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●総 説●

Wingless/Wnt蛋

白質のシグナル伝達機構

柳川

伸 一

Wnt蛋 白質 は初期発 生や形 態形成過 程で生 ずる細 胞間相 互作用 を仲介す るシグナル分子 で,種 をこえてよく保存された大きな遺伝子ファミリーによりコードされている。Drosophila のWnt蛋 白質Winglessは 胚の 分節化 など に働 くが,近 年,遺 伝学 的解析 によ り互 いに性 質の 異なる4つ のセグメン トポラ リティー遺 伝子がWinglessの シグナル伝達経 路の構成 員 と なって いることが 明 らか にされ た。さ らに この 経路 は脊椎動物 でも保 存され ている こと も 示された。 最近,Wnt受 容体 がfrizzled遺 伝子 フ ァミリー によ りコー ドされていること が発 見され,wnt遺 伝 子研 究は新展 開を始 めて いる。

Key werds

【wnt遺 伝 子 】 【シ グ ナ ル 伝 達 】 【発 生 】 【セ グ メ ン トポ ラ リ テ ィー 遺 伝 子 】 は じめ に Wingless/Wnt蛋 白質 は種 々 の生 物 に おい て そ の 初 期 発 生 や 形 態 形 成 過 程 で 生 じ る 細 胞 問 相 互 作 用 を仲 介 す る シ グ ナ ル 分 子 で あ る。Wntの 生 物 活 性 の 解 析 に関 し て は,線 虫,Drosophila,Xenopusそ し て マ ウ ス と さ ま ざ まな 系 を用 い て 個 体 ・細 胞 レベ ル で 活 発 に研 究 が 行 な わ れ て お り,膨 大 な 量 の 優 れ た論 文 が 存 在 し て い る 。 した が っ て そ の 全 体 を レ ビ ュ ー す る こ と は 困 難 であ る。 そ こで本 稿 で は,Wingless/Wnt蛋 白質 の標 的 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 解 析 に焦 点 を しぼ り, Wnt受 容 体 の発 見 な どの 最 新 の 知 見 や 筆 者 が 行 な っ た Dishevelledに 関 す る研 究 を も含 め,こ の 分 野 の 現 状 を 解 説 す る 。

I. 細胞間コミュニケーシ ョンに働 くWnt蛋 白質ファミ リー

1. Wnt蛋 白 質 1982年NusseとVarmusは マ ウ ス 乳 癌 ウ イル ス に よ る乳 癌 の 発 生 に か か わ る 癌 遺 伝 子 と し てint-1を 発 見 し た1)。 さ ら にNusseら はint-1のDrosophila(以 下 ハ エ と記 す)相 同 体 を ク ロ ー ニ ン グ し た 。 そ れ は ハ エ 胚 の パ タ ー ン,と く に体 節 構 造 の 形 成 に か か わ っ て い る セ グ メ ン トポ ラ リテ ィー 遺 伝 子[→ 今 月のKey Words (p.50)]wingless(以 下wg)と 同 一 で あ っ た2)。wgは 翅 や 脚 の 形 態 形 成 に も働 い て お り,弱 い ア レ ル で は翅 が 欠 損 す る こ とか ら そ の 名 が あ る。wntと い う遺 伝 子 フ ァ ミ リ ー の 名 称 はwinglessと,int-1に 由来 す る も の で あ り,脊 椎 動 物(マ ウ ス)で は20個 近 い メ ン バ ー が,ハ エ で も4個 の メ ンバ ー が 確 認 さ れ て い る。wgは

Shin-ichi Yanagawa,京 都 大 学 ウ イ ル ス 研 究 所 が ん 遺 伝 子 研 究 分 野 (〒606 京 都 市 左 京 区 聖 護 院 川 原 町)[Laboratory of Gene Analysis,Department of Viral Oncology,Institute for Virus Research,Kyoto University,Sakyo-Ku,Kyoto 606,Japan] Wingless/Wnt Signal Transduction Mechanism

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Wingless/Wnt蛋 白質 の シ グ ナ ル伝 達 機 構 23 Dwnt-1と も よ ばれ る が,wg の ほ うが 一 般 的 で,Xenopus で はXwnt,マ ウ ス お よ び wnt遺 伝 子 全 体 を 示 す 場 合 に は単 にwntと い う名 称 が 用 い られ て い る。Wnt蛋 白 質 は分 子 量 約40KのN末 端 に シ グ ナ ル 配 列 を もつ 分 泌 性 糖 蛋 白 質 で あ る3)。Cysを 多 く含 み そ の22個 のCysの 位 置 はす べ て のWntに 保 存 され て い る こ と か ら,Wntは 特 徴 あ る強 固 な 高 次 構 造 を も っ て い る と考 え ら れ る。Wntは 各Wntに 特 異 的 な 発 現 パ タ ー ン を示 すが, 分 泌 され たWnt蛋 白質 の ほ と ん ど は,細 胞 外 基 質 に 結 合 す る。 した が っ てWntの 作 用 は 産 生 細 胞 の 近 傍 で の み 発 揮 さ れ る。 後 述 す るWgの 場 合 を除 き,一 般 に生 物 活 性 を 保 っ た 可 溶 性 のWnt蛋 白質 を得 る こ とは 困 難 で,そ れ がWntの 生 化 学 的 研 究 の 展 開 を妨 げ て き た 。 2. Wntの 生 物 活 性 最 も解 析 が 進 ん で い る の はハ エ のWgで,初 期 胚 に お け る分 節 化(後 述),中 枢 神 経 発 生,翅 肢 の形 態 形 成, 中 腸,マ ル ピギ ー 管,複 眼,心 臓 の 器 官 形 成 な ど多 種 多 様 な 局 面 で 働 い て い る こ とがwg変 異 体 を用 いた 発 生 遺 伝 学 的 研 究 に よ り解 明 さ れ て い る 。 詳 し く は他 の 総 説 を 参 照 され た い3∼6)。一 方,マ ウ スWntに 関 し て は McMahonら に よ り作 製 され た各 種wnt遺 伝 子 ノ ッ ク ア ウ トマ ウ ス の 表 現 型 よ り,Wnt-1は 中 脳 の 形 成 に, Wnt-7aが 肢 芽 の 背 腹 軸 に 沿 っ た パ タ ー ン 形 成 に, Wnt-3aが 前 肢 よ り後 方 の 体 節 中 胚 葉 誘 導 に,そ し て Wnt-4が,腎 臓 の 形 成 に 働 い て い る こ とが 明 らか に さ れ て い る。 これ ら の 分 野 の詳 細 に つ い て は総 説 が あ る の で そ れ を 参 照 さ れ た い7)。 ま たXenopus初 期 胚 で Xwnt-8やWnt-1,Wgな どを発 現 させ る と2次 体 軸 が 形 成 さ れ,双 頭 の オ タ マ ジ ャ ク シが 生 じる こ とか ら,特 定 のWnt(2次 軸 を誘 導 しな いWntも ある)に はNieuw-koopセ ン タ ー*1と し て の 活 性 が あ る もの と考 え られ る。 こ の 点 に関 し て は一 部 後 述 す る が,詳 し く は他 の 総 説 を 参 照 され た い3,8)。 II. Wg/Wntシ グ ナ ル伝 達 経 路 1. 経 路 の 概 略 図1は ハ エ の胚 上 皮 にお け るWg標 的 細 胞 中 で のWg 経 路(パ ラ ク ラ イ ン経 路)を 模 式 的 に 示 し て あ る3,5,6,9)。 ま た 図2で はハ エ に お け るWg経 路 とお もにXenopus 胚 の 系 を用 い て 得 られ た 脊 椎 動 物 のWnt経 路 を対 照 的 に 示 し て あ る。 図1に 示 す よ う にporcupine(porc:ヤ マ ア ラ シ の意)はWgの 分 泌 に 関 与 す る遺 伝 子 で 最 近 ク ロー ン化 され た(門 脇 辰彦,Perrimon:私 信)。 分 泌 さ れ たWgは そ の 受 容 体Dfrizzled2(Dfz2)10)に 結 合 し, シ グ ナ ル をDishevelled(Dsh:髪 ボ サ ボ サ の 意)11)に 伝 達 す る。 活 性 化 さ れ たDshは,Ser/Thrキ ナ ー ゼ Zeste-White-312)(ZW3,別 名Shaggy)の 機 能 を抑 制 す る 。ZW3は 本 来Armadillo(Arm)13)を 負 に 制 御 し て い るの で,Wgシ グ ナ ル は, armをzw3に よ る抑 制 か ら解 除 す る こ と に な る 。 実 際 に 生 じ る こ と はWgシ 図1 Drosophila胚 上 皮 に お け るWinglessシ グ ナ ル 伝 達 経 路

Wgの 分 泌 をPorcが 促 進 す る。 受 容 体Dfrizzled2にWgが 結 合 す る と,Dsh,ZW3,Armと いう セ グ メ ン トポ ラ リテ ィ ー 遺伝 子 産 物 が 次 々 に働 きシ グ ナ ル を核 内 に伝 達 す る 。 そ の 結 果,核 内 でEnが 発 現 し体 節 の 後 部 コ ン パ-ト メ ン トが確 立 さ れ る。Wg経 路 に 加 え 本 図 に はArmが カ ド ヘ リン と結 合 す る こ と,DsnがNotchと 結 合 す る こ と も 示 して あ る。 *1 そ の 背 側 に隣 接 し た細 胞 を オ ー ガ ナ イザ ーへ と誘 導 す る活 性 を も つ植 物 極 側 の 細 胞 集 団 。

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24 蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.42 No.1 (1997) グ ナ ル に よ り細 胞 質 内 のArm蛋 白質 レベ ル が 著 し く上 昇 す る こ とで あ る。 蓄 積 したArmの 一 部 は,特 定 の核 内転 写 因 子 に 結 合 し,Wgの 標 的 遺 伝 子 群,た と え ば engrailed(en)やhedgehog (hh)の 発 現 や 維 持 に 働 く と 考 え ら れ て い る 。 こ れ がWg経 路 の 概 略 で あ る が,図1に は そ れ に 加 え,(1)ArmはDα カ テ ニ ン(catenin), D-Eカ ド ヘ リ ン(cadherin)(こ の 両 者 は 小 田,上 村,竹 市 ら に よ り 同 定 さ れ た)と 複 合 体 を 形 成 し,カ ド ヘ リ ン に よ る 細 胞 接 着 の 機 能 も に な っ て い る 点14), (2)Dshは 多 機 能 の シ グ ナ ル 仲 介 分 子 で,Notch蛋 白 質 のC 末 端 部 分 に 結 合 しSu(H) (Suppressor of Hairless)の 核 移 行 を 抑 制 す る こ と に よ っ てNotch経 路(lateral inhibi-tion)と 拮 抗 し て い る 可 能 性15) に つ い て も 示 し て あ る 。 図2 は,ハ エ のWg経 路 の構 成 員 の相 同 体 は脊 椎 動 物 に も 存 在 し,Wnt経 路 の な か で もハ エ の場 合 と同 じ よ うに 機 能 して い る こ と を示 し た も の で あ る。 ち な み に 線 虫 で も こ の モ デ ル は 基 本 的 に 適 応 で き る(後 述)。 ハ エ で はAPCの 相 同 体 の 存 在 は確 認 され た もの の機 能 は不 明 で あ り,ま た ハ エ にお い て は,Armと 結 合 す る と考 え ら れ るLef-1様 の 核 内転 写 因 子 は未 同 定 で あ る。 2. Wg/Wntシ グ ナ ル 伝 達 経 路 の 解 析 に 用 い ら れ て い る 実 験 系 図1,2に 示 し た シ グ ナ ル 伝 達 経 路 が 提 唱 さ れ る う え で 最 も大 きな 役 割 を 果 た し た の はハ エ 胚 の 初 期 発 生 に 関 与 す る セ グ メ ン トポ ラ リテ ィ ー 遺 伝 子 群(分 節 遺 伝 子 の 階 層 の な か で ペ ア ル ー ル とホ メ オ テ ィ ッ ク遺 伝 子 の 間 に位 置 づ け ら れ,体 節 の 極 性 決 定 に か か わ る 。 他 の 総 説3∼6)参照)の 相 互 作 用 の研 究 で あ る。 図3の 模 式 図 お よ びAに は 野 生 型 ハ エ の1齢 幼 虫 の ク チ クラ 構 造 が 示 して あ る が,1つ の 体 節 の 前 部(Wg産 生 細 胞 か ら 離 れ た 部 分)に はdenticle belt(歯 状 突 起 列)が 存 在 す る の に対 し後 部(Wg産 生 細 胞 お よ び そ の 近 傍 でWg 刺 激 を受 け る 部 分)はnaked cuticle(歯 状 突 起 の な い ク チ ク ラ)か ら な っ て い る。 し た が っ て この ク チ ク ラ パ タ ー ン は体 節 の 前 後 部 の 構 造 を反 映 す る 。 図3Bは 図2 DrosophilaのWingless経 路 と 脊 椎 動 物 のWnt経 路 の 比 較 図3 Wingless経 路 の 遺 伝 学 的 解 析 に 用 い ら れ た セ グ メ ン トポ ラ リ テ ィー 遺 伝 子 変 異 の 表 現 型 左 図 お よびAは 野 生 型 ハエ の1齢 幼 虫 の 体 節 構 造 と クチ ク ラパ タ ー ン を示 す。 野 生 型 の場 合,体 節 の前 方 部 分 だ け に歯 状 突 起 列 が み られ る の に対 し,B(wg変 異), C(dsh変 異)で は体 節 の 極 性 が 失 わ れ,前 部 後 部 両 方 に歯 状 突 起 列 が 生 じて い る 。

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Wingless/Wnt蛋 白質 の シ グ ナ ル 伝 達 機 構 25 wg変 異 体 で 体 節 の後 部 構 造 が 欠 損 し,か わ りに前 部 の 構 造 が 鏡 像 対 称 的 に生 じて い る。 図3Cはdsh変 異 体 で wgと 同様 の ク チ ク ラ パ タ ー ン を 示 す 。 wgは リガ ン ド を コー ドし て い るcell nonautonomous遺 伝 子 で あ り, 一 方_{,wg同 様 の クチ ク ラ 表 現 型 を 示 すdsh,armは} cell autonomous遺 伝 子 で あ る。 した が っ てdsh,arm は と も にwg標 的 細 胞 中 に お い てWgの シ グ ナ ル 伝 達 に働 い て い る遺 伝 子 で あ ろ う と推 測 され た。 またzw3 変 異 体 はnaked cuticleを 与 え るが,こ れ もWg経 路 の一 員 で あ る ことが わか り12),wg,dsh,zw3,arm変 異 体 の 間 で 種 々 の 組 合 せ の 二 重 変 異 体 が 作 製 され,い わ ゆ る エ ピス タ シ ス解 析 に よ り,こ れ らの 遺 伝 子 間 の 上 下 関 係 が 明 らか に さ れ た 。Nusse16), Perrimon17), Peifer18)の3グ ル ー プ に よ る これ らの 遺 伝 学 的 解 析 が Wg経 路 の フ レ ー ム ワ ー クの 基 礎 とな っ て い る。 Nusseら は こ のWg経 路 を生 化 学 的 に検 証 す る た め に,簡 便 なWg in vitroア ッセ イ 系 を 開 発 し た19)。す で にWnt-1に よ るマ ウ ス乳 腺 細 胞 株C57MGの トラ ン ス フ ォー メ ー シ ョ ン を使 っ たWnt-1の ア ッセ イ 系 が あ っ た が 実 用 的 で は な か っ た 。 まず ハ エ のSchneider S2 と い う細 胞 株 に 熱 シ ョ ッ ク プ ロモ ー タ ー の 下 流 にWg cDNAを 結 合 さ せ た プ ラ ス ミ ド を導 入 し,そ の 細 胞 を 熱 処 理 す る こ とに よ り,初 め て 生 物 活 性 を 保 持 した 可 溶 性Wg蛋 白 質 標 品 を得 る こ とが で きた 。 図4に 示 す よ う に,Wgに 感 受 性 を もつ ハ エwing imaginal disc (翅 原 基)細 胞 株clone-8(cl-8)を こ の可 溶 性Wgで 短 時 間(10分 ∼2時 間)処 理 す る と,細 胞 内 のArm蛋 白質(hypo-phosphorylated form)の 著 し い蓄 積 が 生 じ る。 これ はハ エ の 胚 上 皮 にお い て,Wg産 生 細 胞 の近 傍 に位 置 し,Wg蛋 白 質 に よ る刺 激 を 受 け る細 胞 で は著 し いArm蛋 白 質 の蓄 積 が み られ る こ と に ヒ ン トを得 た ア ッ セ イ 系 で あ る 。 この と き筆 者 はNusse研 にい た が, ハ エ の発 生 遺 伝 学 を 専 門 と す る ボ ス ドク の 多 く は こ の 系 の 有 用 性 に は懐 疑 的 で,の ち にWg受 容 体 の 同 定 に 寄 与 す る と は誰 も考 え て い な か っ た 。 図4に は筆 者 が 発 見 し たWgに よ るDshの 速 や か な リ ン酸 化 の誘 導 の 結 果 も示 し た20)(詳 し くは後 述 す る)。 さ ら に,Xenopus初 期 胚 の 腹 側 の 割 球 にWnt-1, Wg, Xwnt-8な ど のmRNAを 注 入 す る と新 し く背 側 中胚 葉 が 誘 導 さ れ2次 体 軸 が 生 じ る こ とが 報 告 され て い た8)。 図5に 示 す よ う にXDsh21),ド ミナ ン トネ ガ テ ィ ブなGSK3β22),β カテニ ン23)そ してLef-1(lymphoid enhancer-binding factor-1)24)に もWnt同 様 の活 性 が 次 々 に 確 認 さ れ た ° こ れ らの 一 連 の研 究 か ら,図2に 示 す よ う なハ エ,脊 椎 動 物 に お け るWg/Wnt経 路 の 共 通 性 が 認 め ら れ る よ うに な っ た 。 以 下 の部 分 で はWg/ Wnt経 路 の 各 構 成 員 に つ い て 解 説 す る。

図4 Drosophila翅 原 基 細 胞 株clone-8を 用 い たWingless のin vitroア ッ セ イ 系 cl-8細 胞 をWgで 処 理 す る と著 しいArm蛋 白 質 の蓄 積 とDshの 高 度 リン酸 化 が 生 じる。 図5 Wnt経 路 の 構 成 員 をXenopus初 期 胚 の 腹 側 で 発 現 さ せ る と2次 体 軸 が誘 導 され る。

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26 蛋 白 質 核 酸 酵 素 Vol.42 No.1  (1997)

III. Wg/Wnt受 容 体 を コー ドするfrizzled遺 伝 子 フ ァミ リー

Wg/Wnt受 容 体 遺 伝 子 の 同 定 は1982年 にWnt-1が 発 見 され て以 来,Wg/Wnt分 野 の最 大 の 課 題 で あ っ た が,1996年,Stanford大 学 のNusse研 とJohns Hop-kins大 学 のNathans研 の 共 同研 究 に よ り,そ れ がfriz-zled(ち ぢ れ 毛 の 意 味)と い う種 を こ え て よ く保 存 さ れ て い る遺 伝 子 フ ァ ミ リー に 対 応 す る こ とが 明 らか に さ れ た10)。

Adlerら はハ エ の 翅 の 上 の 毛 の 流 れ の 方 向(tissue polarityあ る い はplanar polarity)が 乱 れ る変 異 体 よ

りfrizzled遺 伝 子(現 在 はDfz1と 略 さ れ る)を 発 見 し, そ れ がN末 端 に シ グ ナ ル 配 列 を も ち,さ ら に7回 膜 貫 通 ドメ イ ン を そ な え た 膜 蛋 白 質 を コ ー ド して い る こ と を報 告 し た(図6)25)。 さ ら に彼 ら はfrizzled遺 伝 子 の 下 流 でdsh遺 伝 子 が 働 い て い る こ と を示 し た26)。一 方 Nathansら は,ハ エ,マ ウ ス,ラ ッ ト,ヒ トな どでDfz1 の 相 同 体 を 検 索 し,ハ エ で 新 し い 遺 伝 子Dfrizzled2 (Dfz2)を,マ ウ ス,ラ ッ ト,ヒ トで8種(Mfz1∼8) の相 同 遺 伝 子 を発 見 した27)。マ ウス 初 期 胚 に お いて各 々 のfrizzledは 特 異 的 な 発 見 パ ター ンを 示 した。 一 方 筆 者 は,前 述 したcl-8細 胞 を用 い たWgア ッセ イ 系 を 用 い た解 析 の途 中 で,Schneider S2細 胞 で はDshよ り下 流 のWg経 路 は そな わ っ てい る もの の,受 容 体 を含 むDsh よ り上 流 の 構 成 員 に 欠 損 が あ る た め,S2細 胞 をWg処 理 し て も シ グ ナ ル が 伝 わ らず,Armの 蓄 積 が生 じ な い こ とを 報 告 し て い た20)。Nathansはfrizzled遺 伝 子 フ ァ ミ リー がCysに 富 む 細 胞 外 ドメ イ ン を もつ膜 蛋 白質 (図6)を コ ー ドす る こ と,そ して さ らにWgの 場 合 と同 様, dsh遺 伝 子 が そ の 下 流 で 働 い て い る こ とか ら,frizzledフ ァ ミ リー はwntフ ァ ミ リー の受 容 体 を コ ー ド して い る の で は な いか と推 測 した。 またDfriz-zled2はcl-8細 胞 で そ の 発 現 が 認 め られ るの に対 し,S2細 胞 で は発 現 し て い な い こ と は, 筆 者 ら の推 測 に も よ く対 応 す るもので あっ た。Wg受 容 体 が Dfrizzled2で あ る と す れ ば,受 容 体 を 欠 く と思 わ れ る S2細 胞 にDfrizzIed2を 発 現 させ,Wg刺 激 を行 なえ ば, Arm蓄 積 が認 め られ る よ う にな る 可 能 性 が あ る。Nusse 研 のBrinkは これ を証 明 し た。 彼 らは さ ら にWg蛋 白 質 が,Dfz2の み な ら ずDfz1そ し て マ ウ ス の 数 種 の Frizzled(Fz)に 結 合 す る こ と,Wgの 結 合 に は膜 貫 通 部 よ りN末 端 側 の 細 胞 外 ドメ イ ンで 十 分 で あ る こ と を 示 した(図6)10)。 お そ ら くCysに 富 む ドメ イ ン(10個 のCysの 位 置 が よ く保 存 さ れ て い る)にWntが 結 合 し, そ れ に 続 く ヒ ン ジ領 域 は細 胞 外 基 質 上 に 存 在 す るWnt を認 識 す る の に必 要 な フ レ キ シ ブ ル は構 造 を つ くっ て い る と考 え られ る。 7回 膜 貫 通 領 域 はFzフ ァ ミ リー 間 で よ く保 存 され て い るが,続 く細 胞 内 ドメ イ ンは各 々 のFzに 特 有 な配 列 で あ る。 多 くのFz蛋 白質 のC末 端 にはX-Ser/Thr-X-Valが あ る。NMDA受 容 体 やK+チ ャ ネル な どのC末 端 に も この 配 列 が あ り,そ こ にPDZド メ イ ン(詳 し く はDshの 項 参 照)を も つ 蛋 白 質 が 結 合 し,受 容 体 の集 合 を行 な っ て い る こ とが 知 られ て い る28)。Fzで も同 様 の 現 象 が あ る の か は不 明 で あ るが,Dshに もPDZド メ イ ンが あ る11)。Wnt結 合 に よるFz活 性 化 の 機 構 は不 明 で あ る が,同 じ7回 膜 貫 通 蛋 白 質 で あ るG蛋 白 質 に共 役 し た 受 容 体 の 解 析 が 参 考 に な る と考 え られ る。Dfz2に 変 異 を もっ たハ エが 得 られて いな いので,Dfz2がin vivo でWg受 容 体 と し て 機 能 し て い るの か 否 か は不 明 で あ る。1種 のWntは 数 種 のFzに 結 合 し,逆 に1種 のFz は数 種 のWntを 認 識 で きる もの と考 え られ る の で,こ の よ う な機 能 的 リダ ンダ ン シー の 問 題 は個 々 のWntの in vivoに お け る作 用 の う えで き わ め て 重 要 な 問 題 で あ り,frizzledノ ッ ク マ ウ トマ ウ ス とwntノ ッ ク ア ウ ト 図6 Wingless/Wnt蛋 白 質 の 受 容 体Frizzledの 構 造

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Wingless/Wnt蛋 白質 の シ グナ ル 伝 達 機 構 27 マ ウ ス の 表 現 型 の 比 較 が 必 要 と な ろ う。 最 近,Sawaら29) は 線 虫 のlin17(Fz)がlin44 (Wnt)の 受 容 体 で あ る こ と を 報 告 して お り,fz遺 伝 子 フ ァ ミ リー の 構 造 と機 能 が 進 化 上 よ く保 存 さ れ て い る こ とが 理 解 で き る。 IV. 新 しい シグナ ル トラ ンスデ ュー サ ーDishevelled(Dsh)蛋 白質 Frizzledか ら の シ グ ナ ル は Dshに 伝 え ら れ る と考 え ら れ る が そ の 機 構 は不 明 で あ る 。 図7に 示 す よ うに,N末 端 部, PDZ/DHR領 域 を 含 む 中 央 部,さ ら に そ のC末 端 側 と3 つ の領 域 が 種 を こ え て保 存 され て い る。Dshは65∼70 Kの お もに細 胞 質 に存 在 す る リン酸 化 蛋 白質 であ る11,20)。 PDZ領 域(PSD-95,Discs large,ZO-1に 共 通 に 存 在 す る こ とか ら名 づ け ら れ た約100ア ミ ノ 酸 か ら な る蛋 白 質 問 相 互 作 用 にか か わ るモ チ ー フでDHR,GLGFと も よ ば れ る)を 除 い て は既 知 の 蛋 白 質 と相 同性 を も た ず,ハ エ,マ ウ ス の 多 く の組 織 に,恒 常 的 な 発 現 が 認 め られ る。 筆 者 はcl-8細 胞 を用 い てWg刺 激 に よ り Dshが 速 や か にSer/Thrリ ン 酸 化 を受 け,生 じた 高 リ ン酸 化 型Dshは 細 胞 膜 に局 在 す る こ と を 明 ら か に し た20)。さ ら に,cl-8細 胞 内 でDshを 強 制 発 現 させ る と, Wg刺 激 が な く と も シ グ ナ ル 伝 達 が 生 じ,Armの 蓄 積 が 生 じ る こ と を発 見 し た20)。種 々 のDsh変 異 体 を用 い てArm蓄 積 を誘 導 す る の に重 要 な領 域 を決 定 した 結 果 が 図7に ま とめ て あ る。PDZ領 域 が 重 要 で,Arm誘 導 能 の あ るDshは 強 制 発 現 させ る とすべ て高 度 にSer/Thr リ ン酸 化 され て い た。 筆 者 は高 リ ン酸 化 型Dshが 活 性 型 で あ る と考 え て お り,実 際 に カ ゼ イ ン キナ ー ゼII,プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼC(PKC)に 分 類 され る少 な く と も 2種 類 のSer/Thrキ ナ ー ゼ がDshに 結 合 す る こ とが 知 られ て い る(Nusse:私 信)。Dshの 作 用 機 構 の 実 体 は不 明 で あ るが,PDZ領 域 を 介 してWg経 路 の 構 成 員 の 間 を つ な ぎ あ わ せ て い る と思 わ れ,N末 端 部 分 はNotch と結 合 す る と の 報 告 も あ る15)(図1)。

V. ZW3/GSK3β

はArm/β カテニンレベルを負に制御す

る

グ リ コ ー ゲ ン 合 成 酵 素 キ ナ ー ゼ(glycogen synthase kinase 3:GSK3)は グ リ コ ー ゲ ン合 成 酵 素 を リ ン 酸 化 す る キ ナ ー ゼ と し て 発 見 さ れ た が,グ リ コー ゲ ン代 謝 だ け で な くイ ン ス リ ンに よ る蛋 白 質 合 成,c-Junな どに よ る 転 写 調 節 な ど種 々 の 生 物 活 性 を仲 介 して い る こ と が 明 らか に さ れ て い る30)。ハ エ のZW3変 異 体 で は胚 上 皮 細 胞 中 のArm蛋 白 質 レベ ル が 上 昇 す る こ と,ま た こ の 変 異 体 は ラ ッ トのGSK3β(47Kア イ ソ フ ォ ー ム)に よ り レ ス キ ュ ー さ れ る こ と よ り,ZW3/GSK3β は, Arm/β カ テ ニ ン レベ ル を 負 に 調 節 し て い る(転 写 後 レ ベ ル の 調 節)こ とが 明 らか に な っ た12)。ZW3/GSK3β に はそ のN末 端 に よ く保 存 され たSGRARTS/TSFAE な る 配 列 が あ り下 線 のSerが リ ン酸 化 さ れ る とZW3/ GSK3β の キ ナ ー ゼ 活 性 は 著 し く低 下 す る30)。Wgや Dshか ら の シ グ ナ ル はZW3の 作 用 を 抑 制 す る こ とに よ りArm蓄 積 を生 じ させ て い るの で あ るが,そ れ がZW3 の キ ナ ー ゼ 活 性 の 阻 害 に よ るの か そ れ と もZW3キ ナ ー ゼ の 作 用 と拮 抗 す る ホ ス フ ァ タ ー ゼ の 活 性 化 な ど の 機 図7 Dishevelled蛋 白 質 の 構 造 と そ の 変 異 体 のArmadillo蛋 白 質 誘 導 活 性 最 上 部 に はDshの 構 造 を模 式 的 に示 して あ る。 それ と対 応 す るよ うに,全 長Dshお よ び各 種Dsh 欠 失 体 の構 造 を表 わ した。PDZ領 域 はGLGF/DHR領 域 と も よ ば れ る。

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28 蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.42 No.1 (1997) 構 に よ る の か は不 明 で あ る。 最 近Wgは,PKCを 介 し てGSK3β の キナ ー ゼ活 性 を低 下 させ て い る との 報 告 が あ る31)。ZW3/GSK3β の キ ナ ー ゼ を失 活 させ た 変 異 体 は ド ミナ ン トネ ガ テ ィ ブ に働 くこ とが 知 られ て お り22), これ ら を強 制 発 現 させ る とArm32)や β カテ ニ ン33)の蓄 積 が 生 じ,Xenopus胚 の 場 合 は2次 体 軸 が 生 じ る22,33)。

VI. APCは βカテニンの分解装置としての機能をもってい

る

家 族 性 大 腸 ポ リ ポ ー シ ス の 病 因 遺 伝 子 と し て 発 見 さ れ た癌 抑 制 遺 伝 子APCは300Kの 巨 大 な 蛋 白 質 をコー ドす る 。APCは 図8に 示 す よ うに 種 々 の ドメ イ ンを も っ て お り,多 様 な 活 性 を発 揮 し て い る 。 大 腸 癌 に お い て は20ア ミノ酸 く り返 しか らC末 端 側 が 欠 損 して い る 場 合 が 多 い。 一 方,図8に 示 す よう にArm/β カ テニ ン は約100Kの 蛋 白 質 で,N末 端 部 分 で α カ テ ニ ン と, 中央 部 のArmく り返 し構 造(12回 の く り返 しが あ る) で カ ドヘ リ ン と も結 合 す る こ とが 知 られ て お り,カ ド ヘ リンに よる細 胞 間 接 着 に必 須 な因 子 で ある13)。1992年 Polakisら34),Vogelsteinら35)が β カ テニ ン とAPCと の結 合 を報 告 した 。 続 い てAPC変 異 を もつ 大 腸 癌 細 胞 株SW480で は正 常 細 胞 に比 べ 細 胞 質 内 にRカ テニ ンが 高 濃 度 に 蓄 積 して い るが,そ こに野 生 型APCを 発 現 さ せ る と β カ テ ニ ン レベ ル が 著 し く低 下 す る こ とが 明 ら か とな った36)。一 方,Kimelman,Moonの グル ー プは, Arm/β カ テ ニ ン のN末 端 部 分 に はZW3/GSK3β キナ ーゼ の リ ン酸 化 の コ ン セ ン サ ス 配 列 が あ り,こ の 部 分 のSer/ ThrをAlaに 変 化 さ せ て リン 酸 化 を受 け な い よ う な 変 異 β カ テ ニ ン を つ くる と,そ れ は Xenopus胚 で の安 定 性 が 高 く な り,2次 体 軸 誘 導 活 性 が 強 く な る と 報 告 し て い る33)。 Peifer37)と 筆 者 も32),N末 端 を欠 くArmで 同 様 の こ とを報 告 し た 。 ま たRubinfeldら38) は 高 濃 度 β カ テ ニ ン存 在 下, APC-β カ テ ニ ン とGSK3β (野 生 型 の み)は 複 合 体 を 形 成 す る こ と,APC中 央 部 の 20ア ミ ノ酸 く り返 し部 がGSK3β に よ り リ ン酸 化 を 受 け る と そ こ に β カ テ ニ ンが 結 合 で き る よ う に な る こ と を 発 見 し た 。 これ ら の 事 実 を総 合 す る と図8に 示 す よ うな 分 子 機 序 が 想 定 で き る 。 まず 細 胞 内 β カ テ ニ ン量 が 上 昇 す る と何 らか の 機 構 でGSK3がAPCに 結 合 し, 20ア ミ ノ酸 く り返 し を リ ン酸 化 す る 。 β カ テ ニ ン は第 1の 結 合 部 位 で す で にAPCと 結 合 して い る が,さ らに 20ア ミノ酸 くり返 し部 分 で もAPCと 相 互 作 用 す る よ う に な り,そ の 結 果 β カ テ ニ ンのN末 端 部 分 がGSK3β に よ り リ ン酸 化 さ れ る(GSK3β が 直 接 β カ テニ ン を リ ン酸 化 す る と の説 に は異 論 もあ る)。 リ ン酸 化 を受 けた β カ テ ニ ン は不 安 定 化 し,速 や か に分 解 さ れ る。APC とGSK3β とが 直 接 結 合 してい るか 否 か は明 らかで な く, また ド ミナ ン トネ ガ テ ィブ なGSK3β の作 用 機 序 も説 明 で きな い が 興 味 深 い モ デ ル で あ る 。 β カ テ ニ ンの 分 解 に は プ ロ テ オ ソ ー ム 系 が 働 い て い る 可 能 性 を 指 摘 す る 報 告 も あ る 。 ま たMatsumine, Akiyamaら はAPCとDLG(discs large)と の結 合 を 報 告 して お り,DLGとWg経 路 と の 関 連 も存 在 す るの か も しれ な い39)。 VII. 核 内 で βカ テ ニ ン と 相 互 作 用 す る 転 写 因 子Lef-1/ XTcf-3 Wg/Wntシ グ ナ ル 伝 達 の 結 果,細 胞 質 内 のArm/β カ テ ニ ンが 蓄 積 す る と そ の 一 部 は核 に 移 行 し,そ こで 図8 β カ テ ニ ン-GSK3-APCの 相 互 作 用

APC蛋 白質 と β カ テ ニ ン の 構 造 を模 式 的 に示 した 。GSK3(glycogen synthase kinase 3)はAPC お よ び β カ テ ニ ン の リン酸 化 を介 して β カ テ ニ ンの 細 胞 質 内 での レベ ル を負 に調 節 して い る。3 者 の相 対 的 位 置 関 係 は あ くま で想 像 上 の もの で あ る 。

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Wingless/Wnt蛋 白 質 の シ グ ナル 伝 達 機 構 29 作 用 す る と考 え られ る 。 Funayamaら は β カ テ ニ ン お よ び そ の 変 異 体 を Xenopus胚 で 発 現 させ,2次 体 軸 を誘 導 す る に はArm く り返 し部 分 で 十 分 で あ り,そ れ は核 に 局 在 す る こ と を報 告 し た23)。Behrensら24),Molenaarら40)は 酵 母 two-hybrid系 で β カ テ ニ ン と結 合 す る蛋 白 質 をス ク リ ー ニ ング し,そ れ ぞれ 転 写 因 子 マ ウスLef-1(lymphoid-enhacer-binding factor-1)と そ のXenopus相 同 体

XTcf-3(T cell-specific transcription factor-3)を 得 た。 こ の フ ァ ミ リー の 転 写 因 子 は最 初 リ ン パ 球 で 発 見 さ れ た た め こ の名 が あ る が,の ち に マ ウ ス の 発 生 過 程 で 種 々 の組 織 で発 現 して い る こ とが 判 明 した 。 図9に

示 す よ う に,こ の転 写 因 子 群 はN末 端 か ら β カ テ ニ ン 結 合 部 位(βBD),contex dependent activation domain (CAD),こ の フ ァ ミ リー を 特 徴 づ け るHMG

(high mobility group)ボ ッ クス か ら な るDNA結 合 領 域,そ れ に 続 く核 移 行 シ グ ナ ル(NLS)か ら な り, DNA折 り曲 げ 活 性 を もって いる。Tcf-1はT細 胞 受 容 体 α(TcRα)の エ ンハ ン サ ー 部 分 に結 合 し,そ のDNA 折 り曲 げ 活 性 に よ り離 れ た 部 位 に 結 合 し て い る複 数 の 転 写 因 子 の 相 互 作 用 を促 進 し転 写 活 性 化 を 行 な っ て い る41)。図9に 要 約 し た よ う に,XTcf-3のN末 端 領 域 が β カ テ ニ ン のArmく り返 し と結 合 す る。 結 合 した β カ テ ニ ン はXTcf-3のNLSの 作 用 に よ り核 へ と移 行 す る。XTcf-3お よ び β カテ ニ ン とXTcf-3の 複 合 体 は と も にHMGボ ッ ク ス に よ り認 識 され るTcRα エ ンハ ン サ ー モ チ ー フ に 結 合 す る こ とが で き る が,転 写 活 性 化 能 を もつ の は β カ テニ ン-XTcf-3複 合 体 だ けで あ る。 さ ら に β カ テ ニ ン結 合 に よ りLef-1のDNA折 り曲 げ 活 性 が 低 下 す る こ と が 示 さ れ て い る24)。Lef-1に は Xenopus胚 に お い て2次 体 軸 誘 導 活 性 が あ る 。 ま た β カ テ ニ ン結 合 部 位 を 欠 くXTcf-3やHMGボ ッ クス を 欠 くLef-1は と も に,β カ テ ニ ン に よ る2次 軸 誘 導 を 強 く阻 害 す る活 性 を も っ て い る。 こ の 事 実 は,こ れ ら の転 写 因 子 がXenoPus胚 で の β カ テニ ンの 作 用 を直 接 仲 介 して い る こ とを 強 く示 唆 す る も の で あ る 。 ハ エ のLef-1/XTcf-3相 同 体 の ク ロ ー ニ ン グ が 待 た れ る。XenopusでWnt-1の 標 的 と し て 知 られ て い る Goosecoid42)や ハ エ でWgの 標 的 遺 伝 子 と し て知 られ て い るEngrailedな どの エ ンハ ンサー 領 域 にお い て,実 際 に この フ ァ ミ リー の 転 写 因 子 がArm/β カテ ニ ン依 存 性 に 転 写 制 御 を行 な っ て い る か 否 か は 興 味 深 い 。 ま た 他 の フ ァ ミ リー の転 写 因 子 の な か に もArm/β カ テニ ン と相 互 作 用 す る もの が 発 見 され る で は ない か と考 え る。 お わ りに 以 上 本 稿 で は,ハ エ の 分 節 変 異 の 解 析 を 基 礎 に提 唱 さ れ,そ の後Xenopus胚 お よび 培 養 細 胞 で検 証 さ れ て きたWg/Wntシ グ ナ ル 伝 達 経 路 に つ き,お も に そ の 生 化 学 的 側 面 を 概 説 し た 。 今 後 と も こ の 経 路 の 新 しい 構 成 員 が,遺 伝 学 的 ・生 化 学 分 子 生 物 学 的 手 法 を用 い て 発 見 さ れ て い く こ と は明 らか で あ る。 発 生 に お け る細 胞 間 相 互 作 用 を に な う シグ ナ ル 分 子Wntは き わ め て多 様 な生 物 活 性 を に な っ て い る。 し たが っ て,あ る生 物 の,あ る特 性 のWntが 特 定 の 発 生 現 象 の なか で 特 定 の 標 的 細 胞 に働 く場 合,Wnt全 体 に 一 般 化 で き る 現 象(た と え ば受 容 体 の 基 本 構 造)と 特 定 の 脈 絡 で の み 生 じ る 現 象(た と え ばEnの 活 性 化)が あ る こ と は 当 然 で あ り,ま た そ れ こそ が 個 々 のWntの 特 異 性 の 基 礎 と な っ て い る 点 に 注 意 し て い た だ き た い 。 い ず れ に せ よ,当 分Wnt分 子 は分 子 発 生 学 のkey分 子 とな りつづ け る の は確 実 で あ る。 自 ら癌 遺 伝 子 と してWnt-1を 発 見 して以 来,多 様 な 実験 系 を大 胆 に導 入 し発 生 生 物 学 の分 野 にWntを 根 づ か せ,そ して 常 に その 図9 β カ テ ニ ン に 結 合 す る 転 写 因 子XTcf-3の 構 造 と 機 能 図 に 示 す よ う な2種 類 の 変 異 体 を 作 製 しXTcf-3の 各 種 機 能 ド メ イ ン を 決 定 した 。 βBD:β カ テ ニ ン 結 合 部 位,CAD:contex dependent activation domain,HMG:high mobility group,NLS:nuclear localization signal(核 移 行 シ グ ナ ル)。N.T.:デ ー タ な し 。

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30 蛋 白質 核 酸 酵 素 Vol.42 No.1 (1997) 新 局 面 を 開拓 して き た ス タ ン フ ォ ー ド大 学 発 生 生 物 学 部 門Roel Nusse博 士 に敬 意 を 表 した い 。 ま た筆 者 がNusse研 究 室 でWnt 研 究 に参 画 で きる機 会 を与 え て くれ たHoward Hughes医 学 研 究 所 に感 謝 した い 。 文 献 1) Nusse,R.,Varmus,H.E.:Cell,31,99-109 (1992) 2) Rijsewijk,F.,Schuermann,M.,Wagenaar,E., Parren,P.,Wiegel,D.,Nusse,R.:Cell,50,649-657 (1987) 3) Nusse,R.,Varmus,H.E.:Cell,69,1073-1087 (1992) 4) Peifer,M.,Bejsovec,A.:Trends 249 (1992) 5) Siegfried,E.,Perrimon,N.:BioEssays,16,395-404 (1994) 6) 414 (1994) 7) 高 田 慎 治:蛋 白 質 核 酸 酵 素,40,2162-2174 (1995) 8) Moon,R.T.:BioEssays,15,91-97 (1993) 9) Perrimon,N.:Cell,86,513-516 (1996) 10) Bhanot,P.,Brink,M.,Harryman Samos,C., Hsieh,J.-C.,Wang,Y.,Macke,J.P.,Andrew,D., Nathans,J.,Nusse,R.:Nature,382,225-230 (1996) 11) Klingensmith,J.,Nusse,R.,Perrimon,N.:Genes Dev.,8,118-130 (1994) 12) Siegfried,E.,Chou,T.,Perrimon,N.:Cell,71, 1167-1179 (1992)

13) Piefer,M.:Trends Cell Biol.,5,224-229 (1995) 14) chi,M.:Dev.Biol.,165,716-726 (1994) 15) Axelrod,J.D.,Matsuno,K.,Artavanis-Tsakonas, S.,Perrimon,N.:Science,271,1826-1832 (1996) 16) Noordermeer,J.,Klingensmith J.,Perrimon,N., Nusse,R.:Nature,367,80-83 (1994) 17) Siegfried,E.,Wilder,E.,Perrimon,N.:Nature, 367,76-80 (1994) 18) Peifer,M.,Sweeton,D.,Casey,M.,Wieschaus, E.:Development(Camb.),120,369-380 (1994) 19) van Leeuwen,F.,Harryman Samos,C.,Nusse, R.:Nature,368,342-344 (1994) 20) Yanagawa,S.-I.,van Leeuwen,F.,Wodarz,A., Kingensmith,J.,Nusse,R.:Genes 1097 (1995) 21) Sokol,S.Y.,Klingensmith,J.,Perrimon,N.,Itoh, K.:Development(Camb.),121,1637-1647 (1995) 22) He,X.,Saint-Jeannet,J.-P.,Woodgett,J.R., Varmus,H.E.,Dawid,I.B.:Nature,374,617-622 (1995) 23) biner,B.M.:J.Cell Biol.,128,959-968 (1995) 24) Behrens,J.,von Kries,J.P.,Kuhl,M.,Bruhn,L., Wedlich,D.,Grosschedl,R.,Birchmeier,W.: Nature,382,638-642 (1996) 25) Vinson,C.R.,Conover,S.,Adler,P.N.:Nature, 338,263-264 (1989) 26) opment(Camb.),121,4095-4102 (1995) 27) Wang,Y.,Macke,J.P.,Abella,B.S.,Andreasson, K.,Worley,P.,Gilbert,D.J.,Copeland,N.G., Jenkins,N.A.,Nathans,J.:J.Biol.Chem.,271, 4468-4476 (1996) 28) Gomperts,S.N.:Cell,84,659-662 (1996) 29) Sawa,H.,Lobel,L.,Horvitz,H.:Genes Dev.,10, 2189-2197 (1996) 30) Welsh,G.I.,Wilson,C.,Proud,C.G.:Trends Cell Biol.,6,274-279 (1996) 31) Cook,D.,Fry,M.J.,Hughes,K.,Sumathipala,R., Woodgett,J.R.,Dale,T.C.:EMBO 4536 (1996) 32) Yanagawa,S.,Haruna,T.,Lee,J.-S.,Oda,H., Uemura,T.,Takeichi,M.,Ishimoto,A.:J.Biol. Chem.,印 刷 中 33) Yost,C.,Torres,M.,Miller,J.R.,Huang,E., Kimelman,D.,Moon,R.T.:Genes 1454 (1996) 34) Rubinfeld,B.,Albert,I.,Porfiri,E.,Fiol,C., 1026 (1996) 35) Su,L.-K.,Vogelstein,B.,Kinzler,K.W.:Science, 262,1734-1737 (1993) 36) Munemitsu,S.,Albert,I.,Souza,B.,Rubinfeld,B., 3050 (1995) 37) Orsulic,S.,Peifer,M.:J.Cell 1300 (1996) 38) Rubinfeld,B.,Albert,I,Porfiri,E.,Fiol,C., 1026 (1996) 39) Matsumine,A.,Ogai,A.,Senda,T.,Okumura,N., Satoh,K.,Beag,G.-H.,Kawahara,T.,Kobayashi, S.,Okada,M.,Toyoshima,K.,Akiyama,T.: Science,272,1020-1023 (1996) 40) Molenaar,M.,van de Wetering.M.,Oosterwegel, M.,Peterson-Maduro,J.,Godsave,S.,Korinek, V.,Roose,J.,Destree,O.,Clevers,H.:Cell,86, 391-399 (1996) 41) Giese,K.,Kingsley,C.,Kirshner,J.R.,Grosschedl, R.:Genes Dev.,9,995-1008 (1995) 42) Watabe,T.,Kim,S.,Candia,A.,Rothbacher,U., Hashimoto,C.,Inoue,K.,Cho,K.W.Y.:Genes Dev.,9,3038-3050 (1995)

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