転 移 腫瘍細 胞 定量的検出 増幅 反応法 け 特 異的 用

特異 的 ^{D N A} 増幅反 応 法^を用 ^{いた ヌ ー ドマ ウ ス} に おけ^る

ヒ ト 転移 腫 瘍 細^{胞 の 定 量 的 検 出}

金 沢 大 学が ん研 究所 化学 療 法 部 (主任^: 佐々木 琢 磨 教 授)

太 田 安 彦

( 平 成3 年1 2月27 日受付)

ヌ ^ー ド^マ ウ^スを用いた転移 実験 系をヒ ト腫 瘍^の転 移 巣^に対 す^る治 療 実験^{モデルと し て}応 用 する た め に は, 定 量 性と迅速 性^を兼^ね備^{え た}転 移 腫 瘍^の検 出 法^を確^立する必 要^がある. 本 研 究^{で は}よ 転 移^{ヒ ト}腫 瘍 細 胞^の特 異 的^且つ定 量 的^な検 出 方 法^{と し} て, 転 移 腫 瘍に含ま れ る^ヒ下に特 異 的なβ ^‑ グ ^ロ ビン遺 伝 子 配 列を特 異 的 ^{D N A} 増 幅 反 応 (p^olym e r a s e chain r e a ctio n ,

P C R) 法によ り増 幅し た後^{, サザ ンプロ ッ ト法に て検 出お よ び解 析 する方法を検 討し た.} 実 験 的 転 移 系では, ヒト線 維 肉腫 H T‑^{1 0 8 0 細 胞 (5×1 06 個) をヌ ー ドマウス (I C R n u}/^{n u) の尾 静脈 内に移植し, 自 然 転 移 系で はマ ウス の}右 鼠 径 部 皮 下^に移 植^し た^. 移 植 後, 経 時 的に肺お よ び リン パ節を摘 出し, 抽 出し た D N A(1 F^Lg) を鋳 型と し てβ^‑ グ^ロ ビン遺 伝 子^に対 する特 異 的プ ライ^{マ ー} を用^{いて P C R} 法^{によ る}増幅 反 応^を行^い, サザ ンプ^ロ ッ ト故^によ り増 幅 ^{D N A} 断 片^の検 出 ^･ 解 析^を行^{った .} そ^の結 果, 実 験 的 転 移 糸で は 1 週 目よ り^{ヒ ト}β^‑ グ^ロ ビン遺伝子^の増 幅 断 片 (5 7 6塩 基 対) が検 出され, 肺転 移を確 実に と ら え ること が でき^た. さ らに , 臓器 あた りの転 移 腫 瘍細 胞 数^は経 時 的^に増 加 す^{ること が}明^{ら か と}なっ た. 自 然転 移系^{で は 5}週 目^{よ り}肺,

リン パ節 転 移を検 出できた^{. ヌ ー} ド^マウス によ る転 移 実験 系^に P C R 法を応 用し た転 移 腫 瘍 検 出法を適 用 する^こと に よ り, 肉 眼 的観 察^{で は}検 出不 可能^な微 小転 移^{レベ ルでの}転 移^の定 量 的 検 出が 可能と なっ た. 本 転移 腫 瘍検 出 法を 用^い, 肺 転 移 巣に対 す る抗 癌 剤^の効 果 判 定 試 験を施 行^{し た. H T}‑^{1 0 8 0} 細 胞^を尾 静 脈 内に移 植 後1 週 目に ^cisplatin(^{C D D P})^2m g/^kg ま た は ^adria mycin

(^{A D M})^8m g/^kg を投 与し, 投 与後^{1 , 3 週目 に肺を摘 出し D N A を抽 出し た. P C R 法によ るβ‑ グロ ビン遺 伝子の増 幅と そ} れに引 き 続く^{サザ ンプロ} ッ ト法^{によ る}増 幅 ^{D N A} 断片^の検 出^･ 解 析を行った結 果, 抗 癌 剤 投 与 後¹ 週目^におい て , A D M と C D D P の腫 瘍 増 殖 阻 止 率^{は そ れ}ぞれ 38^.9% ,

‑6 0^.1% であり, H T‑^{1 0 8 0 の肺 転 移 巣ほ A D M に感 受 性が高く, C D D P に感 受 性}

が低^{い こ}と が明ら か と なった. P C R 法^を応 用^{し た}転 移 腫 瘍 検 出 法^を適 用 す^ることによ り, ヌ ^ー ド^マウス法^{がヒ ト}腫 瘍^の転 移 巣

に対 する治 療 実 験モデ^ルと し て応 用可能であること が 示 さ れ た^. 以上の結 果か ら, 本 法は^ヒト癌^の転 移, 浸 潤^の機 構 解 明お よ び癌 転 移 巣^に対 す^る治 療 法^の開 発^に有用^な実 験 手 段^{と な る}ものと考 え^る.

E ^e_y w o rds m eta sta sis, nude m ou s e, hu m a n fibr o s a rco m a H T ^‑10 8 0, p^Ol_ym e rase chain re action

癌治療^の成 否は癌 転 移お よ び再 発を^いか に防く^いかにか か って いる^. 転移^の完 全 抑 制^こそ, 癌治療^の最 大^の課題と^いえ る. 転 移^には癌細 胞^の全 身 撒 布が そ^の背景と し てあるので, 転 移 癌^の 治療^は理 論 的^{に は}化 学 療 法^が最 も有 効な治 療 法^{と な り}得^{る. し} か し, 転 移 研 究は転 移 現 象^の解 明が大部 分^であり, 転 移 癌^の化 学療法^に関 す^る基 礎 研 究^は極^{め て}少^{ない. こ の}原 田^{の 一 つは}t

良^い転移 治 療^モデ^ルが無^{い こ}と に起 因する^. 従 来, 臨 床 検 体^の み な らず 培養細 胞 系^{と し て}樹 立^{さ れ たヒト}腫 瘍 株^{におい て,}

ヌ ^ー ド^マ ウ^スに恒 常 的に自 然 転 移^を生じ さ せ る^こと ほ難し^いと されてきた. 最 近, 可移 植 性 腫瘍^{株の選 択や}腫 瘍 移 植 経 路 及び 移 植 方 法 等^の工夫に よ り, ヌ ^ー ド^マ ウスにおい ても^ヒト腫 瘍^が 再 現性をもって転 移し, 転移^モデ^ルと し^ての応 用^の可 能 性を示 す 報 告が な され^{ているl ト 1 5).} 転 移 実 験^モデ^{ルと し て 1}) 確実^に

ま た恒 常 性をもっ て転 移が形 成さ れ る^こと, 2) 簡 便 な^モデ^ル 系^であ^{ること が}重 要^であ^{る が}, 治療 実 験 系^{と して}応 用 す^る場 合 に は加え七3) 定 量 性, 4) 迅 速 性が要求さ れ る^. しか し従来

の転 移^の検 出ほ, 病 理 組 織学 的 手 法お よ び臓 器^の表 面^に形 成さ れ た転 移結 節 数^を算 定 す^{る とい}う 肉 眼 形 態 学 的 観 察^に基づいた 定 量 性に乏し^いもの であった^. そ^の為, 肉 眼上あきら か^に転移 結 節^が認め ら れ る ま で^の時 間 的 制 約をう け, 迅 速 性に も問 題が あり, よ り実 用 的^で簡 便な^{ヒ ト}癌^に対 す^る転 移 実 験 系^の開 発^が 望ま れ て^いた^. 本 研 究で は, ヌ ^ー ド^マ ウ^ス に ヒ ト線 維 肉 腫 H T‑^{1 0 80 細 胞を移 植 後, 特 異 的D N A 増 幅 反 応 (polym e r a s e}

cha,^{in r e a ctio n , P C R) 法を用いて転移 腫 瘍 細 胞の ヒトβ ‑ グロ}

ビン遺 伝 子 (^{5 7 6}塩 基対) ^に対 す^る特 異 的増 幅反 応^を施 行 する方 法^によ り, 従 来^の肉 眼 形態^{学 的観 察で は検 出不可能な微 小 転 移}

レ ベ ルでの転 移^ヒt腫 瘍 細 胞^の迅 速且つ定 量 的な検 出を試み た^.

対 象 および 方 法

Ⅰ. 移 構 腫 瘍 細 胞と培 養

ヒト線 維 肉腫 培 養 株^{H T‑1 0 8 0 は},1 0% (^Ⅴ/^v) 非働^{化ウシ胎 児}

A b br e viatio n s : A D M , adria my^cin; b_p, ba s e pair; C D D P, Cisplatin; C P A, Cy^Clopho spha m ide; E D T A ,

ethylenedia min etetr a a c etic acid; H ^. E^., he m ato xylin a nd eosin;

'

i^. p リ i^{ntr a}p^erito n eal_; i･ V･, intr a v e n o u sl_{y ;} M T T , 3^‑(^{4,5‑dim eth}y p thiaz ol^‑_yl)^‑2,5‑diphe nyltetr a z oliu m br o mide ; N K , n atu r al killer ; P C R, p^Ol_y m e r a s e ch^ain

P C R 法を用^いたヒ ト転 移 腫 瘍 細胞^の定 量 的 検 出

血清 (G I B C O 社, Gr a nd Isla nd, U S A) と ダ^{ル ク ミ ソ}を含ん だ イ ^ー グ^ル M E M 培 地 (日本 製 薬 社, 大 阪) 中に おいて C O2 浪 虔 5 % , 3 7 ℃ で培 養^{した. ト リ プシン ー エチ レンジア ミ ン}四酢 酸

ニ ナ トリ ウ^ム塩 (^ethyle n edia min etetr a a c etic a cid, E D T A) 緩衝 液^{を 用いて}細 胞を剥 離^{し た}後, 生理的食 塩 水^を用^いて細 胞 浮遊 液を作製^{し, 2 7 G の}注 射 針を用^いて 5 ^×1 0^￠個 (0^.1ml) を移植 し た. 移 植に用^いた腫 瘍 細 胞 浮 遊 液ほ, トリ^バ ンプル ^ー 色 素 排 除 試験 法に よ り, 9 0% 以^上の生細胞^があ^ること を確 認し た^.

Ⅲ^. 実 験 動 物

ヌ ^ー ド^マ ウ^スは 5 適 齢, 雌^{の I C R}(^{n u}/^{n u}) 系 (^日本^チャ ^ー ル ズリ バ ^ー社, 厚 木) ^{を 用いた. マ ウス は}無 病 原 体 飼 育 条 件 下 (^spe cific p^athog^{e n}fr e e, S P F) ^で滅 菌飼 料^{お よ び}滅 菌 水 道 水^が

自 由^に摂 取^でき^{る よ}うに し て飼 育し実験に 用いた^.

Ⅲ^. 転 移の作 製

実 験 的 転 移 糸^{と してヌ ー ドマウスの}尾 静 脈 内^{に H T‑1 0 8 0} 細 胞を 5 ^×1 0⁸個 移植し, 移 植 後1 , 2 , 3 , 4 週 日^に肺を摘 出し D N A を抽 出し た. 別途^に摘 出^{し た}肺^{の 一}部^{を1 0}% ^{ホ ル マ リン}

に て固 定 後, へ マ ト キ^シリ ^{ン ･ エ} オ ジ ^ン (he m ato xylin a nd

e o sin, H^.E^.) 染 色を施し た標 本を作 製し, 肺 転 移^の有 無を病理

組織学 的^に追 求^した. ま た, 自 然 転 移 系と し^て H T‑^{1 0 80 細胞を}

ヌ∵^‑ ド^マ ウ^スの右 鼠 径 部 皮 下^に 5 ^×1 0⁶ 個 移 植し, 1 ^〜 6週目 ま で各週 毎^に肺^{お よ び リン パ}節^を摘 出^{し D N A を}抽 出^{し た.}

Ⅳ^. Cycl_opho spha mi de ( C P A ) に よ る前 処 理

ヌ ^ー ド^マ ウス の免 疫 担 当 細 胞^{と して の ナ チ ュ ラ ル キ ラ ー} (^{n atu r al kille r}, N K) 細 胞^の抑 制を 目的と して, 腫 瘍 細 胞 移植⁴ 日前に C P A 2 0 0m g/^kg を腹 腔 内 (intr ap^{e r}ito n e al,i^._p) 投 与^. し たヌ ^ー ド^マ ウスを用^いて同様^の実 験を試^{み た.} 即ち, 5 ×1 0⁸ 個^の H T^‑1 0 8 0 細 胞を^マウスの尾 静 脈 内ま た は鼠径 部 皮 下^に移 植し, 実 験 的 転 移 系^では腫 瘍 細 胞 移 植 後¹ , 2 週目^におけ^る転 移増 殖^{を C P A} 未 処 置 群と比 較^{し た. ま た}, 自 然 転 移 系^でほ腫 瘍細 胞 移 植 後3 , 5, 7 週目にお け る転 移 細 胞^の増 殖^{を C P A} 末処 置 群と比 較 検 討し た^.

Ⅴ. 実 験 的転 移 系を 用^いた肺 転 移 巣に対 する治 療 実験

ヌ ^ー ド^マ ウス尾 静 脈 内^{に H T}‑^{1 0 8 0 細胞を移 植 後, 1 週目に}

Cisplatin ( C D D P)2mg/kg ま た ほ adria mycin ( A D M ) 8m g/^kg を2⁷G 注 射 針^を用い て尾 静 脈 内 投 与^{し た.} 抗 癌 剤 投 与後^{1 お よ} び 3 週目^に肺を摘 出し, D N A を抽 出し た^.

Ⅵ^. D N A の抽 出方 法

摘 出^{し た}肺お よ びリ ン パ節ほ 4 ml の ホ モ ジナイ ズ緩 衝 液 ( 0^.1 M 塩 化^ナト リ ウム , 0^.2 M シ ョ糖, 0^.0 1 M E D T A , 0.3 M トリス ヒド^ロ キシメ チ ル ア ミ ノメ タン一^{塩 酸}pH 8^.0) 中で

ホ モジナイ ズ し た^. ホ モジ ネ ^ー ト はフ ァル^コ ン2 05 9^チュ

ー ブに

入 れ!25 0F^Ll の1 0% ^ドデシル硫 酸^{ナト リ ウム}(^{dode c}yトs odiu m‑

S ulfate, S D S) を加え携 拝し, 6 5 ℃の温 浴 中^にて3 0分 間加 温し た^■ さ ら^に, 6 0 0/^∠1 の8 M 酢 酸^{ナト リ ウムを}加^え横 枠 後! 6 0分 間 氷 中^に静 置し た^. 氷 冷後, 4 ℃, 1 1,0 0 0rpm に おい て2 0分 間 遠心 し, 水 層を新た な^{チ ュ ー} ブに回収し た. クロ･ ^ロ ホ ル ム 4

ml を加 え据 拝 後, 3,0 0 0rpm にお^いて1 0分 間遠^{心 し},D N A を抽 出し た. 水 層^を分 取し, ク^{ロ ロ}ホ ル ム4 ml, ト リス E D T A (T E) 緩衝 液 [^{1 0m M ト リス 一} 塩 酸 pH 7 .4, 0.1^m M E D T A pH 8･0] 飽 和^フェ ノ ^ー ル4 ml を加 え 据 搾 後, 3,0 0 0rpm にお^い

1 1

て1 5分 間 遠心 し D N A を抽 出^{し た.} 再度, ク^ロ･ ^ロ ホ ル ム4ml に おいて抽 出を行った後, 分取^{し た}水層^{に8 ml の エタノ ー ルを} 加え, 3,0 0 0rp^m にお^いて1 5分 間遠 心^{し D N A} を 沈 澱と して得 た^. 沈 澱は 5 mlの8 0% ^エ タノ ^ー ルで洗^い, 減 圧 乾煉さ せ た後^に 2 ml のT E 緩 衝 液^に溶 解^{した. D N A} 溶 液^{にリ ボヌ ク レア ー ゼ} A (S igm a 社, St.Lo uis, U S A)1 0 0FLg を加え, 3 7 ℃, 3 0分 間 反 応さ せ た後, 3 M 酢 酸^{ナ ト リ ウム2 0 0}〃1 を加^え, T E 緩 衝液 飽和^フェ ノ ^ール ^ー ク ^ロロ ホ ル ム(1 : 1) 2ml にて 1 回(3,0 0 0

rpm , 1 5分), クロ ロ ホ ル ム2r nI にて1 回(³,0 0 0rpm ,1 0分) 抽 出を行った. 分取した氷 層^に5 ^ml の^エ タ^{ノ ー ル} を加 え 3,0 0 0

rpm に て1 5分 間遠心 し^{エ タ ノ ー ル}沈 澱を行った. D N A ほ,

8 0% ^{エ タ ノ ール2 ml で}洗 浄^し, 減 圧 乾 燥さ せ た後, T E 緩 衝 液 に溶 解し た^.

Ⅶ. 鋳 型 ^{D N A の}調製

T E 緩 衝 液 中に溶解^{した D N A は}, 2 6 0n m における吸 光 度を 測 定し て D N A 濃度を求め た後 (^{1 0.D.=5 0}〃 g/^ml), 同緩 衝 液 を用^{いて 1 0 0}〃 g/^{ml に}調 製し た^. さらに_, 1 0 0 〟 g/ ^{ml の}

H T^‑1 0 8 0 細 胞^の D N A を 1 0 0J^Lg/ ^{ml の正常ヌ ー ドマ ウス の肺}

D N A によ り希 釈^し, H T‑^{1 0 8 0} 細 胞^{の D N A} 濃 度が 1 0², 1 0, 1,

1 0‑¹,1 0▼²,10 ³J^j g/^{ml の}段 階 希 釈 溶 液を調 製し た^.

Ⅶ^. プライ^{マ ー} お よ び プ^{ロ ー} ブ用オ リ^ゴヌ クレオチドの作 製 P C R 法^によ る特 異 的 遺伝 子 配列の増 幅^に用いる プ ラ イ ^{マ ー} お よ び P C R 増 幅 β^‑ グ^ロ ビン遭 伝 子 配列を検 出 す^{る プロ ー ブ} と し て, ヒトβ^{‑ グロビン}遺 伝 子 配 列^{l ￠)}よ り H^uβ一^{l 〜1 1 ま で}

の2 0塩 基^{か ら な る11}種 類^{の オ}リ^ゴヌ ク レオチ ド を合 成し た( 図 1). な お, ち^{れ らの オ リゴヌ ク レ オ チド ほ D N A} 合成 装 置 P C R メイ ト(Ap plied B io syste m 社,C A , U S A) ^によ り合 成し

た^.

Ⅸ. P C R 反 応

調 製し た鋳 型D N A l _{杵 g} に対し P C R 反 応 緩 衝 液 (^{1 0m M}

ト リス一塩 酸pH 8.3,5 0m M 塩 化^{カ リウム}, 1^.5m M 塩化^{マ グ} ネ^シ ウム), デオキシリボヌ クレオチ ド混 合 液 〔de o xy^ade n o sin e

5^㌧Tripho sphate ( d A T P ), de o xy gu a n o sin e 5‑^{'Tri p ho sphate} (^{d G T P})^,de o xycy tid in e 5

‑' ^Tripho sphate(d C T P),de o xy thymid‑

in e 5‑^'Trip ho sp h^ate(^{d T T P}) 各^{2 0 0}F^LM〕, T he rm u s aq^{u a}tic us

｢^Taq) ^{D N A ポリメ}ラ ^ー ゼ(Pe rk in‑^{E lm e r Cetu s} 社, No r w al k,

C T, U S A ) 2^.5単 位, ( +) 鎖お よ び (‑) 鎖^{プライ マ ー} 各¹

〃M を加え, 滅 菌 蒸 留 水^によ り 全量^{1 0 0}〃= ^仁調整し た^. 加 熱

によ る反 応 液^の蒸 発を防 ぐた め, 1 0 0/^Jl の ミネ^ラル オ イ ル

(^Sigm a 社) を重 層 ^{し た .} 反 応^{には D N A T he r m a}l Cycle r

( Pe rkin E lm e r Cetu s) を使 用し, 熱 変 性を 9 4 ℃, 2 分 間, ア

ニ ^ーリング を5 5 ℃, 2 分 間, D N A の伸 長^{を 7 2 ℃}, 2 分 間と し,

これを 1 サイク ルと し て2 5サイク ル繰り返した^. 反 応終 了 後,

上層^{の ミ}ネラ ルオ イ^ルを除 去し, ク^{ロ ロ}ホ ル ム 1 0 0〃l を加 え 振とう^し, 上層^に増 幅後^の D N A 溶 液^を得た^.

X ^. 増 幅された D N A の検 出

増 幅 後^{の D N A} 溶 液^{に 1 0}FLl の 3 M 酢 酸ナ トリ ウ^ム (pH 5^.2) お よ び 3 0 0/^̀1の ^エタ ノ ^ー ルを加え,1 5,00 0rpm に て2 0分 間 遠 心^{し D N A を}沈 澱^{さ せ た. D N A は}, 8 0% ^{エタ ノ ー ル 3 0 0}

〟1 に て洗 浄した後∴減圧 乾 燥し, 0^.0 6% プ^ロ ム フェ ノ ^ー ルブ ル^ー

, 0.0 6% ^{キシレン ア ノ ー ルお}よ^び6.7% ^{グ リセロ ー ル}を含

r e a ctio n; P P C_{, p}e ak _pla s m a con c e ntratio n; S D S,･^{dode c}yl^‑S Odiu m ^‑S ulfate; S P F, Sp^{e C}ific p^athog^{e n} fr e e; S S C,

S alin e s odiu rp ^citr ate; ^{S･ C･}, S ubc ut an e O u Sl_{y ;} Taq^, T herm u s aq^{ua t}ic us; T E, Tris E D T A