Microsoft PowerPoint - 原稿案(QS3D アプリ集表紙).pptx

(1)

QuantStudio

®

_3D

デジ

プ

集

デジタル

PCR system アプリケーション集

(2)

デジタル

PCRが可能にするアプリケーション

デジタルPCR は核酸の絶対定量を必要とするアプリケーションにおいて、リアルタイムPCR の限界を超える能力を提供する画期的な技術です。標準曲線を必要とせず、高感度・高精度な絶対定量を可能にする技術は、複数の遺伝子間における発現量の比較やレアバリアントの検出、微量な濃度差を比較するようなアプリケーションにおいて、威力を発揮する新しい解析手法として期待されています。 QuantStudio®_{3D デジタルPCR システムは、微細な20,000個のウェルを持つチップを利用した新しいデジタルPCRシステムです。1サンプルあたり} 20,000データポイントを提供する新しいフォーマットは、シンプルなワークフローを実現し、誰にでも利用できる新しい技術をお届けします。

(3)

1. 病原菌遺伝子の絶対定量

2. 標準物質の濃度測定

3. 体細胞変異の解析

4 CNV (Copy Number Variation)解析

スライド

#

アプリケーション

4. CNV (Copy Number Variation)解析

5. NGSライブラリー定量

6. 融合遺伝子の正確な定量

7. エクソソーム内の

miRNA発現定量

8. Pri-miRNA の絶対定量

9 デジタル

PCRによるキメリズム解析

9. デジタル

PCRによるキメリズム解析

10. デジタル

PCRによるハプロタイピング

11. User’s Voice 1 ・・・乳がんの腫瘍マーカーとして期待される血中の微量DNA変異

加々良尚文先生、大城智弥先生(大阪大学医学部乳腺・内分泌外科)

12. User’s Voice 2 ・・・血栓性血小板減少性紫斑病の確実な遺伝子診断を目指して

(4)

病原菌遺伝子の絶対定量

• 植物に感染する病原菌遺伝子の定量

• RNA抽出→逆転写→植物の内在性遺伝子+病原菌遺伝子の定量

デジタル

PCRとリアルタイムPCRの相関性は非常に高い

RNA抽出

逆転写

植物の内在性遺伝子+病原菌遺伝子の定量

• 薬剤処理濃度の異なるサンプルで比較

qPCRとdPCRの相関性

qPCRのデータ

■ リアルタイムPCR (コピー数/well ) 薬剤濃度病原菌内在性病原菌/内在性相対値高 4436.00 102200.00 0.04 1.00 中 3106.00 47350.00 0.07 1.51 低 11720 00 38350 00 0 31 7 04 FAM：病原菌 VIC：内部標準低 11720.00 38350.00 0.31 7.04 Control 31630.00 13420.00 2.36 54.30 薬剤濃度病原菌内在性病原菌/内在性相対値 ■ デジタルPCR (コピー数/chip) FAM：病原菌 VIC：内部標準薬剤濃度菌菌相高 246.15 21000.00 0.01 1.00 中 218.70 11121.00 0.02 1.68 低 797.40 9741.00 0.08 6.98 Control 1879.50 3003.00 0.63 53.40 薬剤濃度薬剤濃度薬剤濃度 Control 薬剤濃度高薬剤濃度中薬剤濃度低 Control 1

標準物質の濃度測定

•600塩基の核酸標準品(DNA)

 デジタル

PCRで標準物質の濃度を決定

 濃度よりコピー数を算出し、

10倍希釈系列を作成し、digital PCRで測定

600塩基の核酸標準品(DNA) •NのサイトがA,T,G,Cの4種類 • 増幅領域が99bpのAssayをデザイン ■ 希釈系列の測定 ■ 希釈系列の測定

10-7 Sample Dilution Copies/Rxn CI Copies/Rxn Copies/microliter CI Copies/microliter C2 1.00E-07 1.851 1.819 -- 1.883 1832 1801.0 -- 1864.0 C2 1.00E-08 0.1774 0.1715 -- 0.1836 175.7 169.8 -- 181.8 同位体稀釈質量分析法デジタルPCR (QS3D) 10-8 C2 1.00E-09 0.01911 0.01727 -- 0.02114 18.92 17.1 -- 20.93 ■ デジタルPCRによる最終結果と他の手法(同位体希釈質量分析法)との比較質量分析法デジタルPCR (QS3D)

certified value(ng/ul) copies/ul ng/ul

D001-600-A 12.4 1.71E+10 11.24 D001-600-C 11.9 1.82E+10 11.96 10-9 D001-600-G 12.4 1.89E+10 12.43 D001-600-T 13 2.27E+10 14.93 デタのご提供独立行政法人産業技術総合研究所計測標準研究部門藤井紳郎先生

*(copies/ul) is calculated by "(ng/ul) / MW ×6.02×1014

2 データのご提供: 独立行政法人産業技術総合研究所計測標準研究部門藤井紳一郎先生

(5)

体細胞変異の解析

 甲状腺がん、メラノーマサンプルの

BRAF V600E の検出

 デジタル

PCRは1%以下の体細胞変異を検出することが出来ます。

増幅反応液分配デジ

•TaqMan®SNP Genotyping Assaysを使用

正常検体

メラノーマ（FFPE）5.57%

デジタルPCR

各区画に分配されるため、

野生型の干渉が減少する

希少変異検出

_{甲状腺がん 0.72%}

甲状腺がん（細針吸引）0.19%

FA M リアルタイムPCR VIC

リアルタイムPCRでは、

10%以上

変異型が

存在しないと野生型の干渉により検出困難

3

CNV (Copy Number Variation)解析



dPCRは1.2倍未満の違いも識別が可能

 デジタル

PCRはリアルタイムPCRの限界を超え、1,2倍未満の違いも識別が可能



dPCRによるCNV解析

•Coriell Cell Repository から入手した代表的な9種類のゲノムパネルを使用 •CCL3L1 遺伝子のCNVをデジタルPCRで解析

(TaqMan® Copy Number Assayを利用

• フラグメント内にduplicationしている場合、制限酵素処理が必要制限酵素処理を行わないと、2コピーが1コピーのように分配される制限酵素処理 → 正しい分配が可能過少評価される → 正しい分配が可能 •CCL3L1コピー数を RnaseP コピー数で補正して算出 •コピー数が7回と8回の違いであっても、サンプルの間には明らかな統計学的有意差が認められる。 •各サンプルのCv値は2.55% 以下で、再現性が高いことが示された。 4

(6)

NGSライブラリー定量



dPCRは、検量線を使用することなく、信頼性の高い絶対定量を可能にします

• Ion Torrentの4種類のキットを用いて作製したライブラリーの定量を実施

(Ion DNA Fragment, Ion AmpliSeq™ Exome, Ion AmpliSeq™ Comprehensive Cancer Panel, Ion AmpliSeq™ Cancer HotSpot Panel Version2)

ズ

約

範

デジタルPCRによるNGSライブラリー定量のメリット

• Agilent 2100 Bioanalyzerによってサイズを測定 (⇒約100 ~ 700bpの範囲)

■ さまざまな種類のライブラリーをdPCRで定量エラバが小さく • デジタルPCRは、標準曲線やリファレンスサンプルが不要 ⇒ サンプル数が少ない場合に、検量線が不要なので、コスト削減が可能 • マニュアル作業を最小限に抑えた簡単なワークフロー • 完全にシールされた反応系でコンタミネーションのリスクを最小限に同じサンプルを反復エラーバーが小さく、信頼性の高いデータを得ることができます。 ■Ordering Info

4331182 TaqMan® Gene Expression Assays, Inventoried (250反応)から下表のTaqMan® Assay IDを選択してください。

•Ion Torrent、Illuminaのライブラリーに対応したAssayを提供

■dPCRとqPCRの相関図

TaqMan® Assay ID Ion Torrent™ Library Quantification Assay Ac04347676_a1

Illumina® Nextera Library Quantification Assay Ac04347696_a1

Illumina® TruSeq DNA/RNA Library Quantification Assay Ac04364396 a1

下表の q y を選択してください。

定

した濃度

(nM)

Illumina® TruSeq DNA/RNA Library Quantification Assay Ac04364396_a1

Illumina® TruSeq Small RNA Library Quantification Assay Ac04347697_a1

FP Probe RP ■TaqManR Assayのデザインの概略図定た濃度 dPCR で測定 5 Fwd Adapter Sequence of Interest Rev Adapter

FP RP qPCRで測定した濃度 (nM)

融合遺伝子の正確な定量

 デジタル

PCRは、検量線を用いずに絶対定量を行います。



RNA シーケンスとデジタルPCRで、一歩進んだ発現解析を。



RNA シーケンスでスクリーニングした融合遺伝子のデジタルPCR による絶対定量

リアルタイム

PCR

• 白血病細胞株K562由来のRNAを用い、RNA シーケンスにより融合遺伝子のBreakpoint を含む配列情報を取得 • 機能未知の融合遺伝子を含む各融合遺伝子間の発現量を比較

デジタル

PCR



RNA シケンスでスクリニングした融合遺伝子のデジタルPCR による絶対定量

リアルタイムPCRは、内在性コントロール(18S rRNA、灰色の増幅曲線)との比較エラーバーも小さく、精度の高い定量ができていることがわかる灰色の増幅曲線)との比較によって、発現量の強弱はある程度判別できるが、詳細は検量線を作成し、絶対定量をしないと分からない。 _{デジタルPCRは絶対値が得られるので、遺伝子間の比較が容易}_{デジタルPCRは絶対値が得られるので、遺伝子間の比較が容易} Gene A Gene B ■ 融合遺伝子を検出するTaqMan®_{Assay 設計例}

Break point 上に TaqMan®_{Assay を設計し、融合遺伝子を}

特異的に検出

6

Break point

(7)

エクソソーム内の

miRNA発現定量

 デジタル

PCRは、リファレンスサンプルや検量線を用いることなく、直接定量を行います。

 シンプルなワークフローで、エクソソーム中の

miRNAの絶対定量が可能

• 血清サンプル0.5μL中のmiRNAを解析 (miR320, let7a, miR143, miR145)

リアルタイム

PCR

デジタル

PCR

31 2

• 血清サンプル0.5μL中のmiRNAを解析 (miR320, let7a, miR143, miR145)

miR320 24.7 3.7 _1.8 31.2 miR320 let7a miR143 miR145 miRNA let7aを測定した QS3Dチップの解析画面

合成

RNAを用いて、検量線を作製することは、

非常に手間がかかり安定したデタを得ることが困難

デジタル

PCRは、検量線がなくても

iRNAの検出とコピ数の測定を同時に解析

非常に手間がかかり、安定したデータを得ることが困難。

miRNAの検出とコピー数の測定を同時に解析

7

Pri-miRNA の絶対定量

 どの

pri-miRNAがmature miRNAの発現上昇に寄与しているのか

 アルコール暴露による

pri-mmu-miR 9-1, 9-2, 9-3の発現変化

DNA Locus A Locus B pri-miRNA miR-9

mir-9-1 _pre-miRNA mir-9-2

miR-9 Mature miRNA •Pri-mir-9-2は他と比較して発現が高い。 •Pri-mir-9-1は長期のアルコール暴露で低下する。 •Pri-mir-9-2 はアルコール暴露により上昇する。 •Pri-mir-9-3 は短期のアルコール暴露には影響されないが長期暴露により上昇する。 8

(8)

デジタル

PCRによるキメリズム解析

 デジタル

PCRは高感度のキメリズム解析を可能とします

• レシピエント特異的遺伝子を検出するアッセイ(FAM)と β Globinアッセイ(VIC)のマルチプレックス

造血幹細胞移植後のキメリズム解析

• レシピエント特異的遺伝子を検出するアッセイ(FAM)と、β-Globinアッセイ(VIC)のマルチプレックス • レシピエント遺伝子コピー数/ 総コピー数でキメリズムの評価

レシピエント特異的配列

β Gl bi

FA M

β-Globin

(内部標準)

レシピエントサンプル

ドナーサンプル

VIC

再発例移植後192日

移植後日数 9 移植後日数

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3D

デジ

プ

集

デジタル

PCR system アプリケーション 集

デジタル

PCRが可能にするアプリケーション

1.

病原菌遺伝子の絶対定量

2.

標準物質の濃度測定

3.

体細胞変異の解析

4

CNV (Copy Number Variation)解析

スライド

#

アプリケーション

4.

CNV (Copy Number Variation)解析

5.

NGSライブラリー定量

6.

融合遺伝子の正確な定量

7.

エクソソーム内の

miRNA発現定量

8.

Pri-miRNA の絶対定量

9

デジタル

PCRによるキメリズム解析

9.

デジタル

PCRによるキメリズム解析

10.

デジタル

PCRによるハプロタイピング

11.

User’s Voice 1 ・・・乳がんの腫瘍マーカーとして期待される血中の微量DNA変異

12.

User’s Voice 2 ・・・血栓性血小板減少性紫斑病の確実な遺伝子診断を目指して

病原菌遺伝子の絶対定量

• 植物に感染する病原菌遺伝子の定量

• RNA抽出→逆転写→植物の内在性遺伝子+病原菌遺伝子の定量

デジタル

PCRとリアルタイムPCRの相関性は非常に高い

RNA抽出

逆転写

植物の内在性遺伝子+病原菌遺伝子の定量

• 薬剤処理濃度の異なるサンプルで比較

qPCRとdPCRの相関性

qPCRのデータ

標準物質の濃度測定

 デジタル

PCRで標準物質の濃度を決定

 濃度よりコピー数を算出し、

10倍希釈系列を作成し、digital PCRで測定

体細胞変異の解析

 甲状腺がん、メラノーマサンプルの

BRAF V600E の検出

 デジタル

PCRは1%以下の体細胞変異を検出することが出来ます。

正常検体

メラノーマ（FFPE）5.57%

各区画に分配されるため、

野生型の干渉が減少する

希少変異検出

甲状腺がん 0.72%

甲状腺がん（細針吸引）0.19%

リアルタイムPCRでは、

10%以上

変異型が

存在しないと野生型の干渉により検出困難

CNV (Copy Number Variation)解析



_3D

PCR system アプリケーション集

_{甲状腺がん 0.72%}

RNA シケンスでスクリニングした融合遺伝子のデジタルPCR による絶対定量

非常に手間がかかり安定したデタを得ることが困難

iRNAの検出とコピ数の測定を同時に解析

再発例移植後192日