―検体種による差の検討―

(1)

イムノクロマト法による便中ノロウイルス検出キットの評価

―検体種による差の検討―

若葉こどもクリニック

山崎勉

（平成 27 年 9 月 24 日受付）

（平成 27 年 11 月 30 日受理）

Key words : norovirus, immunochromatography, rapid diagnosis

序文

ノロウイルスによる感染症は，毎年 10 月〜1 月に流行のピークを示し，年間を通して感染性胃腸炎の主要な原因ウイルスとして同定されている

^１）^２）

．ノロウイルスは遺伝子学的に genogroup I〜V の 5 つに大別され，I，II，IV がヒトに感染する

^３）^４）

．さらに，genogroup I（GI）および II（GII）は genotype に型別され，現在，GI には 19 種（GI. 1〜19），GII には 22 種（GII. 1〜

22）が存在する

^５）

．遺伝子変異を繰り返すことでヒトの免疫から逃れるため，数年サイクルで変異型によるアウトブレイクが発生する

^{６）〜９）}

．検出される主要な genotype は GII. 4 であるが，流行期終盤には GII. 2，

3，6 など，春先〜夏にかけては GI に由来する食中毒事例や散発事例も見られる

^２）

．

ノロウイルスに対する抗ウイルス薬やワクチンはないため，ノロウイルス感染を速やかに診断し，二次感染を防止することが重要である

^１０）

．ノロウイルスの検出方法として，遺伝子診断法（RT-PCR 法，リアルタイム PCR 法，LAMP 法）

^３）^１１）^１２）

，生物発光酵素免疫測定法（BLEIA 法）

^１３）

，イムノクロマト法

^１４）

があり，特にイムノクロマト法は，簡便で迅速性に優れるため臨床現場で有用である．外来受診時や入院時には便検体が得られないことも多く，直腸スワブを用いて採取した便（直採便）により検出可能であれば，適用範囲がひろがる．この度，イムノクロマト法を原理とするイムノキャッチ―ノロ（栄研化学）に関して，直採便検体と排泄便検体との比較検討を行った．

対象と方法

2014 年 10 月〜2014 年 12 月の期間に，若葉こども

クリニック（埼玉県）を受診し，嘔吐や下痢を呈して急性胃腸炎と診断した小児患者 97 名（4 カ月〜11 歳，

平均 2.9 歳，男児 49 例，女児 48 例）を対象とした．

対象患者全員に対して，保護者より検体採取の同意を得て，患者 1 名から直採便検体および排泄便検体の 2 検体を収集した．直腸からの検体採取は市販の滅菌スワブを使用して初診時に採取し，排泄便は原則として受診後に最初に排泄されたものを市販の採便容器にて採取した．発症から検体採取までに要した平均日数は，

直採便検体では 1.0 日（0〜4 日，中央値 1 日），排泄便検体では 1.9 日（0〜11 日，中央値 1 日）であった．

検体は採取後，検査まで−30℃ で凍結保存した．

ノロウイルス迅速診断キットとして，イムノキャッチ―ノロ（栄研化学，以下 IC-NV と略す）を用いた

^１４）

．また，迅速診断キットを施行した際の残存液を用いて，

RT-PCR 法によりノロウイルスを検出した．RT-PCR 法は，『ウイルス性下痢症検査マニュアル（第 3 版，地方衛生研究所・国立感染症研究所共編）』に記載された方法に準じて行った

^１１）

．ダイレクトシークエンス法により塩基配列を決定し，既知のノロウイルスと類似の配列が認められた場合のみ陽性と判断した．

結果および考察

RT-PCR 法およびダイレクトシーケンス解析の結果，97 検体中，直採便検体では 53 検体（54.6%），排泄便検体では 58 検体（59.8%）からノロウイルスが検出され，すべて GII であった．下痢症状の有無別の陽性率は，有群では 67.9%（38/56），無群では 48.8%（20/

41）であり，下痢症状有群での陽性率が有意に高かった（2 群の比率の差の Z 検定 p=0.0292）．下痢症状を呈している患者では，ウイルス排出量が多いと推定された．また，検出された genotype は GII. 4 Sydney

短報

別刷請求先：（〒350―2206）鶴ヶ島市藤金 333―2

若葉こどもクリニック山崎勉

92

感染症学雑誌第90巻第 1 号

(2)

Table 1 Distribution of norovirus genotype

Group Genotype Sample

Rectal swabs Fecal specimens

Diarrheal group

GII.3 2 3

GII.4 32 35

Positive nos. of norovirus 34 38

Total nos. of specimens 56 56

Non-diarrheal group

GII.3 1 1

GII.4 18 19

Total

GII.3 3 4

GII.4 50 54

Table 2 Comparison between immunochromatografic assay kit and RT-PCR method

Rectal swabs RT-PCR

Concordance Rate Positive Negative Total

IC-NV^＊

Positive 49 1 50 Positive : 92.5%

Negative 4 43 47 Negative : 97.7%

Total 53 44 97 Total : 94.8%

Fecal specimens RT-PCR

IC-NV^＊

Total 58 39 97 Total : 95.9%

＊IMMUNOCATCH Norovirus

2012 が 54 例（93.1%）と大部分を占め，残りの 4 例

（6.9%）は GII. 3 であった（Table 1）．

直採便検体における IC-NV と RT-PCR 法との陽性一致率，陰性一致率，全体一致率はそれぞれ 92.5%（49/

53），97.7%（43/44），94.8%（92/97）であった．同様に，排泄便検体においては，陽性一致率 93.1%（54/

58），陰性一致率 100%（39/39），全体一致率 95.9%（93/

97）であった．直採便では若干一致率が低く，偽陰性となる傾向があったが，RT-PCR 法をゴールドスタンダードとした際の一致率に検体種間での有意差はなかった（McNemar 検定 p=0.6547）．直腸からの検体採取においては，採便量が不十分となる場合や腸管粘液が多く混入する場合があり，検体種間で不一致例が発生したと考えられる．スワブ全体に糞便検体が付着するよう十分に採取することが重要である（Table 2）．

また，排泄便検体において下痢症状の有無による IC-NV の差を検討した．RT-PCR 法との一致率は，下

痢症状有群では陽性一致率 94.7%（36/38），陰性一致率 100%（18/18），全体一致率 96.4%（54/56），下痢症状無群ではそれぞれ 90.0%（18/20），100%（21/21），

95.1%（39/41）となり，下痢症状の有無による有意差は認められなかった（2 群の比率の差の Z 検定 p=

0.7492）．下痢症状の有無に関わらず，IC-NV は有用であると考える（Table 3）．

IC-NV の測定結果が検体種で乖離した例は 8 例

（W4-109，121，152，154，201，226，229，252）であった．そのうち直採便：陽性，排泄便：陰性例は 2 例（W4-109，121）であったが，RT-PCR 法では，1 例（W4-109）は直採便，排泄便ともに陽性であり，排泄便での IC-NV の偽陰性であった．もう 1 例（W4- 121）は両検体ともに RT-PCR 法陰性であり，直採便での IC-NV の偽陽性と判断された．直採便：陰性，排泄便：陽性例は 6 例（W4-152，154，201，226，229，

252）あったが，直採便からの RT-PCR 法では 2 例（W 4-152，154）のみが陽性，排泄便からの RT-PCR 法で

ノロウイルス検出キットにおける検体種差の検討 93

平成28年 1 月20日

(3)

Table 3 Comparison between diarrheal group and non-diarrheal group

Diarrheal group RT-PCR

IC-NV

Total 38 18 56 Total : 96.4%

Non-diarrheal group RT-PCR

IC-NV

Total 20 21 41 Total : 95.1%

Table 4 Comparison between fecal specimens and rectal swabs

IC-NV Fecal specimens

Rectal swabs

Total 54 43 97 Total : 91.8%

RT-PCR Fecal specimens

Rectal swabs

Total 58 39 97 Total : 94.8%

Table 5 Summary of the 11 mismatched cases

No. Age Gender Diarrhea

Rectal swabs Fecal specimens

Nos. of

days^＊ IC-NV^＊＊ RT-PCR Geno- type

Nos. of

days^＊ IC-NV^＊＊ RT-PCR Geno- type

W4-109 5 M ＋ 0 ＋＋ GII.4 1 − ＋ GII.4

W4-121 2 F ＋ 3 ＋ − − 3 − − −

W4-130 1 M − 0 − − − 0 − ＋ GII.4

W4-152 1 F ＋ 0 − ＋ GII.4 1 ＋＋ GII.4

W4-154 1 F − 0 − ＋ GII.4 0 ＋＋ GII.4

W4-201 4 F ＋ 0 − − − 1 ＋＋ GII.3

W4-226 2 M ＋ 0 − − − 0 ＋＋ GII.4

W4-229 1 M ＋ 0 − − − 1 ＋＋ GII.4

W4-252 5 M ＋ 0 − − − 1 ＋＋ GII.4

W4-262 2 F − 0 − ＋ GII.3 1 − ＋ GII.3

W4-264 3 M ＋ 0 − ＋ GII.4 11 − ＋ GII.4

＊The number of days from onset of acute gastroenteritis to specimen collection

＊＊IMMUNOCATCH Norovirus

はすべて陽性であった．IC-NV における直採便と排泄便間での陽性一致率，陰性一致率，全体一致率はそれぞれ 88.9%（48/54），95.3%（41/43），91.8%（89/97）

であった．一方，RT-PCR 法の結果が検体種間で乖離した例は 5 例（W4-130，201，226，229，252）であった．すべて直採便では陰性，排泄便では陽性であり，

RT-PCR 法における直採便と排泄便の一致率は，陽性一致率 91.4%（53/58），陰性一致率 100%（39/39），

全体一致率 94.8%（92/97）であった．各法における検体種間の一致率については，IC-NV と RT-PCR 法間に有意差はなく（McNemar 検定 p=0.1797），両方法において直採便で偽陰性となる傾向が示された．ま

山崎勉

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感染症学雑誌第90巻第 1 号

(4)

た，測定方法間で結果が乖離する検体が 2 例（W4-262，

264）あった．いずれも IC-NV では直採便，排泄便ともに陰性，RT-PCR 法では直採便，排泄便ともに陽性であり，測定法の違いによる感度差であると推定された．検体種間または方法間で不一致となった検体の詳細を解析した．不一致検体に一部重複があったため，

全 11 例の詳細を記した．年齢や性別，下痢症状の有無，genotype など不一致検体の共通点は見出せなかったが，発症から検体採取までの時間を比較すると，直採便検体は，比較的発病初期に採取されていることが多く，腸管におけるウイルス量がより少量である可能性が示唆された（Table 4，5）．

今回検討した IC-NV に関して RT-PCR 法を比較対象とした場合の一致率は，直採便検体，排泄便検体とも 90% 以上であり，臨床的有用性は高いと判断される．ノロウイルス感染症の経過中には，急性期症状として嘔吐が主体で，下痢が見られないこともあり，外来受診の際や入院時には便検体が得られないことも多い．直採便が適用可能なことは，より迅速な病原診断および施設内感染防止対策の観点より，臨床的意義が大きい．直採便と排泄便の間で検出率に若干の不一致があることを念頭に置き，ノロウイルス感染の診断補助として用いることが重要である．

本臨床試験の内容は，UMIN 臨床試験登録システム

（http://www.umin.ac.jp/ctr/index-j.htm）に登録・公開されている（UMIN000020102）．

利益相反自己申告：本研究の実施にあたり，栄研化学株式会社より研究助成を受けた．

文献

1）国立感染症研究所感染症疫学センター：病原微生物検出情報（http://www.nih.go.jp/niid/ja/ias r/510-surveillance/iasr/graphs/1532-iasrgv.htm l）.

2）国立感染症研究所感染症疫学センター：ノロウイルス等検出状況（http://www.nih.go.jp/niid/j a/iasr-noro.html）.

3）Centers for Disease Control and Prevention：

Updated norovirus outbreak management and disease prevention guidelines. MMWR Recomm Rep 2011；60（RR-3）：1―15.

4）Zheng DP, Ando T, Fankhauser RL, Beard RS, Glass RI, Monroe SS：Norovirus classification and proposed strain nomenclature. Virology 2006；346：312―28.

5）田中智之：新規に保険収載された検査法ノロウイルス抗原迅速定性検査．モダンメディア 2012；58：337―41.

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9）Lu J, Sun L, Fang L, Yang F, Mo Y, Lao J,et al.：Gastroenteritis outbreaks caused by norovi- rus GII. 17, Guangdong Province, China, 2014- 2015. Emerg Infect Dis 2015；21：1240―2.

10）田中智之，位田忍，浅利誠志，藤沢卓爾，鍵本聖一，牛島廣治，他：ノロウイルス感染と予防指針．臨とウイルス 2011；39：115―60.

11）国立感染症研究所：ウイルス性下痢症検査マニュアル（第 3 版）．2003；p. 44―62.

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13）鈴木渉，大廣義幸，塚越博之，木村博一：新たに開発した生物発光酵素免疫測定法（BLEIA）

によるノロウイルス検出法の評価．感染症誌 2015；89：230―6.

14）山崎勉，由井郁子，森島直哉，黒木春郎：金コロイドを用いた新規イムノクロマト法による便中ノロウイルス検出試薬の有用性．感染症誌 2013；87：27―32.

Comparison of Performance between Stool and Rectal Swab Specimens for the Norovirus Rapid-diagnostic Kit

Tsutomu YAMAZAKI

Wakaba Childrenʼs Clinic

〔J.J.A. Inf. D. 90：92〜95, 2016〕

ノロウイルス検出キットにおける検体種差の検討 95

平成28年 1 月20日

―検体種による差の検討―

イムノクロマト法による便中ノロウイルス検出キットの評価