九州大学学術情報リポジトリ Kyushu University Institutional Repository リアルタイム PCR : ソノゲンリトトクチョウ小島, 夫美子九州大学医学部保健学科検査技術科学専攻大阪大学大学院医学系研究科保健学専攻岩谷, 良則大阪大学大学院医学系研究科保健学

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九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

リアルタイムPCR : ソノゲンリトトクチョウ

小島, 夫美子

九州大学医学部保健学科検査技術科学専攻 | 大阪大学大学院医学系研究科保健学専攻

岩谷, 良則

大阪大学大学院医学系研究科保健学専攻

藤本, 秀士

九州大学医学部保健学科検査技術科学専攻

https://doi.org/10.15017/54

出版情報：九州大学医学部保健学科紀要. 2, pp.95-102, 2003-09. School of Health Sciences, Faculty of Medicine, Kyushu University

バージョン：

権利関係：

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─ 94 ─ ─ 95 ─

リアルタイムPCR

─ その原理と特徴 ─

小島夫美子

^１，^２

、岩谷良則

^２

、藤本秀士

^１

１．九州大学医学部保健学科検査技術科学専攻２．大阪大学大学院医学系研究科保健学専攻

Real-time PCR

Fumiko Kojima ， Yoshinori Iwatani ， Shuji Fujimoto

key word: real-time PCR, quantitative PCR, melting curve analysis

１．はじめに

ポリメラーゼ連鎖反応^１）（Polymerase Chain

Reaction：PCR）は、分子生物学、医学をはじめ、

科学のあらゆる分野において大変重要な技術である。特定の遺伝子の配列を元に、その遺伝子を数時間内に何十億にも複製する。PCRの開発によって、微量なDNAを増幅・検出できるようになり、

遺伝子の研究は飛躍的に向上した。PCRを用いる目的遺伝子の検出は感度の点で非常に優れ、遺伝子解析の研究や臨床検査などに幅広く用いられている。近年、ヒトを始め、動物、植物、微生物のゲノム計画によってゲノム解析が急速に進んでいる。そして得られた遺伝情報をもとにした機能解析が、様々な領域で盛んに行われている。医学領域では、ゲノム情報にもとづく疾病の遺伝子診断、分子標的治療が可能になりつつあり、様々な疾患で定量的遺伝子診断が試みられている。そして、これまでのハイブリダイゼーション法^２）や競合的PCR^３）などの手技的に煩雑で労力の必要な方法に代わる、より正確で簡便・迅速な遺伝子定量法が求められるようになった^４）。この様な背景

のなかで、real-time（リアルタイム）PCRが登場し、

今では定量的遺伝子診断の一翼を担う重要な手法となった。

従来のPCRは、サーマルサイクラー（プログラムにより加熱と冷却を周期的に行いDNAを増幅するPCR装置）で目的DNAを増幅した後、その増幅産物の解析にはアガロースゲルあるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色したものを紫外線照射下で検出するという手順で行う^１，^３）。一方、リアルタイムPCRでは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した機器を用いてPCRによるDNAの増幅と検出をひとつのチューブ内で同時に行う。

DNAの標識には蛍光色素を用い、PCR反応中に経時的に蛍光強度を測定して、増幅産物の生成量をリアルタイムで検出し、解析する^５，^６，^７，^８，^９）。反応開始から終了までリアルタイムに反応をモニタリングし、増幅産物の生成の過程を連続してみることができるため、得られた増幅曲線から、微量な検体材料でも正確な定量分析を行うことが可能である。また煩雑なゲル電気泳動を行う必要がな

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リアルタイムPCR ─その原理と特徴─

─ 96 ─ 小島夫美子，岩谷良則，藤本秀士

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いため、解析時間の大幅な短縮が可能で、迅速・

簡便であるなど多くの利点を有している（表１参照）。本法は、白血病などの血液疾患における病原遺伝子発現の定量¹⁰^）、あるいは臨床検体中の細菌・ウイルスなど病原微生物の定量による感染症の遺伝子診断や治療モニタリングに利用され始めている¹¹^）。本論文では、ここ数年間で医学領域に急速に浸透しつつあるリアルタイムPCRについて、その基本原理を解説し、遺伝子の定量方法について解説する。

２. リアルタイムPCRの基本的な仕組み リアルタイムPCRシステムは、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計が一体化したユニットと、

増幅産物生成過程のモニタリングおよび得られたデータの処理を行うための制御用コンピュータで構成される。ABI PRISMシリーズ（ABI社）、

Light Cycler（Roch社）、Smart Cycler（Cepheid社）、

iCycler iQ（BioRad社）など各社が開発・販売しており、それぞれ規格や計測方法、解析ソフトウェアの操作性などが異なっているが、基本原理は同じである。

１）PCRによる遺伝子の増幅

PCRは、２本鎖のDNAを鋳型として、目的とする遺伝子領域をDNAポリメラーゼによって大量に増幅する。PCRは通常、３つのステップ（熱変性、アニーリング、伸長反応）から成り立っている（図１参照）。

ステップ１．熱変性：まず最初に、加熱（95℃）

によって、鋳型となる２本鎖DNAの二重らせ

んをほどいて１本鎖（相補鎖）DNAの状態とする。

ステップ２．アニーリング：次に１本鎖DNAとプライマー（既知の遺伝子塩基配列をもとに作成した、鋳型DNAに相補的塩基配列をもつオリゴヌクレオチド）を共存させて温度を下げていくと、プライマーが目的とする遺伝子配列とハイブリダイズする。通常、対になる２種類のプライマーを使用して、それぞれの相補鎖鋳型 DNAとハイブリダイズさせる。

ステップ３．伸長反応：耐熱性DNAポリメラーゼが、DNAの基質となる４種類のデオキシヌクレオチドリン酸を使用して、１本鎖鋳型 DNAとハイブリダイズしたプライマーの伸長を行う。こうして新たなDNA鎖が合成され、

２重らせんDNAを再生する。

この３ステップにより、対になるプライマーで囲まれた範囲のDNA領域が複製され、２倍になる。このサイクルを繰り返すことより、目的領域のDNA断片は指数的（n回のサイクルで２^n-1倍）

に増加すると計算される。サーマルサイクラーは、正確に温度管理を行った上で、このサイクルを連続して繰り返す。

２）増幅産物の検出

リアルタイムPCRでは、PCR増幅産物のモニターは蛍光色素を利用して分光蛍光光度計で行う

12）。DNAに結合する蛍光物質あるいは蛍光標識プローブを励起光で照射し、発する蛍光の強度を測定することにより、反応中の増幅産物の生成過程および生成量をモニタリングする。DNAの蛍光 表１ Real-time PCRの特徴

・PCRを用いるので微量な検体でも検査・解析が可能である。

・蛍光色素標識でPCR産物を検出するので電気泳動が不要である。

・増幅と検出を同時に行うため、汚染が少なく、かつ簡便である。

・増幅量をサイクル毎にリアルタイムにモニターするので、反応途中でも増幅の確認が出来て迅速性に優れる。

・増幅曲線から反応速度理論に基づいた正確な定量解析ができる。

・コンピュータで制御されるので、データの処理・管理が簡単である。

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標識にはいくつかの方法が考案されているが、ここでは現在利用されている代表的な３つの方法について紹介する（図２参照）。

Ａ．インターカレーター法

２本鎖DNAに特異的に結合して蛍光を発する色素（インターカレーター）を用いる方法で、SYBR GreenⅠ¹³^）が最もよく利用されている。

SYBR GreenⅠは、２本鎖DNAに特異的に結合し、

この結合によって蛍光強度が非常に大きくなる。

この蛍光強度をPCRサイクル毎に検出することにより、DNAポリメラーゼによって合成される増幅産物の生成量をモニターする（図２Ａ）。しか

し、SYBR GreenⅠを含めてインターカレーター

は塩基配列などに対する特異性はなく、２本鎖 DNAであればすべて検出してしまうために目的 DNAの増幅であるかどうかの確認を行う必要がある。この確認は、PCR終了後に増幅したDNAの融解温度を測定することによって可能である（後

述）。

Ｂ．TaqManプローブ法

TaqManプローブは、PCR産物の配列内にハイブリダイズするような相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドで、その両端を別々な蛍光色素（5'末端をレポーター色素、3'末端をクエンチャー色素）で標識したプローブである^５，^６）。通

常、TaqManプローブの２種類の蛍光色素は、互

いの物理的距離が近いために蛍光共鳴により消光（クエンチング）状態にある。このプローブをプライマーとともに反応系に加えてPCRを行うと、プローブはアニーリングのステップでターゲットDNAに特異的にハイブリダイズする。そして伸長反応時にDNAポリメラーゼの持つ5'→3' エキソヌクレアーゼ活性によって鋳型に結合し

たTaqManプローブが、5'末端から分解され、レ

ポーター蛍光色素がプローブから遊離してクエンチャー色素による抑制から解放されて蛍光を発すステップ3

ステップ2

2本鎖DNA 5'

5' 3'

3'

5'

1本鎖DNA 5'

3'

3' 1本鎖DNA

3' 5'

5' 2本鎖DNA 2本鎖DNA

3'

→ 熱変性により、1本鎖DNAに解離

プライマー

｛

のアニーリング 5'

5' 3'

3' サ

イクルのくり返し

熱変性

アニーリング

伸長反応ステップ1

合成された新しいcDNA DNAポリメラーゼによる伸長反応

鋳型DNA

図１ PCR原理

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─ 99 ─ る^５，^６）（図２Ｂ）。これによって発する蛍光をサイ

クル毎にモニターし、その蛍光強度の変化を解析することによってターゲットの増幅産物の定量を行う。

Ｃ．Molecular Beacon法

Molecular Beaconは、ターゲットDNAに相補

的な配列を持つ１本鎖DNAのループとその配列を挟むようにデザインされた相補配列（アーム）

がアニールした２本鎖のステムからなるヘアピン型２次構造のオリゴヌクレオチドプローブである

14，15）。このプローブは両末端を蛍光色素（5'末端をレポーター色素、3'末端をクエンチャー色素）

で修飾してあり、遊離状態ではステム構造によっ

鋳型一本鎖DNA

5' 3'

Forward primer

伸長されて出来た二本鎖DNA

5' 3'

蛍光シグナル DNAポリメラーゼ

Q R

Q Molecular Beacon Molecular Beacon法

鋳型一本鎖DNA

5' 3'

R

蛍光シグナル鋳型一本鎖DNA

5' 3'

Forward primer

伸長されたDNA

鋳型一本鎖DNA

R

Q

5' 3'

蛍光シグナル DNAポリメラーゼ TaqManプローブ法

R TaqManプローブ Q

SYBR Green I インターカレーター法

図２蛍光標識法

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てレポーターとクエンチャーが近接しているために、レポーターの蛍光放出はエネルギー転移により抑制されている。しかし、ターゲットDNA と相補的な領域で特異的にハイブリダイズすると、ヘアピン構造がとれず、両蛍光色素の間隔が広がるために抑制が解放され蛍光を発する¹⁴^）（図２Ｃ）。一方、ハイブリダイズしなかったプローブはヘアピン構造を保持しているため蛍光を発しない。この蛍光強度の変化を解析することによりターゲットの増幅産物の定量を行う。

３．リアルタイムPCRにおける定量の原理 PCRによる定量方法について、我々が行った実際例を示して解説する。

16S rRNA遺伝子は、すべての細菌に存在する。

この遺伝子には、進化によって菌種間で異なる部分と、ほとんどの菌種に共通する部分（保存領域）がある。この保存領域の塩基配列をもとにプライマー対を作成した。大腸菌DNAを鋳型として用いた上記プライマーによるPCR産物を吸光度によって定量し、その希釈系列をスタンダードとして用いて増幅産物の定量を行った。リアルタ

図３ PCR産物の増幅曲線（A）と標準曲線（B）

A

B

縦軸に蛍光強度、横軸にサイクル数をプロットして描いた図。A〜Dは段階希釈を行った既知量の DNAである。A:N ×10⁸、B:N ×10⁷、C:N ×10⁶、D:N ×10⁵。鋳型 DNAが多いほど立ち上がりが早い。

縦軸に DNA量（log）、横軸にサイクル数（ Ct値）をプロットして描いた図（標準曲線）。未知検体の Ct値を当てはめると DNA量が定量できる。

A B C D

A

B

C

D

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─ 101 ─ イムPCRは、インターカレーター法（SYBR Green

Ⅰ）を用いた。Smart Cycler（Cepheid社）にて、

熱変性95℃15秒、アニーリング50℃30秒、伸長反応72℃30秒を45サイクル行った。蛍光強度は、

各サイクルで、伸張反応時に測定した。リアルタイムPCRの計測データはすべて装置に付属のコンピュータのハードディスクに記録され、解析は付属のソフトウェアで行う。図３ＡにリアルタイムPCRの増幅曲線（縦軸が蛍光強度、横軸がPCR サイクル数）を示す。理論上は、PCR産物は反応

初期からサイクル数の増加により指数的に増加し続けることになるが、実際にはＳ字状の曲線を示す。立ち上がりの時間があり、その後、指数的な増加が起こる。そして一定時間（サイクル）後に産物は増幅されなくなり、PCR産物量はプラトーに達する。鋳型となるDNA含有率が高い場合は、

低い場合に比べて、より早いサイクルで対数増幅が起こり、プラトーに達するのも早い。つまり、

PCR産物が指数的に増加する対数増幅期のサイクルは、試料中の目的遺伝子の量（コピー数）に

A

B

縦軸に蛍光強度、横軸に温度をプロットして描いた図。PCR終了後に温度をゆっくり上昇させると、それに伴って２本鎖DNAが解離し、取り込まれていたSYBR Green I が放出されて蛍光強度が低下する。この蛍光強度は、ある時点で急激に低下する。その時の温度がTmである。

縦軸に蛍光強度の一次微分の負の値（-dF/dT）、横軸に温度をプロットして描いた図。値が一番大きくなるときの温度がTmとなる。産物が単一の場合、ピークは単一である。

図４ PCR産物の融解曲線

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比例し、そのサイクルを精密に同定すれば目的遺伝子の初期濃度の正確な値が得られる。リアルタイムPCRによる定量法は、この原理を利用している。段階希釈した既知量のDNAをスタンダードサンプルとしてPCRを行い、各サイクル毎に蛍光強度を測定して、そのデータを基に増幅が指数関数的に起こる領域で、一定の増幅産物量になるサイクル数（threshold cycle : Ct値）を求める。そしてCt値を横軸に、鋳型のDNA量を縦軸にプロットし、標準曲線を作成する（図３Ｂ）。調べたい検体についても同条件下でPCRを行い、Ct値を求めれば、標準曲線から、その検体中のDNA量を求めることができる。

４．PCR産物の融解曲線解析

TaqManプローブやMolecular Beaconなどの蛍光プローブは比較的高価なため、SYBR GreenⅠが遺伝子定量によく利用されている。しかし、先にも述べたが、インターカレータ法は塩基配列などに対する特異性はなく、２本鎖DNAであればすべて検出してしまうために目的DNAの増幅であるかどうかの確認を行う必要がある。この確認は、PCR終了後に増幅したDNAの融解温度（Melting Temperature:Tm）を測定することによって可能である。PCR終了後に温度をゆっくり

（0.2℃/秒など）上昇させながら蛍光強度をモニターする。図４Ａにモニター曲線（融解曲線：

Melting Curve）を示す。温度上昇に伴って二本鎖

DNAが徐々に解離し、一本鎖DNAになる。二本鎖DNAに取り込まれていたSYBR Green Iが放出されて、蛍光強度が徐々に低下する。そして、ある時点（温度）に達すると蛍光強度が急激に低下する。この最大変化点が融点で、２本鎖DNAの50％が水素結合対を形成し、残り50％が解離している状態であると言われている¹⁶^）。その時の温度が Tmである。PCR産物のTmは、そのサイズや塩基配列（GC含量）によって異なる。それぞれの増幅産物に固有であり、このTmを調べれば、PCR 産物が目的のものかどうかを判別できる¹⁷^）。蛍光強度の負の一次微分値（-dF/dT）を温度に対してプロットしたグラフを書くとTmはピークとして

描かれる。図４Ｂに示すように増幅産物が１種類の場合は単一のピークとなる。

５．おわりに

リアルタイムPCRは迅速性、定量性に優れた方法であり、RT （Reverse Transcription）PCR（逆転写酵素を用いてtotal RNAやmRNAからcDNAを合成した後、目的のcDNA領域をPCRで増幅する方法）と組み合わせると、微量なRNAサンプルでも解析できるため、RNA解析においても欠かすことのできない方法である¹⁸^）。今後も医学分野を含めて様々な方面で活用されるに違いない。

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