) 目的 HAARTの 一 般 化 に伴 い 、 薬 剤 耐 性 変 異 を持 つHIV-1が 新規 感 染 を 引 き起 こす 可 能 性 が危 惧 され て い る。 薬 剤 耐 性 変 異 が新 規 感 染 者 に伝 播 した 可 能 性 に つ い て は既 に 多 数 の 報 告 例 が あ り、 そ の 可 能 性 は 薬 剤 と変 異 の種 類 に よ っ て様 々 で あ る こ とが わ か っ て い る。 選 択 的 に 中立 で ない 変 異 の 固 定 消 失 時 間 は 、 集 団 の 大 き さ、 選 択 係 数 、 初 期 の 変 異 頻 度 に よ っ て決 定 され る。 そ の た め 、 個 々 の薬 剤 耐 性 変 異 の消 失 時 間 を一 般 化 す る こ と は 、 薬 剤 耐 性 の疫 学 的 コ ン トロ ー ル に お い て 重 要 で あ る 。 本 研 究 で は 、感 染 者 集 団 か ら得 られ たpol領 域 の 遺 伝 子 配 列 を系 統 樹 を用 い て 解析 し、 個 々 の 薬 剤 耐 性 変 異 の 出 現 した 時 期 を検 出す る こ と で 、 薬 剤 変 異 の 固定 消 失 時 間 を知 る こ と を 目的 と した 。 方 法 2004年 か ら2007年 に か け て東 京 都 内 に お い て 抗 体 検 査 に よ りHIVの 感 染 が確 認 され た症 例 よ り、 延 べ479検 体 を採 取 し、RT-PCR∼ 直 接 シ ー ケ ン ス 法 に よ っ てRT領 域 お よ びprotease 領 域 の 塩 基 配 列 を得 た 。 これ らの 配列 か らNJ法 に よ る系 統 樹 を作 成 し、 耐 性 変 異 の系 統 樹 上 で の 分 布 を得 た 。 次 に 、NJ法 に よ る系 統 樹 の トポ ロ ジ ー を ガ イ ドに して 最 尤 法 に よ る系 統 樹 の 再 構 成 を行 い 、 各 分 岐 に お け る祖 先(MRCA)の 塩 基 配 列 と 出現 時 間 を推 定 した 。 この 推 定 値 か ら、個 々 の 薬 剤 耐 性 変 異 の消 失 速 度 の 算 出 を試 み た 。 結 果 未 治 療 患 者 の 検 体 か ら検 出 され た 主 な 薬 剤 耐 性 変異 は 、RT領 域 のM41L, K103N, V108I, T215F、 protease領 域 のM36I/L, M46I/L, L63P, A71V/T, V77I, V82Iで あ っ た。RTの103,210,215およびproteaseの63,71,77の 座 位 に は 、上 記 の 耐 性 変 異 の他 に 自然 多 型 ま た は復 帰 変 異 とみ ら れ る 多型 が存 在 し た。 これ らの耐 性 変 異 ア リル の 消 失 時 間 に つ い て 、 学 会 に て報 告 す る。
The Journal of AIDS Research Vol. 10 No. 4 2008
P-013
酵 素活 性 を 指 標 と した 新 規HIVプ ロ テ ア ー ゼ 薬 剤 耐 性 検 査 法 の 開 発 正 岡 崇 志1、 梁 明秀1、 巽 正 志1、 杉 浦 亙1,2、森 下 了3、 澤 崎 達 也4、 山本 直 樹1 (1国立 感染 症 研 究 所 エ イズ 研 究 セ ン ター 、2国立 病 院機 構 名 古 屋 医療 セ ン ター 臨 床 研 究 セ ン タ ー感 染 免 疫 研 究 部 、3株式 会 社 セル フ リ ー サ イ エ ン ス 、4愛 媛 大 学 無 細 胞 生 命 科 学 工 学 研 究 セ ン ター) 薬 剤 耐 性HIV検 査 は 、新 規 感 染 者 お よび 長 期 療 養 患 者 に対 す る適 切 な 治 療 を行 う上 で 欠 か せ な い検 査 と位 置 づ け られ て い る 。薬 剤 耐 性 検 査 と して は 、現 在 「遺 伝 子 型 検 査 」 と 「表 現 型 検 査 」 が 行 わ れ て い るが 、 そ れ ぞ れ に 長 短 所 が あ り、 ま た実 際 の 酵 素 活 性 を指 標 と し て い な い た め 正 確 に薬 剤 耐 性 を反 映 しな い 事 例 も生 じて い る。我 々は、 コムギ胚 芽無細胞 タ ンパ ク質 合 成 シ ス テ ムお よび 化 学 増 幅 型 ル ミネ ッセ ン ス プ ロ キ シ ミテ ィー ホモ ジニ ア ス ア ッ セ イ(ア ル フ ァ ス ク リー ン)を 用 い て 、 プ ロ テ ア ー ゼ タ ンパ ク質 の 酵 素 活 性 を 指 標 と し た 、 あ た ら しい 薬 剤 耐 性 検 査 の 基 盤 技 術 の 開 発 に成 功 した 。 本 手 法 は 、 薬 剤 耐 性 患 者 血 清 中HIV-1プ ロ テ ア ー ゼ遺 伝 子 をPCR法 で増 幅 し、2nd PCR時 に転 写 開始 領 域 、 翻 訳 エ ンハ ンサ ー領 域 、 お よび3'UTR領 域 を付 加 す るだ けで 、 鋳 型 遺 伝 子 の準 備 が可 能 とな り、 発 現 ベ ク タ ーへ の サ ブ ク ロ ー ニ ング 操 作 を ま っ た く必 要 と しな い 。 これ らの鋳型 をもとに全 自 動 タ ンパ ク質 合 成 ロ ボ ッ トを用 い て384種 類 の タ ンパ ク質 を一 晩 で合 成 し、未 精 製 の ま ま ア ル フ ァ ス ク リー ン に よ り酵 素 活 性 をハ イ ス ル ー プ ッ トで測 定 す る こ と が 可 能 で あ る 。本 手 法 を用 い て 、21例 のHIV患 者 血 清 よ り得 られ たHIVプ ロ テ ア ー ゼ に対 す る阻 害 剤 の効 果 を測 定 し、遺 伝 子 型 検 査 法 に よ る薬 剤 耐 性 予 測 結 果(http://hivdb. stanford. edu/)と 比 較 検 討 を 行 っ た と こ ろ 、 お お よ そ80%以 上 の サ ン プ ル に お いて 遺 伝 子 型 検 査 と の相 関 が 認 め られ た 。 ま た 、6例 の 分 子 ク ロ ー ン化 した薬 剤 耐 性 プ ロ テ ア ー ゼ を用 い た 解 析 で は 、表 現 型 検 査 法 に よ る結 果 と有 意 な相 関 が 認 め られ た。 本 法 はGenotype法 とPhenotype法 を結 ぶ タ ンパ ク質 レ ベ ル の 薬 剤 耐 性 検 査 法 と して位 置 づ け られ 、短 期 間 で 安 価 に 適 切 な薬 剤 耐 性 情 報 を提 供 で き る た め 、患 者 本 位 の テ ー ラー メ ー ド医療 の 実現 に貢 献 す る もの と期待 され る。P-014
PCRとLC-MSを
組み合 わせ た薬 剤耐性変異定量法 の検 討
須藤弘二 、加藤 真吾
(慶應義塾大学 医学部微生物学 ・免疫学教 室)
【目 的 】 昨 年 、 我 々 は微 小 集 団 の 薬 剤 耐 性 変 異 を定 量 す る た め にPCRとLC-MSを 組 み 合 わ せ た新 しい 方 法(PCR-MS法)を 開 発 し、 本 学 会 で 発 表 した 。 今 年 は 、方 法 を改 良 し検 出 限 界 と精 度 の検 討 を行 っ た 。 ま た実 際 の 患 者 血 漿 を用 い て 血 中薬 剤 耐 性 ウ イル ス の 割 合 の 推 移 を測 定 した 。 【方 法 】HIV-1 LAI株 及 び 患 者 由 来 多 剤 変 異 株 の 培 養 上 清 を陰 性 血 漿 で希 釈 し、 多剤 耐 性 株 を50、20、5、2、0.5、0.2%含 むp24抗 原 濃 度10pg/ml標 準 液 を 作成 した 。 検 出限 界 の検 討 と して 、 これ らの 標 準 液500 μlからRNAを 抽 出 し、PCR-MS法 で プ ロ テ ア ー ゼ領 域L90、 逆 転 写 酵 素 領 域K103、M184、T215の 薬 剤 耐 性 変 異 の 割 合 を測 定 した 。精 度 の 検 討 と して 、 多 剤 耐 性 株 を50、5、0.5%含 む標 準 液 を上 記 耐 性 変 異4箇 所 で5回 つ つ 測 定 した 。 ま た 臨 床 検 体 測 定 の検 討 と して 、d4T+3TC+NFV投 与 か らd4T+ddI+EFV投 与 に 薬 剤 を 変 更 した患 者 か ら継 続 的 に 採 血 して い た 血 漿 を 用 い 、 逆 転 写 酵 素 領 域M184に つ い て 、 時 間 の 推 移 と薬 剤 耐 性 変 異 の 割 合 をPCR-MS法 で 測 定 した 。 【結 果 】 プ ロテ ア ー ゼ領 域L90、 逆 転 写 酵 素 領 域K103、M184は 変 異 株 率0.2%ま で 定 量 可 能 で あ り、 逆 転 写 酵 素 領 域T215は 変 異 株 率0.5%ま で 定 量 可 能 で あ った 。 実 験 内 誤 差 は変 異 株 率50%でCV3.9∼8.2%、 変 異 株 率5%でCV4.6∼18.0%、 変 異 株 率0.5%でCV28.1∼57.2%で あ っ た 。 薬 剤 を変 更 し た臨 床 例 の 場 合 、 変 更 後9ヶ 月 間 にM184V耐 性 株 が野 生 株 に次 第 に置 き 換 わ っ て い る こ とが 測 定 で き た 。 【考 察 】 今 回 の 検 討 で 臨 床 検 体 に お い て も薬 剤 耐 性 変 異 の 割 合 を測 定 す る こ と が で きた 。 今 後 、 さ らに 多 く の 臨 床 検 体 を測 定 し、HAART失 敗 例 に お け る血 中 薬 剤 耐 性 ウ イ ル ス の 割 合 の推 移 や 、 新規 患 者 に お け る薬 剤 耐 性 微 小 集 団等 を調 べ る こ と が重 要 で あ る 。P-015
小 動 物 由 来APOBEC1に よる レ トロ ウ イル ス複 製 阻 害 の 解 析 池 田輝 政1,2、原 田 信 志2、 小 糸 厚1(1熊本 大 学 医 学 薬 学 研 究 部 感 染 制 御 学 、2熊本 大 学 医 学 薬 学 研 究 部 感 染 防 御 学)
【目的 と意 義 】APOBECフ ァ ミ リ ー の プ ロ トタ イ プ で あ るAPOBEC1 (APO1)は 、脱 ア ミ ノ 化 酵 素 部 位 を1ヶ 有 し、 ヒ トに お い て は小 腸 で の ア ポ リポ タ ンパ ク質B mRNAの 部 位 特 異 的editingを 行 い 、 コ レ ス テ ロ ール 代 謝 に 関 与 す る 。我 々 は昨 年 、 種 々 の 小 動 物 来 のAPO1 がVif非 依 存 的 に 強 い抗HIV-1活 性 を示 す こ と を明 らか に し た 。 これ は 、霊 長 類 以 外 の 哺 乳 類 で はAPO1は 脂 質 代 謝 の み な らず 、 レ トロエ レ メ ン トに対 す る 自然 防 御 機 構 と して 広 く 機 能 して い る可 能 性 を示 唆 す る。 本 研 究 で は 、 さ らにSIVmac、SIVagm、FIV、MLVに 対 す る抗 ウ イル ス活 性 を検 討 し、 ま たAPO1に よ るHPV-1複 製 へ の 阻 害機 構 を解 析 した 。 【材 料 と方 法 】6種 の 哺 乳 類 由 来 のAPO1にHAタ グ を付 加 した 発 現 ベ ク タ ー を構 築 し、 抗 ウ イル ス活 性 を調 べ た 。 ま た 、HIV粒 子 へ の 取 り込 み を ウエ ス タ ン ブ ロ ッ トに よ り解 析 し た。 最 も強 力 な 抗 ウ イ ル ス 活 性 を示 し た ウ サ ギAPO1の 脱 ア ミ ノ化 酵 素 活 性 部 位 の 変 異 体 (E63A, E63Q)を 作 製 し同様 に 解 析 した 。 さ らに 、HIV Gagの 欠 損 体 の 発 現 ベ ク ター を用 い APO1のHIV粒 子 へ の 取 り込 み に 関 わ る部 位 の マ ッピ ング を行 った 。
【結 果 と考 察 】 ヒ トAPO1は 抗 ウ イ ル ス 活 性 を示 さな か っ た が 、3種 の げ っ歯 類(ラ ッ ト、 マ ウ ス 、ハ ム ス タ ー)お よ び ウサ ギ のAPO1はHIV-1の み な らずSIVmac、SIVagm、FIV、MLV に対 して 強 い抑 制 活 性 を示 した 。 ま た 、 ウ サ ギAPO1の 変 異 体 の抗 ウ イル ス 活 性 は著 し く 減 弱 し、 主 に脱 ア ミ ノ化 機 構 に よ り抗 ウ イル ス活 性 を示 す こ とが 明 らか と な っ た 。 ま た 、 APO1分 子 は 、APOBEC3と 同 様 にNCと の 相 互 作 用 に よ りHIV粒 子 に取 り込 まれ る こ と が示 唆 され た 。 我 々 の 結 果 は 、 多 くの 哺 乳 類 でAPO1分 子 が 、 宿 主 細 胞 に備 わ る広 範 な 抗 レ ト ロ エ レ メ ン ト制 御 機 構 と し て 機 能 し て い る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。 本 研 究 は 、 P. D. Bieniasz博 士(Aaron Diamond AIDS Research Center)と の 共 同 研 究 で あ る。
P-016
HIV-1 Vifに よ るAPOBEC3G分 解 阻 害 へ のHsp70の 効 果 杉 山 隆 一1、羽 生 勇 一 郎2、長 沼 晴 樹1、小 関 寛1、永 田 崇3、 古 川 亜 矢 子3、 片 平 正 人3、 高久 洋1'2(1千葉 工 業 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 生 命 環 境 科 学 専 攻 、2千葉 工 業 大 学 ハ イテ ク リサ ー チ セ ンタ ー、3横浜 市 立 大 学 大 学 院 国 際 総合 科 学 研 究 科)
【目 的 】APOBEC3G (A3G) はGagと 相 互 作 用 し 、HIV-1ウ イ ル ス 粒 子 に取 り込 ま れ 、 逆 転 写 の 際 に マ イ ナ ス 鎖 ウ イ ル スDNAにdCか らdUへ の 変 異 を 導 入 す る こ とでHIV-1複 製 を阻 害 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 ま た 、 分 子 シ ャ ペ ロ ンの 一 種 で あ るHsp70もGagと 相 互 作 用 す る こ と に よ りHIV-1ウ イ ル ス 粒 子 に 取 り込 まれ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 昨 年 の 本 学 会 に お い て 、Hsp70お よ びA3G, Gagが 相 互 作 用 す る こ と に よ り 、HIV-1ウ イ ル ス 粒 子 へ のA3Gの 取 り 込 み が 増 加 し 、 そ れ に よ り HIV-1の 感 染 力 が 減 少 す る こ と を報 告 し た 。 こ の こ と か ら、Vifに よ るA3Gの 分 解 をHsp70が 阻 害
し て い るの で は な い か と 考 え 、 今 回 、Hsp70に よ るVifのA3G分 解 阻 害 効 果 を 検 討 し た 。
【方 法 】Hsp70お よ びVif, A3Gを 発 現 す るvectorをco-transfectionし 、western blotting法 に よ り Hsp70のVifに よ るA3G分 解 阻 害 効 果 を調 べ た 。 さ ら に 、Vifを 発 現 す るvectorま た は 、pNL4-3, pNL4-3 △ vifを そ れ ぞ れtransfectionし 、 免 疫 沈 降 後 、western blotting法 に よ りHsp70お よ びVifの 相 互 作 用 を 調 べ た 。 ま た 、pNL4-3ま た はpNL4-3 △ vifとHsp70, A3Gを 発 現 す るvectorをco-transfectionし 、 培 養 上 清 中 の ウ イ ル ス 粒 子 を 、westem blotting法 に よ り 、HIV-1ウ イ ル ス 粒 子 へ
のA3Gの 取 り 込 み を調 べ た 。
【結 果 お よ び 考 察 】Hsp70のVifに よ るA3G分 解 阻 害 効 果 を 検 討 し た 結 果 、Hsp70濃 度 依 存 的 にVifに よ るA3Gの 分 解 が 阻 害 され て お り 、 さ ら にHsp70お よびVifが 相 互 作 用 して い る こ と を 明 ら か に し た 。 この こ と か ら、VifとA3Gの 相 互 作 用 をHsp70が ブ ロ ッ ク し、Vifに よ るA3Gの 分 解 を 阻 害 して い る の で は な い か と推 察 し た 。 し か し 、HIV-1ウ イ ル ス粒 子 へ のA3Gの 取 り込 み を 検 討 した と こ ろ 、 Vif非 存 在 下 に お い て もA3GのHIV-1ウ イ ル ス 粒 子 へ の 取 り 込 み は増 加 し て い た 。 こ の こ と か ら、 Hsp70はVifに よ るA3Gの 分 解 を 阻 害 す る だ け で は な く 、A3GのHIV-1ウ イ ル ス 粒 子 へ の 取 り込 み 自 体 に影 響 して い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
The Journal of AIDS Research Vol. 10 No. 4 2008
P-017
分 子 モ デ リ ン グ に よる リ ン酸 化APOBEC3Gの 構 造 解 析 横 山 勝1、 白 川 康 太 郎2,3、高 折 晃 史2、佐 藤 裕 徳1(1国立 感 染 症 研 究 所 病 原 体 ゲ ノ ム解 析 研 究 セ ン ター 、2京都 大 学 大 学 院 医 学 研 究 科 血 液 ・腫 瘍 内科 、3財団法 人 エ イ ズ 予 防 財 団)
【目的 】 宿 主 因子APOBEC3G (A3G)はProtein Kinase A (PKA)に よ る リ ン酸 化 に よ っ て抗 HIV-1活 性 が 制 御 され る。A3GはHIV-1 Vifに よ りユ ビ キ チ ン ープ ロテ ア ソ ー ム 系 を用 い て 分 解 中和 され る が 、 リ ン酸 化A3GはVifに よ る分 解 中 和 に 抵 抗 性 で あ る 。 本 研 究 で は この 現 象 の 理 解 を深 め る た め 、 リ ン酸 化A3Gの 分 子 モ デ ル の 構 築 ・解 析 を行 っ た 。 【方 法 】A3G N末 端 ドメ イ ン の 分 子 モ デル は統 合 計 算 化 学 シ ス テ ムMOE (CCG)を 用 い て 、 ホ モ ロ ジ ー モ デ リン グ法 に よ り構 築 した 。 鋳 型 はAPOBEC2 (PDB code:2NYT)を 用 い た 。 得 られ たA3G N末 端 ドメ イ ン の 分 子 モ デ ル のT32に リ ン酸 を付 加 し、 エ ネル ギ ー 最 小 化 に よ り安 定 な 構 造 を構 築 した 。 また 、T32Aお よ びT32D変 異 体 も構 築 した 。
【結 果 】A3G-野 生 株 、A3G-リ ン酸 化T32、A3G-T32A変 異 体 、A3G-T32D変 異 体 の 全 体 構 造 は い ず れ も類 似 して い る。T32近 傍 を 見 て み る と、A3G-野 生 株 、A3G-リ ン酸 化T32、A3G-T32A変 異 体 、 お よびA3G-T32D変 異 体 の 中 で 、T32の 側 鎖 とR24の 側 鎖 の 間 に 形 成 され る 水 素 結 合 の 数 に差 が 見 られ た 。A3G-リ ン酸 化T32お よ びA3G-T32D変 異 体 で は 水 素 結 合 は2つ 、 A3G-野 生 株 は1つ 、A3G-T32A変 異 体 で は水 素 結 合 は 形 成 され な い 。 【考 察 】T32の リ ン酸 化 、 あ る い はT32D変 異 に よ り、32番 目の ア ミノ酸 の 側 鎖 とR24の 相 互 作 用 が よ り強 固 に な り、R24を 含 むル ー プ 領 域 の 動 きが 制 限 され る。 これ に よ り、Vifな ど の 結 合 親 和 性 が 低 下 し、Vifに よ る分 解 中 和 に 抵 抗 性 と な る と考 え られ る。
P-018
ドメ イ ン欠 失TRIM5alpha変 異 体 に よ るTRIM5alphaのHIV-1抵 抗 性 の 解 除 前 川 彦 一 郎 、 中 山 英 美 、 黒 石 歩 、塩 田 達 雄 (大阪 大 学 微 生 物 病 研 究 所 ウ イル ス感 染 制 御 分 野) [背景] ウ イ ル ス 抵 抗 性 因 子 の 機 能 解 析 は 、 ウ イ ル スの 複 製 機 構 の 解 明 や 抗 ウ イ ル ス 薬 開 発 へ の足 が か り とな る 。TRIM5 αは 旧 世 界 ザ ル の 細 胞 か ら同 定 され たHIV-1感 染 抵 抗 性 因 子 で,3つ の モ チ ー フ(RBCC)に 加 えて 、C末 端 側 にSPRYド メ イ ン を持 つ 。 一方 、splicing variantの 一 つ で あ るSPRYド メ イ ン を 欠 くTRIM5γ(T5γ)は 、TRIM5α (T5α)の 効 果 を阻 害 す る ドミナ ン トネ ガ テ ィブ と して 働 く こ と が報 告 され て い る 。 この 効 果 を応 用 して 、T5 αのHIV-1感 染 抵 抗 性 が消 失 し た細 胞 の 簡 便 な作 製 を試 み た 。[実 験 方 法1カ ニ ク イ ザ ル T5α のSPRYド メ イ ン欠 失 変異 体(CMT5 α-S(-))、あ るい は ア フ リカ ミ ドリザ ル のT5γ (AGM-T5γ)を セ ン ダ イ ウ イル ス ベ ク タ ー(SeV)に よ り ア フ リカ ミ ド リザル の 細 胞(CV1)に導 入 し、GFP発 現 レ ンチ ベ ク タ ー(HIV-1-GFP)の 感 染 効 率 を検 討 した 。[結 果 と考 察] CV1細 胞 はHIV-1感 染 抵 抗 性 を示 す が 、CM-T5 α-S(-)ある い はAGM-T5γ の 導 入 に よ りHIV-1-GFPに 対 す る感 染 抵 抗 性 が 解 除 され た 。CM-T5 α-S(-)はSeVで 発 現 させ た他 種 のT5α に 対 して も解 除 効 果 を示 した が 、AGM-T5γ の 効 果 は弱 か っ た 。次 に 、siRNAと 解 除 効 果 を 比 較 した結 果 、CM-T5 α-S(-)、AGM-T5γ ど ち ら もsiRNAよ り強 力 にHIV-1抵 抗 性 を 解 除 し た 。 現 在 、siRNAに よ る標 的 遺 伝 子 の ノ ッ ク ダ ウ ンは タ ンパ ク 質 の 機 能 解 析 に欠 か せ な い 実 験 手 法 で あ る 。 し か し、siRNAの ノ ッ ク ダ ウ ン効 果 はsiRNAの 配 列 や 導 入 効 率 に影 響 を受 け る こ と、 効 果 の 程 度 に よ っ て は結 論 に 影 響 を及 ぼ す 等 の 問 題 が あ る。 本 手 法 は これ らの 問 題 に影 響 を受 け る こ とな く 、簡 便 に ウ イル ス感 染 抵 抗 性 因 子 の機 能 解 析 に応 用 で き る と考 えて い る 。
P-019
HIV-1蛋 白質 と イ ノ シ トー ル リ ン酸 との 結合 解 析 藤 田 美 歌 子1、 安 楽 健 作2、 福 田亮 太1、 大 塚 雅 巳1 (1熊本 大 学 大 学 院 医 学 薬 学 研 究 部 生 体 機 能 分 子 合 成 学 分 野 、2熊本 保 健 科 学 大 学 保 健 科 学 部 衛 生 技 術 学 科) 【目 的 】HIV-1複 製 に 関 わ る宿 主 因 子 に は蛋 白 質 ば か りで な く低 分 子 有機 化 合 物 もあ る と考 え られ る が 、 これ につ い て は ほ と ん ど 着 目 され て 来 な か っ た 。 そ れ で も最 近 、HDみ1粒 子 形 成 にGagの 前 駆 体 蛋 自質Pr55GagのMA領 域 と 、脂 質 二 重 膜 に 存 在 す る イ ノ シ トール リ ン 酸 との 結 合 が 重 要 で あ る こ とが 報 告 され た 。HIV-1複 製 に イ ノ シ トー ル リン酸 類 が ど の よ うに 関 わ る の か に つ い て の 全 容 解 明 の 第 一 歩 と して 、本 研 究 で は種 々 のHIV蛋 白質 と イ ノ シ トー ル リ ン酸 との 結 合親 和性 をBIACOREを 用 い て 解 析 した 。 【方 法 】FLAGタ グ を持 つPr55Gag、MA、CA、Vpr、Vpu、Nefを コ ー ドす る遺 伝 子 をpSG5 ま た はpEF1/Myc-HisAに 挿 入 した発 現 ベ ク タ ー を構 築 した 。 こ れ らの ベ ク タ ー を 、 リ ン酸 カ ル シ ウ ム法 に よ り293T細 胞 に 導 入 した 。 細 胞 抽 出液 か らFLAG抗 体 ア ガ ロ ー ス を 用 い て 蛋 白 質 を精 製 した 。BLACOREに お い て は セ ンサ ー チ ッ プ ス トレ プ トァ ピ ジ ン を用 い 、 合 成 した ビオ チ ン化 イ ノ シ トー ル リ ン酸(IP3お よびIP4)を 固 定 化 し精 製 蛋 白質 を流 して 解 析 した 。【結 果 と考 察 】Pr55GagとMAに お い てIP3に 選 択 的 な 結 合 が観 察 され 、Pr55Gagの 方 がMAよ り も結 合 が 強 か っ た 。 この こ と か ら、Pr55GagのIP3と の 結 合 に は 、MA領 域 だ け で な く全 体 的 な 構 造 が 寄 与 して い る こ と が示 唆 され た 。 ま たIP4に もPr55 GagやMAに 対 して 同様 の 結 合 親 和 性 が観 察 され 、IP3に 比 べ 強 い 結 合 で あ っ た 。 一 方 でCAに お い てIP3やIP4と の 結 合 は 観 察 され な か っ た 。Vpr、Vpu、Nefに つ い て は 、 現 在 解 析 中 で あ る 。 イ ノ シ トー ル リ ン酸 と結 合 す るHIV-1蛋 白質 を新 た に 見 出 した ら、 そ の 結 合 の ウ イル ス 学 的 意 義 を明 らか に し て い く予 定 で あ る 。
P-020
MAPK様
キナーゼNLKに
よるHIV転 写 を負 に制御 す る調節機構 につ い
て
金澤
智 、岡本
尚
(名古屋市立大学大 学院医学研究科細胞 分子生物学)
Nemo-Like Kinase (NLK)は 、Erk/MAPKsお よ びCDKsに 相 同 性 の あ る タ ンパ ク質 と して ク ロ ー ニ ング され たSer/Thrキ ナ ー ゼ で あ る。NLKはMAPキ ナ ー ゼ カ ス ケ ー ドの 中 で 様 々 な 転 写 関 連 因子 を リ ン酸 化 す る事 で 転 写 を負 に制 御 す る。 他 方 、NLKがCDKと 相 同 性 を持 つ と い う点 に 対 して は こ れ ま で ほ と ん ど解 析 が な され て い な か っ た の で 、 こ の 点 に 着 目 し NLKに よ る転 写 制 御 機 構 に 関 す る解 析 を 行 な っ た 。 その 結 果 、1) NLKはHIV転 写 制 御 機 構 に深 く関 わ るcyclin T1と 親 和 性 を持 つ 、2) RNA polymeraseII (RNAPII)のC-terminal
domain (CTD)領 域 に対 して も親 和性 を持 ち この 領 域 を リ ン酸 化 す る事 、 な ど が明 らか とな っ た 。 ま た これ まで の解 析 か ら 、HIV転 写 伸 長 過 程 を制 御 す るCDK9と 同 様 の 基 質 特 異 性 を 示 し、 実 際 にRNAPIIホ ロ エ ンザ イ ム を リン酸 化 す る事 も明 ら か とな っ た 。次 にHIV転 写 制 御 機 構 に 対 しNLKが どの 様 な効 果 を持 つ か に つ い て 検 討 を 加 えた と こ ろ 、 予 想 に反 し こ れ を負 に制 御 し た 。 そ こで この 阻 害 が どの 様 な メ カ ニ ズ ムで 起 こる の か をChIP assayに よ り検 討 を 加 えた 。 興 味 深 い 事 にNLKはHIV転 写 を担 う5'-LTR領 域 へ 結 合 せ ず 、HIVプ ロ ウ イ ル スDNAの 転 写 終 結 領 域 に結 合 し た 。 これ らの 結 果 か ら、NLKはRNAPIIに 対 し てCDK9同 様 の 基 質 特 異 性 を有 す る もの の 、CDK9が 主 と して 関 与 す る転 写 伸 長 過 程 に は 直 接 関与 せ ず 、 転 写 終 結 領 域 に お い て働 き、RNAPIIのRecycling機 構 に 関 与 す る事 が示 唆 され た 。
The Journal of AIDS Research Vol. 10 No. 4 2008 P-021 宿 主 由来 タ ンパ クOX40L、OX40のHIV-1感 染 に 与 え る 影 響 高 橋 良 明1、村 上 努1、 駒 野 淳1、 吉 田 篤 司2、 田 中 礼 子3、 山 本 直 樹1、 田 中勇 悦3 (1国立 感 染 症 研 究 所 エ イ ズ研 究 セ ン タ ー 、2横浜 市 立 大 学 医 学 部 分 子 生 体 防 御 学 、3琉球 大 学 大 学 院 医 学研 究 科 免 疫 学 分 野) 【目的 】 宿 主 細 胞 でHIV-1が 増 殖 す る際 に は 、 様 々 な宿 主 タ ンパ ク が ウ イル ス粒 子 に 取 り込 まれ 、 そ の 結 果 、 取 り込 まれ た タ ンパ ク の種 類 に よ っ てHIV-1の 感 染 性 に様 々 な影 響 を与 え る こ と が 知 られ て い る。 今 回 我 々 はTNF/TNFレ セ プ タ ー ス ー パ ー フ ァ ミ リー 分 子 の OX40L/OX40がHIV-1感 染 に与 え る影 響 を 明 らか に す る 目的 で 、以 下 の よ うな 検 討 を行 っ た 。 【方 法 】 ま ず 、 宿 主 タ ンパ クOX40LやOX40がHIV-1粒 子 内 に取 り込 まれ る の か 調 べ るた め 、 各 分 子 に 対 す る 単 ク ロ ン抗 体 と磁 気 ビ ー ズ を 用 い てImmunocapture assayを 行 っ た 。 次 に 、 OX40LやOX40のHIV-1感 染 に与 え る影 響 を調 べ るた め 、293T細 胞 を用 い てPseudotype HIV-1を 作 製 し、 これ をTZM-bl細 胞 亜 群 等 に感 染 させ 、Single-round系 にて 感 染 効 率 を調 べ た。 さ ら に、 そ の影 響 は どの よ うな メ カ ニ ズ ム で生 じるの か 調 べ るた め 、Binding assay等 を行 っ た 。
【成 績 】Immunocapture assayに よ り、 宿 主 由 来OX40LやOX40がHIV-1粒 子 に取 り込 まれ る こ と が わ か っ た。 ま た取 り込 ま れ たOX40L(ま た はOX40)と 標 的 細 胞 上 のOX40(ま た は OX40L)は 互 い に強 く結 合 す る こ と で ウ イ ル スの 標 的細 胞 へ の 吸 着 効 率 が 増 加 し、 そ の 結 果 、 感 染 効 率 が 高 ま る こ とが わ か っ た 。 またHIV-1上 のOX40Lが 標 的 細 胞 上 のOX40に 結 合 す る と 、OX40を 介 して 標 的 細 胞 内 にNF-κB依 存 的活 性 化 シ グ ナ ル が誘 導 され 、 そ の 結 果 、
ウ イル ス産 生 が促 進 され る こ と が示 唆 され た 。
【結 論 】今 回 のinvitroで の結 果 か ら、生 体 内 に お い て 免 疫 学 的 に重 要 なOX40L/OX40系 は ウ イル ス学 的 に も重 要 な機 能 を持 つ こ と が推 測 され る 。 更 な る解 析 はHIV感 染 機 構 や病 態 の 理 解 に役 立 つ か も しれ な い 。
P-022•@ Inhibition of HIV-1 replication by the co-chaperone DNA J/HSP40 protein family
浦 野 恵 美 子1.2、奥 長 浩 之2、 森 川 裕 子2、 山本 直 樹1、駒 野 淳1
(1国立 感 染 症 研 究 所 エ イ ズ 研 究 セ ン タ ー 、2北里 大 学 大 学 院 感 染 制 御 科 学 府 分 子 ウ イル ス学)
DNAJ/HSP40は 進 化 的 に よ く保 存 され た タ ンパ ク質familyで 多岐 に わ た る生 命 現 象 に 関 与 す るco-chaperoneで あ る。HSP40はHSP70とJdomainを 介 して相 互 作用 し、 そのATP hydorolysis 活 性 を促 進 す る 。HSP40は3つ の 型A,B,Cに 分 類 され 、 そ れ ぞ れ 複 数 の タ ンパ ク質 が 同 定 され て い る 。 しか し、 ほ 乳 類 細 胞 に お け るHSP40 familyの 病 原 体 に対 す る抵 抗 性 等 に 関 す る詳 細 は 未 解 明 な点 が多 い。 我 々 はHIV-1複 製 抵 抗 性 を与 え る遺 伝 子 を ス ク リー ニ ング し、 RK13細 胞 のcDNAラ イブ ラ リー か らHSP40 B6を 同 定 した 。 そ こでHSP40 familyの 抗HIV-1 作 用 に つ い てHSP40 A1,B1,B6,C3,C5を 選 択 し解 析 を行 っ た 。 そ の 結 果 、C3を 除 く全 て の HSP40に つ い て タ ンパ ク質 発 現 量 の 増 加 に 伴 いHIV-1産 生 の 低 下 が 見 られ た 。HSP 40 A1, B6で は こ の 阻 害 は 少 な く と もHSP70と の相 互 作 用 部 位 と して知 られ るJ domainに 依 存 す る こ とが 判 明 した 。HSP40の ウ イル ス産 生 抑 制 はgag-pol,tat,rev発 現 ベ ク ター で も検 出 され た 。 ま た 、HSP40の 発 現 に よ り ウ イル スRNA量 が低 下 し た 。HSP40がHIV-1の 複 製 が抑 制 で き るか をT細 胞 に て検 討 した 。MTL4にMLVベ ク タ ー を利 用 してHSP40 A1,B6発 現 が恒 常 的 に 高 レ ベ ル を維 持 す る細 胞 を樹 立 した 。 こ れ らの 細 胞 に お い てHIV-1複 製 は顕 著 に抑 制 され た。 以 上 よ り、HSP40はHSP70と の機 能 的 な 相 互 作 用 を通 じてHIV.1の 産 生 を特 異 的 に 抑 制 す る宿 主 因 子 で あ る こ と が判 明 した 。HSP40の 発 現 に よ りウ イル スmRNAが 減 少 した こ とよ り、HSP40はHIV-1を 特 異 的 に認 識 し転 写 ま た は転 写 後 調 節 を標 的 と した ユ ニ ー ク な メ カ ニ ズ ムでHIV-1抵 抗 性 を示 す と思 わ れ る 。
P-023 レ ンチ ウ イ ルス ベ ク ター を用 い た 抗HIV因 子 の ス ク リ ーニ ング とそ の解 析 小 林 朋 子1、 芳 田 剛1、 駒 野 淳2、 小 柳 義 夫1 (1京都 大 学 ウ イ ル ス研 究 所 附 属 エ イ ズ 研 究 施 設 ウ イル ス 病 態 研 究 領 域 、 2国立 感 染 症 研 究 所 エ イ ズ研 究 セ ン タ ー) HIV感 染 の 前 期 過 程 を制 御 す る宿 主 因 子 の 単 離 を 目指 し、 ヒ ト白血 球 由 来cDNAラ イ ブ ラ リ導 入MT-4細 胞 を用 い て ス ク リ ーニ ン グ実 験 を行 った 。cDNAラ イ ブ ラ リ発 現MT-4細 胞 に 、 レ セ プ タ ー 吸 着 以 外 はHIVと 同 様 の 過 程 を 経 て感 染 を 成 立 させ るVSV-Gシ ュ ー ド タ イ プ CFP蛍 光 蛋 白 質 発 現 レ ンチ ウ イル ス ベ ク タ ー(CFPベ ク タ ー)を 感 染 させ 、 感 染 が成 立 しな い 細 胞(CFP陰 性 細 胞)をcell sorterを 用 い て 分取 した 。 こ れ らの 手 順 を繰 り返 し6回 行 っ た と こ ろ、 分 取 の 回 数 を重 ね る た び 感 染 が 成 立 し な い細 胞 の 割 合 が 上 昇 した 。(1回 目: 0.5%、3回 目:5%、6回 目:30%)。 そ こ で 、 この 感 染 効 率 が低 下 し た細 胞 群 を限 外 希 釈 法 に よ っ て ク ロ ー ニ ング し、再 度CFPベ ク タ ー を感 染 させ 、 そ れ ぞ れ の 細 胞 ク ロ ー ン に お け る感 染 抑 制 能 を検 討 した 。 そ の結 果 、 い くつ か の ク ロ ー ンに お い て 、感 染 効 率 が コ ン ト ロ ール 細 胞 と比 較 して60%程 度 抑 制 され てい る こ とが 判 明 した 。 次 に、 そ れ らの 細胞 ク ロー ン につ い てX4 HIV-1エ ン ベ ロ ー プ に よ り シ ュ ー ドタ イ プ され た ル シ フ ェ ラ ー ゼ 発 現HIV-1 (NL-luc)を 感 染 させ た と ころ 、NL-Iucの 感 染 効 率 が2.5%以 下 に抑 制 され る こ と が確 認 され た 。 こ のCFPベ ク タ ー とNLIuc実 験 系 は侵 入 過 程 お よび 転 写 過 程 の機 序 が それ ぞれ 異 な る に も か か わ らず 、双 方 の 実 験 に お い て 感 染 抑 制 が 観 察 され た こ とか ら 、 これ らの 細 胞 に お け る脱 殻 か ら組 み 込 み まで の い ず れ か の 過 程 が感 染 阻 害 の標 的 で あ る こ とが 示 唆 され る。 今 回 見 出 さ れ たHIV感 染 抑 制 現 象 を詳 細 に解 析 す る こ とは 、 新 規HIV抑 制 法 開 発 の 礎 とな る に と ど ま らずHIV感 染 成 立 の 分 子機 序 解 明へ 新 た な 知 見 を加 え る と期 待 され る。 P-024 ロ ピ ナ ビル ・リ トナ ビル 配 合 剤 の トラ フ値 と脂 質 系 へ の 影 響 及 び テ ノ ホ ビ ル血 中 濃 度 との 相 関 に 関す る 検 討 矢 倉 裕 輝1、 吉 野 宗 宏1、 坂 東 裕 基2、 小 川 吉 彦2、 矢 嶋 敬 史 郎2、 谷 口 智 宏2 大 谷 成 人2、冨 成 伸 次 郎2、渡 邊 大2、上 平 朝 子2、 白 阪 琢 磨2、 栞 原 健3 (1国立病 院機 構 大 阪 医 療 セ ン タ ー薬 剤 科 、2国立 病 院機 構 大 阪 医 療 セ ン タ ー 免 疫 感 染症 科 、3国立 病 院 機 構 南 京 都 病 院 薬 剤 科) 【緒 言 】 プ ロテ ァー ゼ阻害 薬 の効 果持 続能 はIQ値 に依 存す る とされ てい る。 ロピナ ビル/リ トナ ビ ル 配合 剤(LPV/r)は 高 いIQ値 を示 す こ とか ら、長期 投 与 にお け る有効 性 につ い て も報告 され て い る薬 剤 で あ る。 その一 方 で、 長期 服薬 にお いて脂 質等 へ の代 謝異 常 が報 告 され て お り、長 期服 薬 にお け る心 血 管系 イベ ン トの増 加 が懸 念 され て い る。 そ こで今 回 、LPV/rの トラフ値 と脂 質系 へ の影 響 につ い て検 討 を行 った。 またテ ノホ ビル(TDF)と の 併 用 によ り、TDFの 血中濃度 が上昇 す る ことが認 め られて い る こ とか ら、LPV/rの トラフ値 との 相 関 につ いて も併 せ て検 討 を行 っ た。 【対 象 】 当院 免疫 感染 症 科 を2004年10月 か ら2007年12月 に受 診 し、核 酸系 逆 転写 酵 素 阻害 剤 と し てTDF・ エ ム トリシタ ビ ン合 剤若 し くはTDF十 ラ ミブ ジ ンにLPV/rを 含 む レジメ ンにてHAARTを 開始 し、 トラフ値 の測 定 が行 われ た初 回治療26例 を対象 と した 。 【方 法】LPV/rの トラフ値 と投 与 開始後48週 まで の脂質 系 への 影響 お よびTDFの トラフ値 との 相 関 につ いて検 討 を行 っ た。 【結 果】LPVの 平 均 トラ フ値 は6.0±2.8(1.3-13.5)μg/mLで あ った。 総 コ レス テ ロール値 につ い て、投 与 前 は151±37(81-217)mg/dLで あ り、投 与 開始後48週 では181±51(126-354)mg/dLに 有意 に増加 した(p＜0.05)。 また トラ フ値 が高値 を示 した症 例 に おい て、総 コレス テ ロール値 の 上昇 を示 す傾 向 がみ られ た。LPV/rの トラ フ値 とTDFの トラ フ値 には有 意 な相 関 を認 め た(p＜0.05)。 【考察 】 総 コ レス テ ロール値 の上 昇 は、長 期服 薬 に おけ る心血 管系 イベ ン トの リス クフ ァク ター で あ る。血 中濃 度 が、今 後起 こ り うるイベ ン トの 指標 となれ ば非 常 に有用 で あ る と考 える。 今後 も症例 を集積 し、 トラフ値 との 関係 につ いて検 討 を行 っ てい きたい。 また、TDFの 血 中濃度 が高 値 を示 した際 の人 体へ の影 響 につ いて も同様 に検 討 を加 えたい 。
The Journal of AIDS Research Vol. 10 No. 4 2008 P-025 LC-MSに よ る イ ンテ グ ラー ゼ 阻害 剤 ラル テ グ ラ ビ ル の 血 中 濃 度 測 定 法 の 開発 高 橋 昌 明1、 古 西 満2、 久 高 祐 一1、 奥 村 直 哉1、平 野 淳1、 寺 畑 奈 美3、 坂 野 和 英3、 金 田次 弘4 (1国立 病 院 機 構 名 古屋 医 療 セ ン ター 薬 剤 科/臨 床 研 究 セ ン タ ー 、2奈良 県 立 医 科 大 学 感 染 症 セ ン タ ー 、3国立 病 院機 構 名 古 屋 医 療 セ ン タ ー 薬 剤 科 、4国 立 病 院 機 構 名 古屋 医 療 セ ン タ ー臨 床 研 究 セ ン タ ー)
【背 景 及 び 目的 】 ラル テ グ ラ ビル(RAL)は 、HIV-1の イ ン テ グ ラ ー ゼ を 阻 害 しHIVの 複 製 を 抑 制 す る新 しい タ イ プ の抗HIV薬 で あ り、 既 存 の 薬 剤 と の 組 み 合 わ せ で 高 いHIV増 殖 抑 制 効 果 が認 め られ て い る。RALの 血 中 濃 度 測 定 に つ い て はLC-MS/MSやHPLCに よ る測 定 法 が 発 表 され て い る が 、特 殊 な 内 部 標 準 物 質 や 蛍 光 検 出 器 が 必 要 と され て い る 。現 在 、 名 古 屋 医 療 セ ン タ ー で はHPLC法 で 全 て のPI、EFV、ABCの 、LC-MS法 でTDFの 血 中濃 度 測 定 を行 い患 者 の 治 療 に役 立 て て い る 。今 回 、 我 々 はPI用 の 内 部 標 準 物 質 を 用 い てLC-MSに よ るRAL血 中濃 度 測 定 法 の 開 発 を行 っ た 。 【結 果 と考 察 】RALは 、0.01∼7.68μg/mLの 濃 度 範 囲 に お い て 相 関係 数1.000と 良 好 な 直 線 性 を示 した 。 ま た 、 正 確 性 に つ い て は97.2∼103.4%の 範 囲 で あ っ た 。 日 内及 び 口 間 ア ッセ イ にお け る変 動 係 数 は10.4%以 下 で あ り、LC―MS/MSやHPLCで 報 告 され た 値 と ほ ぼ 同 じで あ っ た。RALの 回 収 率 は80.6%以 上 で あ っ た 。RALが 単 回 投 与 され た 場 合 の血 中 濃 度 は0.01 ∼4 .71μg/mLと 推 定 され る こ とか ら、LC-MSを 用 い たRALの 血 中 濃 度 測 定 は十 分 に 可 能 で あ る。 実 際 、RALを 連 続 投 与 したHIV-1感 染 患 者 に お け る血 中 濃 度 は 、 投 与 後8日 目 で1 .2 μg/mL(ト ラ フ値)、5.2μg/mL(ピ ー ク値)と な っ た 。 今 回 、LC-MS/MSやHPLC蛍 光 検 出 法 に加 え て 新 た にLC-MSに よ るRALの 血 中薬 物 動 態 の モ ニ タ リン グ が 可 能 と な っ た こ とか ら、RALの 安 全 で有 効 な 薬物 療 法 が提 供 で き る もの と考 え る 。 P-026 ラ ル テ グ ラ ビル を含 むサ ル ベ ー ジ療 法 を行 っ た1例 治 田 匡 平1、 植 村 典 子1、 生 駒 貴 世 子1、 森 田 幸 子1、 北 啓 二1、 宇 野 雅 之1、 古 西 満2、 米 川 真 輔2、 中川 智 代2、 小 川 拓2、笠 原 敬2、 前 田光 一2、 三 笠 桂 一2、 宇 野 健 司2,3、善 本 英 一 郎2,4、高 橋 昌 明5,6、久 高 祐 一5,6 (1奈良 県 立 医科 大 学 附 属 病 院 薬 剤 部 、2奈良 県 立 医 科 大 学 感 染 症 セ ン タ ー 、 3大阪 市 立 総 合 医療 セ ン タ ー感 染 症 セ ン タ ー、4奈良 厚 生 会 病 院 感 染 制 御 室 、 5国立 病 院 機 構 名 古 屋 医 療 セ ン ター薬剤科、6国立 病 院 機 構 名 古 屋 医 療 セ ン タ ー臨 床 研 究 セ ン タ ー) 【はじめに】 ラルテ グラビルは本年7月にわ が国 で も発売 され たインテグ ラーゼ阻害薬 であ る。我 々は発 売前 にメル ク社のMK-O518 Expanded Access Programに 参加 し、 ラルテグ ラビル を使用 したの で、その 治療経過 を報告す る。
【症例 】44歳 ・男性 。血友病Aの ため使 用 した非加熱 血液製剤 でHIVに 感 染 した。1998年 か ら抗HIV治 療 を開始 したが、副作用や ア ドビアラ ンス不良の ため、処方変 更 を繰 り返 していた。2005年頃 か らCD4陽 性細胞数 は急激 に減少 し始め、2007年2月 にはニ ューモ シスチ ス肺炎 のた め入院加 療 を行 ない、ア トバ コンで予防 を継 続 した。9月にはCD4陽 性 細胞数 が5/μL 、HIV-RNA量 が77000コ ピー/mLで あり、薬剤 耐性検査で もプ ロテ アーゼ阻害薬 を中心 に耐性 を認 めた。そのため、2007年9月10日か らラル テグ ラビル 、 ダル ナ ビル、 リ トナ ビル 、サニル ブ ジンによ る抗HIV治 療 を開始 し、HIV-RNA量 は4週後で400コ ピー /mL未 満 、6週後 で50コ ピー/mL未 満 と急速 に減少 した。治療開始1週 間後 にラルテグ ラビル 血中濃度 を測定 した。11月 にはCD4陽 性細胞 数は41/μLに 増加 したが、その頃か ら労作時呼吸 困難 を自覚 し、胸 部画像検査で両側 びまん性浸潤影 を認 めた。 β-Dグル カン値 と経過 か ら免疫再構築 症候群 に よるニ ュー モシスチス肺炎 を疑 い、プ レ ドニゾ ロン60mg/口 とST合剤減感作 後9錠/日の 内服 を開始 した。副作用の ため16日間で 中止 し、以後 ア トバ コン内服 に変 更 したが、ニ ューモ シスチス肺炎 は順調 に改 善 した。 【考察】 ラル テグラビル は抗HIV作 用 が強 く、本例 の ように急速 にHIV-RNA量 が低下す る。一方、免疫再 構 築症候群の発症 リスクには治療後のHIV-RNA量 の急速 な低下 が指摘 されて お り、本例 の経験か らラル テグ ラビル使用時 には免疫再構築 症候群 の発症 に も注意す る必要が あると考 える。
P-027 服薬 援 助 の た め の基 礎 的 調 査-抗HIV薬 の薬 剤 変 更 状 況 調査(2008年)-小 島 賢 一1、金 子 恵3、 栞 原 健4、 日笠 聡4、 堀 成 美2、 山 元 泰 之3 (1荻窪 病 院 血 液 科 、2東京 都 立 駒 込 病 院感 染 症 科 、3東京HIV診 療 ネ ッ トワ ー ク、4関西HIV臨 床 カ ン フ ァ レ ンス) 【目的 】 効 果 的 な 服 薬 援 助 を行 うた め に,こ こ一 年 間 で の 抗HIV薬 の 薬 剤 変 更 状 況 を調 査 す る。 【方 法 】東 京HIV診 療 ネ ッ トワ ー ク、 関 西HIV臨 床 カ ン フ ァ レ ン ス に 関 連 す る 医療 機 関 を 中 心 に過 去 一 年 間 に 処 方 変 更 され た 抗HIV薬 の 現 在 と変 更 直 前 の 組 合 せ に つ い て変 更 理 由 は 問 わず に調 査 を行 った 。 【結 果 】2008年7月 中間 集 計 の 段 階 で最 近 一 年 間 に13%(255/1899例 以 下()内 は 実 数)の 服 薬 者 に変 更 が行 わ れ た[07年13%,06年21%,05年28%,04年22%,03年23%]。 薬 剤 種 数 は 今 年 も減 少(+51,-94)し,全 薬 剤 変 更 例 は17%(43/255)[07年20%,06年17%,05年9%,04年16%,03年21%1。 除 か れ た 薬 剤 で 多 い の は3TC 25%(64),TDF 18%(45),EFV 16%(42),d4T 14%(36)で,NFVは 7%(18)と な っ て い る。 加 わ っ た薬 剤 はTvd26%(67),Ezc 23%(58),RTV 20%(51),ATV 19%(48)と な っ た。 具 体 的 に多 い 変 更 前 組合 せ は下 記Aで あ り,変 更 後 の 組 合 せ は下 記Bの よ うに な っ た 。AEFV+Tvd(25),3TC+d4T+LPV(21),ATV+RTV+Tvd(19),3TC+ATV+RTV+TDF(13)BATV+ RTV+Tvd(27),LPV+Tvd(27),EFV+Tvd(25),ATV+Ezc+RTV(20),ATV+Epc(16) 【考 察 】 昨 年,今 年 と変 更 率 は低 い ま ま で 組 合 せ が 安 定 して き た 印 象 が あ る。 合 剤 採 用 の 傾 向 は 一 層 鮮 明 に な り,薬 剤 種 も減 少 す る例 が 多 い 。変 更 前 組 合 せ で は 昨 年 上 位5位 全 て EFVを 含 む 組 合 せ で 変 更 され て い たの が,今 年 は1つ の み で 大 幅 に縮 小 し た 。 そ れ に比 較 して 変 更 後 の 組 合 せ で は昨 年 上 位5位 と変 わ らず,採 用 され る 組 合 せ が 限 定 され て き た 。 服 薬 指 導 を学 ぶ 際 に は優 先 順 位 に 気 を付 け て効 率 よ く学 習 して い く こ とが 望 まれ る。 P-028 服 薬 援 助 の た め の基 礎 的 調 査-抗HIV薬 の 組 合 せ 調 査(2008年)-日笠 聡1、 栞 原 健1、小 島 賢 一2、堀 成 美3、金 子 恵2、 山 元 泰 之2 (1関西HIV臨 床 カ ン フ ァ レ ン ス 、2東京HIV診 療 ネ ッ トワ ー ク、3HIV/AIDS 看 護 学 会) 【目 的 】 効 果 的 な 服 薬 援 助 を 行 う た め に,抗HIV薬 の 組 合 せ の 処 方 状 況 を 把 握 す る 。 【方 法 】 東 京HIV診 療 ネ ッ トワ ー ク 、 関 西HIV臨 床 カ ン フ ァ レ ン ス に 参 加 し て い る 医 療 機 関 を 中 心 に2008年5-7月 の 時 点 で 処 方 さ れ て い る 抗HIV薬 の 組 合 せ に つ い て ア ン ケ ー ト調 査 を 行 っ た 。 【結 果 】 中 間 集 計 の 段 階 で1899例 の 有 効 回 答 が あ っ た 。 多 い 組 合 せ は1.TDF+FTC+EFV 12.9%(昨 年9.6%) 2.TDF+FTC+ATV+RTV 11.9%(昨 年10.1%)3.AZT+3TC+LPV 7.4%(昨 年7.3%)4.ABC+3TC+ATV+RTV 6.4%(昨 年4.1%)5.TDF+PTC+LPV 6.0%(昨 年2.4%)、 で あ っ た 。 昨 年 と 比 較 しAZT、3TCを 含 む 組 み 合 わ せ が 減 少 しABC、FTC、LPVを 含 む 組 み 合 わ せ が 増 加 し て い た 。 個 々 の 薬 剤 別 の 使 用 頻 度 は1.3TC 60.3%(昨 年%)2.TDF52.9% (昨 年%) 3.FTC 35.3%(昨 年%) 4.EFV 32.1%(昨 年%,) 5.ATV31.0%,(昨 年%)で あ っ た 。 抗HIV薬 の 組 合 せ は132通 り(昨 年 通 り)で あ っ た 。2007年 か ら2008年 の 間 に 新 規 に 治 療 を 開 始 し た211症 例 に お い て 多 い 組 み 合 わ せ は 、1.TDF+FTC+ATV+RTV2 0.4%2. TDF+FTC+EFV19.4%3.TDF+FTC+LPV12.3%4.ABC+3TC+ATV+RTV11.4%5. AZT+3TC+LPV6.6%で あ っ た 。
【考 察 】2008年 の 調 査 で は 、TVD、EZCの 増 加 と 、 合 剤 以 外 のNRTIの 減 少 が 目 立 つ 。PI、 NNRTIに つ い て は 昨 年 と 比 較 し そ れ ほ ど 大 き な 動 き は な い 。 処 方 の 組 み 合 ・わ せ で 、10%以 上 を 占 め る 組 み 合 わ せ は2種 し か な い が 、5%以 下 の 症 例 に し か 投 与 さ れ て い な い 処 方 は 、 昨 年 の46.3%か ら39.0%へ と 減 少 し て お り 、 昨 年 と 比 較 し 、 処 方 が 集 約 さ れ る 傾 向 が う か が わ れ た 。
