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学位論文の内容の要旨
論文提出者氏名 RAJAPAKSHE MUDIYANSELAGE Anupama Rasadari Rajapakshe
論文審査担当者 主査 柴田 俊一
副査 三浦 雅彦、篠村 多摩之
論 文 題 目 Lysosome-associated membrane proteins (LAMPs) regulate intracellular positioning of mitochondria in MC3T3-E1 cells
(論文の内容の要旨) Introduction
The intracellular positioning of both lysosomes and mitochondria meets the requirements of degradation and energy supply, which are respectively the two major functions for cellular maintenance and is apparently affected by the nutrient status of the cells. However, the mechanism coordinating the positioning of the organelles has not been sufficiently elucidated.
Lysosome associated membrane proteins-1 and -2 (LAMP-1 and LAMP-2) are major protein components of the lysosomal membrane. They are considered to act as a barrier to protect the structural integrity of lysosomal membranes from the lytic luminal environment, by forming a glycocalyx. However, recent reports suggest that LAMPs probably perform a function beyond the stabilization of lysosomes.
Lysosomes are important in the bone-forming activity of osteoblasts. However, the roles of LAMPs in osteoblasts have not been elucidated. Thus this study focused in the role of LAMPs in the pre-osteoblastic cell line MC3T3-E1 and the osteocytic cell line MLO-Y4.
Materials and methods
Cell culture
The mouse pre-osteoblastic cell line (MC3T3-E1) and the mouse osteocyte-like cell line (MLO-Y4) were maintained in α-modified MEM, supplemented with either 10% fetal bovine serum or a combination of 5% fetal bovine serum and 5% newborn calf serum, respectively, 4 mM L-glutamine, L-penicillin (50 U/mL), and streptomycin (50 µg/mL), at 37℃ in a 5% CO2
atmosphere. MLO-Y4 cells were cultured on collagen-coated plates.
Antibodies
Rabbit polyclonal antibodies to LAMP-1 (ab24170, Abcam) and LAMP-2 (AP07767PU-N, Acris) were used for immunoblotting, and rat monoclonal antibodies to LAMP-1 (1D4B,
Developmental Studies Hybridoma Bank) and LAMP-2 (ABL93, Developmental Studies Hybridoma Bank) were used for immunocytochemistry. Rabbit polyclonal antibodies to α -tubulin (ab4074, Abcam), golgin A5, GOLGA5 (HPA000992, Sigma-Aldrich), and protein disulfide isomerase family A, member 3, PDIA3 (HPA003230, Sigma-Aldrich) were also used. To detect the α-subunit of NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase, ICDH, a rabbit monoclonal
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Immunoblotting
Cell lysates were treated with PNGaseF, separated by 10 % SDS-PAGE under reducing conditions, and blotted onto a polyvinylidenedifluoride membrane. The blots were then probed with primary antibodies, followed by the corresponding horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies. Immunoreactivity was detected by the ECL reaction.
Immunocytochemistry
MC3T3-E1 and MLO-Y4 cells were cultured in 12 well plates on glass coverslips, without or with a collagen coating, respectively. After an incubation with Hoechst 33342 for 30 min, the cells were fixed with 95% methanol for 5 min at room temperature, blocked with 1% bovine serum albumin in PBS, and stained with primary antibodies to LAMP-1 (1D4B, 1.6 µg/ml) or LAMP-2 (ABL93, 1.2 µg/ml) with ICDH (1:100), followed by secondary antibodies, Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit antibody (1:200) and Alexa Fluor 546-conjugated anti-rat antibody (1:200). For the staining with the antibodies to tubulin (1:200), GOLGA5 (1:1,000) or PDIA3 (1:600), the cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed with PBS-glycine, and permeabilized with 0.1% Triton X-100. An Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit antibody (1:100) or Alexa Fluor 555-conjugated anti-rabbit antibody (1:100) was used. Alexa Fluor 555-conjugated phalloidin was used at a 1:100 dilution. Images were acquired using a 100x oil-objective lens on a BZ9000 microscope (KEYENCE).
Manipulation of intracellular pH
Cells were incubated for 30 min at 37℃ in 130 mMKCl, 10 mMNaCl, 1 mM MgSO4, 10 mM
Na-MOPS adjusted to pH 6.5, 7.4 or 9.0, and 10 µg/ml nigericin. The changes in the intracellular pH were measured using the pH-sensitive fluorescent dye BCECF-AM.
siRNA treatment
Cells were seeded on glass coverslips in a 12 well plate for immunocytochemistry or in a 6 cm dish for immunoblotting, one day before transfection. Cells were transfected with either the All-Stars Negative Control siRNA (1027280, Qiagen) or the GeneSolutionsiRNA (1027416, Qiagen) targeting mouse LAMP-1 (SI01087667, SI01087681 and SI01087688) or LAMP-2 (SI02670535 and SI02690660) using the HiPerFect transfection reagent.
Image analysis using “Field Particle Vector Analysis”
The “Field Particle Vector Analysis” program was developed to evaluate the positions of mitochondria or lysosomes in each cell. The particles representing mitochondria (stained with the anti-ICDH antibody) or lysosomes (stained with the anti-LAMP-1 or LAMP-2 antibody) were identified within acquired images. Then, the shortest distance between the center of each particle and the nuclear boundary was computed, and the integrated area was plotted versus the distance at 1 µm intervals. The fraction of the area within 3 µm from the nucleus was defined as the “perinuclear localization” index in this study.
Statistical analysis
Differences between mean values were assessed by the unpaired two-sided Student’s t test or by one-way ANOVA followed by Dunnett’s post-hoc comparisons tests, using KaleidaGraph. The statistical significance was set at Pless than 0.01 or 0.05.
Results
Intracellular distributions of lysosomes and mitochondria in MC3T3-E1 cells
The staining with antibodies against NAD+-dependent isocitrate dehydrogenase (ICDH)
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observed near the nucleus, although they were not completely co-localized with each other. The localizations of LAMPs and ICDH in MC3T3-E1 cells found to be more diffuse than those in MLO-Y4 cells.
The bidirectional transport of lysosomes and mitochondria is similarly regulated under different conditions in MC3T3-E1 cells
The lysosomes and mitochondria were dispersed in the cytoplasm in the presence of nocodazole, whereas they accumulated in the perinuclear region after the treatment with cytochalasin D, suggesting that intracellular localization of both lysosomes and mitochondria in MC3T3-E1 cells depends on microtubules and actin filaments.
Intracellular acidification caused lysosome dispersion, whereas intracellular alkalization led to lysosome accumulation in the perinuclear region. However, the extent of dispersion varied among the cells. Image analysis with the developed software revealed that the fraction of lysosomes proximal to the nucleus (within 3 µm) decreased when the intracellular pH was lowered from 7.4 to 6.5, and increased when the intracellular pH was elevated to 9.0.
Partial fragmentation of mitochondria was observed in the presence of nigericin. The effect of acidification on the mitochondrial positioning was less pronounced than that on lysosomes. However, the alkalization also promoted the perinuclear accumulation of mitochondria.
Downregulation of LAMP-2 promotes the perinuclear localization of mitochondria in MC3T3-E1 cells
After the treatment with the LAMP-2 siRNA, the amount of LAMP-2 was appreciably decreased, without affecting LAMP-1 expression. As for the mitochondrial positioning, cells with intense perinuclear accumulation of ICDH were more frequently observed among the LAMP-2 siRNA-treated cells. Consistent with the previous study, the positions of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum did not seem to be affected by the LAMP-2 siRNA.
Downregulation of LAMP-1 or both LAMP-1 and LAMP-2 promotes the perinuclear positioning of mitochondria in MC3T3-E1 cells
The treatment with the LAMP-1 siRNA decreased the amount of LAMP-1, but not that of LAMP-2. The perinuclear localization of ICDH was strongly increased by the LAMP-1 siRNA, the number of cells in which the perinuclear localization of ICDH exceeded 80% was significantly increased. As in the treatment with the LAMP-2 siRNA, the locations of the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum were not affected. Furthermore, in the presence of both the LAMP-1 and LAMP-2 siRNAs, the perinuclear accumulation of ICDH was more clearly observed.
Downregulation of LAMPs does not affect the localization of mitochondria in MLO-Y4 cells
In MLO-Y4 cells the lysosomes and mitochondria were located closer to the nucleus, as compared to those in MC3T3-E1 cells. Mitochondria were also found within some dendrites. In contrast to the results obtained in MC3T3-E1 cells, the location of the mitochondria was not affected by either the LAMP-1 or LAMP-2 siRNA.
Discussion
The present study showed that downregulation of LAMPs affects the positioning of mitochondria in MC3T3-E1 cells. Since the LAMPs are not directly associated with mitochondria, obtained results suggest the emerging role of LAMPs in interorganellar coordination, raising the possibility that LAMPs affect the balance between the motors with opposite polarity within the transport machinery of other organelles.
A prominent feature of the LAMPs is their abundance, resulting in the generation of a glycocalyx. The lysosomal membranes are likely crowded with LAMPs, allowing the close contact
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and transient oligomerization of their luminal domains. LAMPs may thus stabilize the architecture or serve as a scaffold of the motor protein complex.
Lysosomes are suggested to act as reservoirs of dynein. Thus, the deficiency of LAMPs in MC3T3-E1 cells may indirectly alter the availability of dynein to mitochondria, promoting the minus-end directed transport of mitochondria. In this context, the effect of LAMPs should depend on the distribution of dynein among organelles, and would vary under different conditions. Thus, the lack of the effect of siRNA of LAMPs in MLO-Y4 cells can be explained by the intrinsic enrichment of dynein in most of the mitochondria.
Mitochondria likely play a role in supplying calcium phosphate for matrix vesicle formation. This study showed the accumulation of mitochondria after the osteoblastic differentiation of MC3T3-E1 cells suggesting that LAMPs may function to maintain mitochondrial isolation until osteoblastic differentiation. The results raise the possibility that LAMPs contribute to coordinate the positioning of mitochondria in MC3T3-E 1 cells. Further studies will be necessary to investigate the correlation between LAMPs and motor protein distribution.
(和文による要約)
Lysosome associated membrane proteins (以下 LAMPs と略記)はリソソーム膜に豊富に存在する糖タ
ンパク質である。発見当初LAMPs は、リソソーム膜を裏打ちする糖衣を形成し、リソソーム内部にある 種々の加水分解酵素からリソソーム膜を保護すると考えられていた。しかしLAMPs 欠損細胞においても リソソームの構造は形態的にも機能的にも保持されており、一方、LAMPs が欠損するとオートファジーや ファゴサイトーシスの過程が障害されることが明らかになった。LAMPs はリソソームとファゴソームの細 胞内での位置を制御することにより両者を効果的に融合させることが示唆されている。 骨芽細胞においてリソソームとミトコンドリアは骨基質の形成に関与する。そこで本研究では骨芽細胞 におけるLAMPs の役割を明らかにする目的で、前骨芽細胞由来細胞株 MC3T3-E1 および骨細胞由来細胞
株MLO-Y4 細胞を用いて、siRNA による LAMPs 発現低下によるミトコンドリアの細胞内での位置決め
への影響を調べた。オルガネラの細胞内での位置は微小管に沿った輸送に依存し、プラス方向（核近傍の 微小管重合中心に向かう方向）とマイナス方向（細胞膜に向かう方向）の輸送のバランスにより決定され る。そこで顕微鏡観察の画像から得られる細胞内でのオルガネラの位置の情報を定量的に評価するために、 個々の細胞におけるオルガネラの、核からの距離の分布を計算するプログラムを共同研究により開発した。 MC3T3-E1 細胞において LAMP-1, LAMP-2、およびその両者の siRNA による発現低下はミトコンドリ
アの核近傍への集積を増加させた。LAMP-1 の発現低下の効果の方が LAMP-2 低下の効果よりも顕著であ
った。これに対して、MC3T3-E1 細胞の場合よりもミトコンドリアが核近傍に多く、かつ樹状突起部分に も存在するMLO-Y4 細胞では、LAMP-1, LAMP-2 の siRNA によるミトコンドリアの位置の変化はみられ なかった。
本研究の結果はLAMPs がミトコンドリアの位置決めに関与することを示唆する初めての報告である。
リソソームはオートファジー、ファゴサイトーシスに必須のオルガネラであり、リソソーム膜に存在する LAMPs の役割についての新知見は、リソソームが関与する病態（リソソーム病、歯周病、神経変性疾患な ど）の理解につながることが期待される。
（１）
論文審査の要旨および担当者
報告番号 甲第 4782 号 RAJAPAKSHE MUDIYANSELAGE Anupama Rasadari Rajapakshe
論文審査担当者 主査 柴田 俊一 副査 三浦 雅彦、篠村 多摩之 （論文審査の要旨） リソソームとミトコンドリアはそれぞれ細胞の物質代謝、エネルギー代謝に重要な役割を果たす細胞内小器官 である。これらの細胞内小器官は微小管に沿って細胞内を輸送され、局在する位置は細胞の置かれた環境（栄養 源の獲得状況など）に依存する。しかし両者の細胞内での位置決めを統合的に制御するしくみの有無については 明らかになっていなかった。
Lysosome-associated membrane proteins (以下LAMPsと略記)はリソソーム膜に豊富に存在する糖タンパク
質である。LAMPs が欠損するとオートファジーやファゴサイトーシスの過程が障害される。LAMPs 欠損マウ スの胎児に由来する線維芽細胞(MEF)を用いた実験では、LAMPs はリソソームとファゴソームの微小管に沿っ たマイナス方向への輸送に必要であることが報告されている。マイナス方向への輸送によりリソソームとファゴ ソームは核近傍に集積して効率よく融合するため、LAMPs を欠損した細胞（MEF）におけるファゴサイトーシ スの障害は輸送への影響によって説明できる。 骨芽細胞においてリソソームとミトコンドリアは、基本的な役割に加えて骨基質の形成に特化した役割も担っ ている。そこでRajapakshe は LAMPs による骨芽細胞のミトコンドリアの細胞内局在の制御を検討する目的で 実験をおこなった。方法としては、前骨芽細胞由来細胞株MC3T3-E1 および骨細胞由来細胞株 MLO-Y4 に、
LAMP-1, LAMP-2 の siRNA を導入した。イムノブロットにより LAMP-1, LAMP-2 のタンパク質レベルでの低
下を確認した。細胞を固定、染色し、細胞内小器官の局在を観察し、画像解析によりLAMPs 発現低下によるミ
トコンドリアの細胞内での局在への影響を調べた。顕微鏡観察の画像から得られる細胞内でのオルガネラの位置 の情報を定量的に評価するために、個々の細胞におけるオルガネラの核からの距離の分布を計算するプログラム を共同研究により開発した。得られた結果の概要は以下の通りである。
1.MC3T3-E1 細胞において LAMP-1, LAMP-2、およびその両者の siRNA による発現低下はミトコンドリア の核近傍への集積を増加させた。
2. LAMP-1 の発現低下の効果の方が LAMP-2 低下の効果よりも顕著であった。
3. LO-Y4 細胞では MC3T3-E1 細胞の場合よりもミトコンドリアが核近傍に多く、かつ樹状突起部分にも存在 した。
4. MLO-Y4 細胞では、LAMP-1, LAMP-2 の siRNA によるミトコンドリアの位置の変化はみられなかった。
本研究の結果は従来リソソームとファゴソームの機能の制御に関与するとされていたLAMPs が、ミトコンド リアの位置決めにも関与することを示唆する初めての報告である。骨芽細胞のミトコンドリアは基質小胞へのリ ン酸化カルシウム供給に関与することが示唆されていることから、MC3T3-E1 細胞では LAMPs が分化誘導前の ミトコンドリアの核近傍への集積（小胞体からミトコンドリアへのカルシウムの受け渡しが増加する状況）を抑 制する可能性が考えられる。このようなLAMPs の役割についての新知見は細胞生物学の発展に大いに寄与する ものである。さらにリソソームはオートファジー、ファゴサイトーシスに必須のオルガネラであり、それが関与 する疾患も多数知られている（リソソーム病、歯周病、神経変性疾患など）。リソソーム膜に存在する LAMPs の新しい機能が明らかになったことは、これらの疾患に見られる病態の理解がさらに深まる事も期待され、今後 の歯学の基礎および臨床の発展に寄与するところも極めて大きいと考えられる。したがって、本論文は博士（歯 学）の学位を申請するに十分値するものと認められた。
