平成21年度飼料分析技術担当者会議用資料

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家畜飼料中に含まれるカビ毒分析法の開発

2015.3

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博士論文

家畜飼料中に含まれるカビ毒分析法の開発

Develop ment of Analytical Method for Mycotoxins

in Feedstuffs

2015.3

青山幸二

Koji Aoya ma

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i 目次目次 ... i 略語一覧 ... v 第１章緒言 ... 1 第１節カビ毒 ... 1 第２節本研究で取り上げるカビ毒の概要 ... 2 ２－１オクラトキシン A ... 2 ２－２シトリニン ... 3 ２－３フモニシン ... 4 ２－４ゼアラレノンおよびその関連化合物 ... 5 ２－５デオキシニバレノールおよびニバレノール ... 6 第３節カビ毒の制御 ... 6 第４節カビ毒分析法 ... 7 第５節本研究の位置付け ... 8 第２章飼料中のカビ毒分析法の開発 ... 9 第１節序論 ... 9 第２節材料および方法 ... 9 ２－１試料 ... 9 ２－２試薬 ... 9 ２－３標準液の調製 ... 10 ２－４装置および器具 ... 11 ２－５ HPLC によるオクラトキシン A およびシトリニン同時定量法 ... 11 ２－６ LC-MS によるオクラトキシン A およびシトリニン確認法 ... 12 ２－７ HPLC によるオクラトキシン A 定量法 ... 13 ２－８ LC-MS によるフモニシン定量法 ... 14

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ii ２－９ LC-MS によるフモニシン確認法 ... 15 ２－１０ LC-MS によるゼアラレノン定量法 ... 15 ２－１１ LC-MS/MS によるゼアラレノン関連化合物定量法 ... 16 ２－１２ LC-MS/MS によるゼアラレノン関連化合物確認法 ... 17 ２－１３添加回収試験 ... 18 ２－１４定量下限および検出下限 ... 18 第３節結果および考察 ... 19 ３－１ HPLC によるオクラトキシン A およびシトリニン同時定量法 ... 19 ３－２ HPLC によるオクラトキシン A 定量法 ... 25 ３－３ LC-MS によるフモニシン定量法 ... 33 ３－４ LC-MS によるゼアラレノン定量法 ... 38 ３－５ LC-MS/MS によるゼアラレノン関連化合物定量法 ... 44 第４節要約 ... 48 第３章室間共同試験 ... 49 第１節序論 ... 49 第２節材料および方法 ... 51 ２－１コンパクトコラボ ... 51 ２－２フルコラボ ... 51 第３節結果 ... 54 ３－１ HPLC による飼料中のオクラトキシン A およびシトリニン同時定量法のコンパクトコラボ ... 54 ３－２ HPLC による飼料中のオクラトキシン A 定量法のコンパクトコラボ ... 57 ３－３ LC-MS による飼料中のフモニシン定量法のコンパクトコラボ ... 59 ３－４ LC-MS による飼料中のゼアラレノン定量法のコンパクトコラボ ... 61 ３－５ LC-MS/MS による飼料中のゼアラレノン関連化合物定量法のコンパクトコラボ ... 63

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iii ３－６ HPLC および LC-MS(/MS)による小麦中のデオキシニバレノールおよびニバレノール同時定量法のフルコラボ ... 66 第４節考察 ... 69 第５節要約 ... 72 第４章ソルガムにおけるゼアラレノン汚染とその原因菌 ... 73 第１節序論 ... 73 第２節材料および方法 ... 73 ２－１試料 ... 73 ２－２標準品および試薬 ... 74 ２－３ゼアラレノン汚染調査 ... 74 ２－４菌学に関する試験 ... 75 第３節結果 ... 76 ３－１ソルガムにおけるゼアラレノン汚染 ... 76 ３－２ソルガムにおけるゼアラレノン汚染原因菌 ... 79 第４節考察 ... 82 第５節要約 ... 84 第５章飼料および食品中のカビ毒汚染実態調査 ... 85 第１節序論 ... 85 第２節材料および方法 ... 85 ２－１飼料 ... 85 ２－２食品 ... 87 第３節結果および考察 ... 91 ３－１飼料中のフモニシン ... 91 ３－２食品中のオクラトキシン A およびフモニシン ... 95 第４節要約 ... 106

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iv 総合考察 ... 107 結論 ... 110 謝辞 ... 112 引用文献 ... 114 本論文を構成する論文 ... 132 学位論文要旨 ... 133

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v 略語一覧 ANOVA APCI CEN CFU EC ECD ELISA ESI FAO GC HPLC HorRat IARC ISO IUPAC JECFA LC LOAEL MS MS/MS ND NOEL ODS PBS analysis of variance、分散分析

atmospheric pressure chemical ionization、大気圧化学イオン化法 Comité Européen de Normalisation、欧州標準化委員会

colony forming unit、コロニー形成単位 European Communities、欧州共同体

electron capture detection、電子捕獲型検出器

enzyme-linked immunosorbent assay、酵素結合免疫吸着法 electrospray ionization、エレクトロスプレーイオン化法

Food and Agriculture Organization of the United Nations、国際連合食糧農業機関

gas chromatograph、ガスクロマトグラフ

high performance liquid chromatograph、高速液体クロマトグラフ Horwitz ratio

International Agency for Research on Cancer 、国際がん研究機関 International Organization for Standardization、国際標準化機構

International Union of Pure and Applied Chemistry、国際純正・応用化学連合 Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives 、 FAO/WHO 合同食品添加物専門家会議

liquid chromatograph、液体クロマトグラフ lowest observed adverse effect level 、最小毒性量 mass spectrometric detector、質量分析計

タンデム型質量分析計 not detected、不検出

no observed effect level、無作用量 octadecylsilyl、オクタデシルシリル

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vi PMTDI RSDr RSDR SCF SIM SN SRM TLC t-TDI UV WHO α-ZAL β-ZAL ZAN α-ZEL β-ZEL ZEN

provisional maximum tolerable daily intake、暫定最大耐容一日摂取量 relative standard deviation of repeatability、繰返し精度の相対標準偏差 relative standard deviation of reproducibility、室間再現精度の相対標準偏差 Scientific Committee on Food、食品科学委員会

selected ion monitoring、選択イオン検出 signal noize、シグナル・ノイズ

selected reaction monitoring、選択反応検出 thin-layer chromatograph、薄層クロマトグラフ temporary tolerable daily intake、暫定耐容一日摂取量 ultraviolet、紫外線

World Health Organization、世界保健機関

α-zearalanol、 α-ゼアララノール β-zearalanol、 β-ゼアララノール zearalanone、ゼアララノン α-zearalenol、 α-ゼアラレノール β-zearalenol、 β-ゼアラレノール zearalenone、ゼアラレノン

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1 第１章緒言第１節カビ毒カビは自然環境の至る所に存在し、有害な面と有益な面の両面でヒトと深く関わってきた（宇田川ら, 2002117 )）。カビによる有害な面の最たるものは、食品の腐敗である。また、カビはヒトや動物、農作物に感染すると病気の原因となる。その一方で、ヒトはカビを有効に利用してきた。味噌や醤油、酒、鰹節の製造にはカビが不可欠である。また、カビは大量に培養することにより、抗生物質や酵素などの製造にも利用されている。カビの代謝物のうち、少量でもヒトや動物に対して毒性を示すものをカビ毒（mycotoxin、マイコトキシン）と言う。一方、抗生物質は少量であれば微生物に対してのみ毒性を示し、ヒトや動物に対しては毒性を示さない。カビ毒の中には、当初は抗生物質に分類されていたが、ヒトや動物への毒性が明らかとなって、カビ毒と呼ばれるようになったものも存在する（宇田川ら, 2002117 )_）。カビ毒の摂取が原因となって起こる病気を真菌中毒症（mycotoxicosis、マイコトキシコーシス）という。真菌中毒症は、カビそのものがヒトや動物の組織に感染して起こる真菌症（mycosis、マイコーシス）とは区別される。真菌中毒症はあまり耳にすることはないが、日本も含め、世界各地で古くから発生している。代表的なものとしては、中世ヨーロッパで頻発した麦角中毒（CAST, 200313 )）、1930~1940 年代に旧ソ連で起こった食中毒性無白血

球症（Alimentary Toxic Aleukia、 ATA 症）（芳澤 , 20031 32 )）を挙げることができる。日本で

も 1940~1950 年代に、カビに感染した麦類の摂取による食中毒が多数報告されている（芳澤, 20031 32 )）。現在でも、食料の確保が困難な地域を中心に、カビ毒による死亡例も報告されている（Lewis et al., 200549 )）。カビ毒が世界的に注目を浴びるようになったのは、1960 年にイギリスで発生した七面鳥の雛が大量に中毒死した事故である（Sargeant et al., 19617 4 )）。この原因物質として発見されたのが、飼料に用いられたブラジル産落花生油かすを汚染したカビ Aspergillus flavus が 産生したアフラトキシンであった。その後の研究で、アフラトキシンは強い致死毒性の上、慢性毒性である強い発がん性も有することが明らかとなった（宇田川ら, 200211 7 )_{）。アフラ} トキシンは天然物質中で最も発がん性が強い物質であると言われている。この発見以降、

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2 少量のカビ毒を長期間摂取することによる慢性毒性にも注目を浴びるようになり、世界的な最大含有量の設定へと繋がっていった。現在、カビ毒は数百種類が知られており、その大部分は Aspergillus 属、Fusarium 属およ び Penicillium 属のカビにより産生される（宇田川ら , 200211 7)）。Aspergillus 属は熱帯から温 帯にかけて分布し、代表的なものとして、アフラトキシンを産生する A. flavus、オクラト キシンを産生する A. ochraceus が挙げられる。 Fusarium 属は土壌菌類として世界中に分布 し、トリコテセン系カビ毒、ゼアラレノン、フモニシなどを産生する。Penicillium 属も土 壌中に生息し、比較的寒冷な地域に分布している。Penicillium 属はオクラトキシン A、シ トリニン、パツリンなどを産生する。第２節本研究で取り上げるカビ毒の概要２－１オクラトキシン A

オクラトキシン A（ ochratoxin A、 Fig. 1-1）は 1960 年代に A. ochraceus の代謝物として

発見された（IARC, 19933 3 )_{）。その後の研究で、オクラトキシン} _{A は寒冷な気候に生息す} るカビである Penicillium 属菌や、熱帯から温帯地域に生息する複数の Aspergillus 属菌によ り産生されることが明らかとなった。汚染地域が多岐にわたることから、とうもろこし、麦類、ぶどう、コーヒー豆、カカオ豆、香辛料など様々な種類の作物がオクラトキシン A に汚染されている（JECFA, 2001b3 5 )）。また、飼料を介した畜産物の汚染も報告されている（JECFA, 2001b3 5 )）。従って、オクラトキシン A の汚染は国際貿易の際に深刻な問題となりうる。なお、オクラトキシンには、オクラトキシン B、オクラトキシン C などいくつかの関連化合物も発見されているが、これらはオクラトキシン A に比べ毒性も低く、産生量も少ない。 O O Cl OH N O COOH H H

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オクラトキシン A は腎臓や肝臓に対して強い毒性を示す。このカビ毒は北ヨーロッパで

多発したブタの腎障害や、バルカン諸国の風土病である腎臓疾患（バルカン腎炎）の原因

物質であると考えられている（Abouzied et al., 20022 )）。また、動物実験では発がん性を示

すことが証明され、ヒトに対する発がん性も示唆されたことから、IARC （ International

Agency for Research on Cancer 、国際がん研究機関）はオクラトキシン A のヒトに対する発

がん性をグループ 2B（発がん性の恐れがある）に分類している（ IARC, 19933 3)）。

オクラトキシン A の含有量は、ヨーロッパを中心に様々な国で規制されている。 FAO

（Food and Agriculture Organization of the United Nations、国際連合食糧農業機関）と WHO

（World Health Organization、世界保健機関）によって設置された国際食品規格委員会であ

る Codex 委員会は、近年、穀物（小麦、大麦およびライ麦）中のオクラトキシン A の最大

基準値を 5 μg/kg と設定した（ Codex, 20081 8 )）。

２－２シトリニン

シトリニン（citrinin、 Fig. 1-2）は 1931 年に、抗生物質の探索中に P. citrinum の培養物

から発見された（宇田川ら, 200211 7 )_{）。シトリニンは} _{Penicillium 属および Aspergillus 属の} 複数の菌から産生される。シトリニン産生菌の中にはオクラトキシン A も産生する場合があるため、それらの同時汚染が懸念されている。 O OH O HOOC H H

Fig. 1-2. Structure of citrinin

シトリニンは主に腎臓に対して毒性を示す。同じ腎毒性を示すオクラトキシン A と比べ

ると、シトリニンの毒性は弱いが、シトリニンとオクラトキシン A が共存すると毒性が増

強するという報告（Klarić et al., 20134 0)_{）もあるため注意が必要である。}

日本でのシトリニンに関する重要な出来事は、1950 年代に起こった黄変米事件である

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4 いた。その中には、品質が悪く、カビにより黄色や橙色に変色した米（黄変米）も含まれていた。米の変色の原因を調査したところ、その原因菌の一つとして P. citrinum が単離さ れた。また、P. citrinum が産生する物質であるシトリニンが腎毒性を示すことも明らかに された。これは、アフラトキシンの発見よりも前の出来事であった。２－３フモニシンフモニシン（fumonisin）は現在注目されているカビ毒の中では比較的発見が新しく、1988

年に F. moniliforme の培養物から発見された（ Gelderblom et al., 19882 9 )）。フモニシンは複

数の Fusarium 属の菌から産生され、特にとうもろこしでは汚染が頻繁に認められる （Shephard et al., 19968 0)）。フモニシンにはいくつかの関連化合物があるが、重要なのはフモニシン B1、B2および B3である（Fig. 1-3）。その他に、フモニシン A 群、 C 群、 P 群が発見されているが、その産生量は少ない。 O O O HOOC COOH R1 R2 OH NH2 O HOOC COOH

Fig. 1-3. Structure of fumonisin. Fumonisin B1: R1=OH, R2=OH; Fumonisin B2: R1=H, R2=OH;

Fumonisin B3: R1=OH, R2=H.

フモニシンはウマの白質脳症、ブタの肺水腫、ヒトの新生児神経管障害（Marasas et al.,

20045 4 ); Missmer et al., 20065 7 )）の原因物質とされており、食道がんとの関係も示唆されて

いる（Chu and Li, 199415 ); Yoshizawa et al., 19941 06 )）。IARC はオクラトキシン A 同様、フ

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5 ２－４ゼアラレノンおよびその関連化合物

ゼアラレノン（zearalenone、 ZEN）は 1962 年に F. graminearum から単離され、 1966 年

に構造が決定されたカビ毒である（Fig. 1-4）。ZEN は Fusarium 属の複数の菌から産生され、

とうもろこしや麦類などの穀物から検出される（Codex, 20001 7); Kuiper-Goodman et al.,

19874 3 ); Tanaka et al., 19889 5 ); Zinedine et al., 2007110 )）。

OH O H O C₁ C2 O R H Zearalenone -Zearalenol -Zearalenol Zearalanone -Zearalanol -Zearalanol ZEN -ZEL -ZEL ZAN -ZAL -ZAL C₁ C₂ R Abbreviation O OH OH O OH OH Fig. 1-4. Structure of zearalenone and the related compounds

ZEN は、毒性は強くないが、ほ乳類の生殖器系にエストロゲン（女性ホルモン）作用を

示すことが特徴である。特に、ブタは他の動物よりも ZEN の影響を受けやすいことが報告

されている（Kuiper-Goodman et al., 19874 3)）。メスのブタにおける ZEN によるエストロゲ

ンの過剰は、子宮や乳頭、外陰部の肥大、膣脱、不妊症を引き起こす。オスのブタが ZEN

にさらされると、精巣萎縮や乳腺の肥大が起こる可能性がある。日本では飼料に対して、1

ppm（ mg/kg）という基準値が設定されている（農林水産省生産局畜産部飼料課長 , 2002a12 8 )）。

ゼアララノン（zearalanone、ZAN）、α-ゼアラレノール（ α-zearalenol、α-ZEL）、β-ゼアラ

レノール（β-zearalenol、 β-ZEL）、 α-ゼアララノール（ α-zearalanol、 α-ZAL）および β-ゼア

ララノール（β-zearalanol、 β-ZAL）は ZEN の関連化合物である（ Fig. 1-4）。これら関連化

合物のほとんどは ZEN よりもエストロゲン作用が強い（ Hagler et al., 19793 0); Le Guevel and

Pakdel, 200147 ); Shier et al., 20018 3 )）。これらの化合物は動物体内での ZEN の代謝物として

検出されることが多いが（Zinedine et al., 200711 0 ); Zöllner et al., 200211 3 )）、カビも産生する

ことから（Bottalico et al., 19859 )_{; Hagler et al., 1979}3 0 )_{; Richardson et al., 1985}70 )_{）、作物の汚}

染も報告されている（Bottalico et al., 19859 )_{; Cavaliere et al., 2005}14 )_{; Han et al., 2011}3 1 )_{; Jin et}

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6 ２－５デオキシニバレノールおよびニバレノール

デオキシニバレノール（deoxynivalenol）およびニバレノール（ nivalenol）は Fusarium

属菌により産生されるトリコテセン系カビ毒の一種である（Fig. 1-5）。デオキシニバレノールおよびニバレノールは、1970 年前後に、日本における麦類の赤カビ病の研究の際に発見された。これらのカビ毒は温帯や亜寒帯地域で麦類を中心とした穀物を汚染し、汚染穀物の摂取により成長抑制、免疫毒性および血液毒性を引き起こす。 O OH H OH R H O OH O

Fig. 1-5. Structure of deoxynivalenol and nivalenol. Deoxynivalenol: R=H; Nivalenol: R=OH.

日本の作物でも、デオキシニバレノールやニバレノールによる汚染は問題となっており、農林水産省では「麦類のデオキシニバレノール・ニバレノール汚染低減のための指針」を作成している（農林水産省消費・安全局長, 生産局長 , 20081 27 )）。また、厚生労働省では、小麦中のデオキシニバレノールの含有量について、1.1 ppm（ mg/kg）という暫定基準値を設定している（厚生労働省医薬局食品保健部長, 2002118 )）。飼料については、生後 3 ヶ月以上の牛の飼料に対しては 4 ppm、それ以外の飼料に対しては 1 ppm という基準値が設定されている（農林水産省生産局畜産部飼料課長, 2002b1 2 9)）。第３節カビ毒の制御真菌中毒症はカビ毒を摂取することにより起こる中毒症であるため、予防には食物中のカビ毒の量を制限する必要がある。カビ毒を産生するカビは通常、農場段階で作物に付着し、その作物の生産、貯蔵、流通中に増殖すると同時にカビ毒を産生する。従って、カビ毒を抑制するためには、農場から、ヒトや動物の口に入るまで、カビの増殖を制御する必要がある。また、カビそのものであれば調理過程の加熱等で死滅させることができるが、カビ毒は一般的に調理温度程度では安定なものが多い。一方でカビ毒は、その急性毒性も

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7 さることながら、少量を長期間摂取することにより起こる慢性毒性にも注意を要する。カビ毒の量を制御するための方法として、Codex 委員会は各種カビ毒に対して、生産、貯蔵、流通段階における実施規範を作成している（Codex, 2012b21 )）。また、作物中カビ毒の最大含有量を設定することも有効な制御手段となりうる。ただし、最大含有量は設定するだけでは意味をなさず、それが遵守されているかどうか、またはどの作物がどの程度のカビ毒を含有しているかを監視する仕組み、つまりカビ毒の含有量を分析することが必要になる。カビ毒の最大含有量は、その慢性毒性のために低い濃度に設定されることが多くなる。従って、分析法もその低い濃度を検出できるものが必要となる。第４節カビ毒分析法食品や飼料中のカビ毒含有量の分析法は、機器分析と簡易キットによる分析に大きく分けることができる。カビ毒分析用の簡易キットは多く販売されており、分析費用が安価であり、結果も迅速に得られる（Zheng et al., 20061 08 )_{; 中島 , 2006}1 2 2 )_{）。簡易分析キットは}

ELISA（ Enzyme-linked Immunosorbent Assay、酵素結合免疫吸着法）等を利用し、通常、おおよその値を知るためのスクリーニング用として用いられる。簡易キットにより問題となりそうな結果が得られた場合は、機器分析によりその確認が行われる。機器分析によるカビ毒分析法に関する報告は、カラムにより目的成分とその他の成分とを分離するクロマトグラフィーの技術を用いたものが大半である。クロマトグラフィーは液体クロマトグラフィーとガスクロマトグラフィーに大別される。液体クロマトグラフィーは固体が充填されたカラムに液体を流して目的成分を分離する方法、ガスクロマトグラフィーは液体が内側に塗布されたカラムに気体を流して目的成分を分離する方法である。カビ毒の分析には、以前はガスクロマトグラフィーもよく利用されていたが、誘導体化が必要になるなど前処理が煩雑となる。従って、現在は液体クロマトグラフィーが主流となっている。

液体クロマトグラフ（liquid chromatograph、 LC）の検出器としては、 UV（ ultraviolet、

紫外線）検出器、蛍光検出器、質量分析計（mass spectrometric detector、 MS）、 MS を 2 台

つなげたタンデム型質量分析計（MS/MS）などが挙げられる。多成分のカビ毒を同時に分

析する場合は、選択性、感度共に良くなる MS や MS/MS が用いられる。しかしながら、蛍

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8 第５節本研究の位置付けカビ毒に限らず、新しい分析法を作るためには、第一に、対象となる試料の範囲を明確にし、単一試験室内で十分な検討を行うことが重要である。しかしながら、単一試験室内で十分な検討を行った分析法でも、他の試験室で同程度の結果が得られるとは必ずしも限らない。そこで、他の試験室でも使用する分析法については、複数の試験室において、同一の試料を同一の分析法で分析（室間共同試験）し、その結果を確認しておく必要がある。一方、カビ毒の制御には、実施規範の作成と最大含有量の設定もしくはリスクが高い食物の特定が重要となる。実施規範の作成、つまり農場や貯蔵、流通段階でカビ毒の発生を制御するためには、そのカビ毒を産生するカビを特定し、そのカビに合った対策を取ることが重要である。また、流通している食品や飼料が最大含有量を超えていないか、もしくはどの食物がカビ毒のリスクが高いかなどは、カビ毒の分析により確認される。本論文の第２章では、液体クロマトグラフを用いた飼料中のカビ毒分析法を単一試験室で検討した結果について記述した。第３章では、第２章で検討した分析法を中心に室間共同試験を実施した結果について記述した。第４章および第５章では、第２章や第３章で検討した分析法を、ソルガムにおける ZEN 汚染とその原因菌の調査（第４章）および飼料や食品中のカビ毒汚染調査（第５章）に応用した。著者が実施したこれらの研究は、食品や飼料中のカビ毒制御の一助になることが期待できる。

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9 第２章飼料中のカビ毒分析法の開発第１節序論日本で家畜に供されている飼料は、牧草を除き、その大半を輸入に頼っている（農林水産省, 2014b12 5 )）。例えば、日本で製造される植物油の原料（大豆、なたね等）はほとんどが輸入品であるため、飼料に用いられる搾油かすの原料も輸入品となる。日本の飼料はとうもろこしを主体に設計されているが、とうもろこしはカビ毒汚染が特に懸念されている作物の一つである。従って、日本の飼料中のカビ毒を制御するためには、日本国内で実施規範を作成するだけでは不十分であり、分析によりカビ毒を監視する必要がある。日本においては、飼料の公定分析法として「飼料分析基準」が策定されている（農林水産省消費・安全局長, 20081 26 )）。これは、単一試験室での検討結果、室間共同試験の結果をもとに、各分野の専門家で構成された委員会において承認された分析法である。この飼料分析基準の中には、カビ毒の分析法も収載されている。そこで、本章では、カビ毒であるオクラトキシン A、シトリニン、フモニシン、 ZEN および ZEN 関連化合物について、液体クロマトグラフを用いた飼料中の分析法を単一試験室で検討した結果を記載した。なおこれらの分析法は、公定分析法に採用するために検討を行ったものである。検討結果を受けて、これらの分析法は飼料分析基準に収載された。第２節材料および方法２－１試料飼料製造工場で採取した配合飼料および飼料原料をそれぞれ 1 mm の網ふるいを通過するまで粉砕して用いた。２－２試薬オクラトキシン A、シトリニン、フモニシン B2、ZEN、ZAN、α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL お よび β-ZAL の各標準品は Sigma 製、フモニシン B1の標準品は和光純薬工業製、フモニシ

ン B3の標準品は South African Medical Research Council 製を用いた。

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10 chromatograph、 HPLC）および LC-MS に用いたメタノール、アセトニトリルは HPLC 用または LC-MS 用試薬を用いた。酢酸アンモニウムは和光純薬工業製高速液体クロマトグラフ用 1 mol/L 水溶液を用いた。水は比抵抗が 18 MΩ•cm 以上のものを用いた。その他の試薬は特級を用いた。２－３標準液の調製標準原液は以下のように調製した。オクラトキシン A およびシトリニンはメタノールを用いて、フモニシン B1、B2および B3はアセトニトリル－水（1+1）を用いて、ZEN、ZAN、

α-ZEL、 β-ZEL、 α-ZAL および β-ZAL はアセトニトリルを用いて、それぞれ正確に溶解し

たものを標準原液とした。各標準原液の濃度は、オクラトキシン A、シトリニン、フモニシン B1、B2および ZEN がそれぞれ 200 µg/mL、 β-ZEL が 100 µg/mL、フモニシン B3が 56 µg/mL、ZAN、α-ZEL、α-ZAL および β-ZAL がそれぞれ 50 µg/mL であった。標準原液は −18 °C 以下で保存した。混合標準原液は各標準原液を用いて以下のように調製した。オクラトキシン A およびシトリニン混合標準原液は、各標準原液を混合し、メタノールで正確に希釈して調製した（オクラトキシン A 1 µg/mL、シトリニン 5 µg/mL）。フモニシン B1、B2および B3混合標準原液（フモニシン混合標準原液）は、各標準原液を混合し、アセトニトリル－水（1+1）で

正確に希釈して調製した（各フモニシン 5 µg/mL）。 ZEN、 ZAN、 α-ZEL、 β-ZEL、 α-ZAL

および β-ZAL 混合標準原液（ ZEN 類混合標準原液と称す）は、各標準原液を混合し、アセ トニトリルで正確に希釈して調製した（各 ZEN 類 2.5 µg/mL）。混合標準原液は 5 °C 以下で保存した。検量線の作成に用いる標準液あるいは内標準液は、各混合標準原液もしくは標準原液を用いて、使用の際に以下のように調製した。オクラトキシン A およびシトリニン混合標準液は、オクラトキシン A およびシトリニン混合標準原液の一定量をアセトニトリル－水（1+1）で正確に希釈して調製した。オクラトキシン A 標準液は、オクラトキシン A 標準原液の一定量をアセトニトリル－水－酢酸（300+700+1）で正確に希釈して調製した。フモニシン混合標準液は、フモニシン混合標準原液の一定量をアセトニトリル－水（1+1）で正確に希釈して調製した。ZEN 標準液は、ZEN 標準原液の一定量をアセトニトリル－水

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11 （1+1）で正確に希釈して調製した。 ZAN 内標準液は、 ZAN 標準原液の一定量をアセトニトリル－水（1+1）で正確に希釈して調製した（ 5 µg/mL）。 ZEN 類混合標準液は、 ZEN 類混合標準原液の一定量をアセトニトリル－水（21+4）で正確に希釈し、更に、各希釈液の一定量をそれぞれ酢酸（1+100）で正確に 2 倍に希釈して調製した。２－４装置および器具

HPLC は Agilent Technologies 製 1100 Series、島津製作所製 Prominence または Waters 製 2695、蛍光検出器は Agilent Technologies 製 G1321A（ Agilent Technologies 製 HPLC の場合）、 MS は Agilent Technologies 製 1100 Series LC/MSD SL（ Agilent Technologies 製 HPLC の場合）、

島津製作所製LCMS-2010 EV（島津製作所製 HPLC の場合）または Micromass 製 Quattro micro

API（ Waters 製 HPLC の場合）、LC 用カラムはジーエルサイエンス製 Inertsil ODS-2、Agilent Technologies 製 ZORBAX Eclipse XDB-C18、アルカリ化溶液送液ポンプは Waters 製 510、

アルカリ化溶液混合部はトムシック販売 PEEK ミキシングティーを用いた。

振とう器は Iwaki 製 KM Shaker またはタイテック製 Recipro Shaker SR-2W、遠心分離器

は久保田商事製 5200、 KS-5000P またはトミー精工製 LC-121、高速遠心分離器はトミー精

工製 MX-300、久保田商事製 KM-15200 または日立製作所製 SCT15B、エバポレーターは

BÜCHI Labortechnik AG 製 Rotavapor R-200、遠心エバポレーターは東京理化学製 CVE-3100 を用いた。

限外ろ過フィルターユニットは Millipore 製 Ultrafree-MC、多機能カラムは Romer Labs

製 MultiSep 229 Ochra または MultiSep 226 AflaZon+、イオン交換カラムは Varian 製 Bond

Elut LRC SAX（ 500 mg/10 mL）を用いた。２－５ HPLC によるオクラトキシン A およびシトリニン同時定量法分析試料 25 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ、アセトニトリル－塩酸－水（8+1+1） 100 mL を加え、軽く振り混ぜた後、 5 分間放置し、 30 分間振り混ぜてオクラトキシン A およびシトリニンを抽出した。抽出液をろ紙（ No. 5A）でろ過し、ろ液 5 mL を正確にとって 50 mL のなす型フラスコに入れ、40 °C で 1 mL 以下になるまで減圧濃縮した後、窒素ガスを軽く吹き付けてアセトニトリルを除去した。塩化ナトリウム約 0.5 g を試

(20)

12 料溶液に加え、更に酢酸エチル 10 mL を正確に加えた後、よく混合したものを 10 mL の試験管に入れ、1000×g で 5 分間遠心分離した。酢酸エチル層（上層） 5 mL を正確にとって 50 mL のなす型フラスコに入れ、40 °C でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後、窒素ガスを送って乾固した。残留物にアセトニトリル－水（1+1） 2 mL を正確に加えて溶かし、限外ろ過フィルターユニットに入れ、5000×g で 15 分間遠心し、フィルターを通過したもの を HPLC に供する試料溶液とした。試料溶液および各混合標準液各 20 µL を HPLC に注入し、 Table 2-1 の HPLC 条件に従いクロマトグラムを得た。得られたクロマトグラムからピーク高さまたは面積を求めて検量線を作成し、試料中のオクラトキシン A およびシトリニン量を算出した。

Column Inertsil ODS-2 (4.6 mm i.d.×250 mm, 5 µm)

Mobile phase Acetonitrile-water-1% H3PO4 (230+230+1)

Detector Fluorescence detector (Ex: 335 nm, Em: 480 nm)

Flow rate 1.0 mL/min

Column temperature 40 °C

Table 2-1. HPLC conditions for ochratoxin A and citrinin

２－６ LC-MS によるオクラトキシン A およびシトリニン確認法

２－５により各カビ毒と同じ位置にピークが確認された試料については、２－５で得ら

(21)

13

Column ZORBAX Eclipse XDB-C18 (3.0 mm i.d.×250 mm, 5 µm)

Mobile phase Acetonitrile-water-acetic acid (100+100+1)

Injection volume 10 µL

Ionization Electrospray ionization (ESI) Fragmentor voltage 100 V

Nebulizer gas N2 (35 psi)

Drying gas N2 (10 L/min, 350 °C)

Capillary voltage 3000 V (positive)

Monitor ion m/z 404 (ochratoxin A), 251 (citrinin)

Table 2-2. LC-MS conditions for ochratoxin A and citrinin

２－７ HPLC によるオクラトキシン A 定量法分析試料 25 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ、アセトニトリル－水－酢酸（84+16+1）100 mL を加え、30 分間振り混ぜて抽出した。抽出液を 50 mL の遠心沈殿管に入れ、1000×g で 5 分間遠心分離した。上澄み液を多機能カラム（ MultiSep 229 Ochra）に 入れ、カラム内の充填剤を通過した初めの流出液 1 mL を捨て、その後の流出液 3 mL から正確に 2 mL を 10 mL の遠心沈殿管に入れ、遠心エバポレーターを用いて、50 °C でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後、窒素ガスを送って乾固した。アセトニトリル－水－酢酸（300+700+1） 1 mL を正確に残留物に加えて溶かし、ポリプロピレン製遠心沈殿管（容量 1.5 mL）に移し、5000×g で 5 分間遠心分離し、上澄み液を HPLC に供する試料溶液とした。 試料溶液および各標準液各 50 µL を HPLC に注入し、 Table 2-3 の測定条件に従いクロマトグラムを得た。得られたクロマトグラムからピーク高さまたは面積を求めて検量線を作成し、試料中のオクラトキシン A 量を算出した。

Column Inertsil ODS-2 (4.6 mm i.d.×250 mm, 5 µm)

Mobile phase Acetonitrile-water-acetic acid (500+500+1)

Detector Fluorescence detector (Ex: 385 nm, Em: 444 nm)

Solution for alkalifying 100 mmol/L NaOH solution

Flow rate Mobile phase: 1.0 mL/min, solution for alkalifying: 0.3 mL/min Column temperature 40 °C

(22)

14

２－８ LC-MS によるフモニシン定量法

分析試料 20 g を量って 200 mL の共栓三角フラスコに入れ、メタノール－水（ 3+1）100 mL

を加え、15 分間振り混ぜてフモニシン B1、B2および B3を抽出した。抽出液を共栓遠心沈

殿管に入れ、1500×g で 5 分間遠心分離し、上澄み液をイオン交換カラムによる精製に供す

る試料溶液とした。イオン交換カラム（Bond Elut LRC SAX）をあらかじめメタノール 8 mL

およびメタノール－水（3+1） 8 mL で順次洗浄した。試料溶液 10 mL をカラムに正確に入れて流出させた後、メタノール－水（3+1） 8 mL およびメタノール 8 mL を順次カラムに加え、同様に流出させた。50 mL のなし形フラスコをカラムの下に置き、メタノール－酢酸（99+1） 14 mL をカラムに加えて各フモニシンを溶出させた。溶出液を 40 °C の水浴上でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後、窒素ガスを送って乾固した。残留物にアセトニトリル－水（1+1）1 mL を正確に加えて溶かし、ポリプロピレン製遠心沈殿管（容量 1.5 mL）に移し、5000×g で 5 分間遠心分離し、上澄み液を LC-MS に供する試料溶液とした。 試料溶液および各混合標準液各 5 µL を LC-MS に注入し、 Table 2-4 の測定条件に従い、

SIM（ selected ion monitoring、選択イオン検出）クロマトグラムを得た。得られたクロマト

グラムからピーク高さを求めて検量線を作成し、試料中のフモニシン B1、B2および B3量

を算出した。

Mobile phase A; 0.1 % formic acid, B; acetonitrile

0 min; 25 % B, 5 min; 50 % B, 8 min; 50 % B, 10 min; 25 % B

Ionization Electrospray ionization (ESI) (positive) Fragmentor voltage 220 V

Nebulizer gas N2 (50 psi)

Drying gas N2 (10 L/min, 350 °C)

Capillary voltage 3000 V

Monitor ion m/z 722 (fumonisin B1), 706 (fumonisin B2 and B3)

(23)

15 ２－９ LC-MS によるフモニシン確認法２－８により各フモニシンが検出された試料については、須賀らの報告（200411 9 )）を参考に、LC-MS のフラグメント電圧を上げ、２－８の最終溶液を再測定した。得られたフラグメントイオンにより定量を行い、２－８の擬分子イオンにより得られた定量値と比較した。Table 2-4 のうち、フラグメント電圧を 340 V、モニターイオンをフラグメントイオンである m/z 334（フモニシン B1）、m/z 336（フモニシン B2および B3）として定量を行った。２－１０ LC-MS によるゼアラレノン定量法分析試料 50 g を量って 300 mL の共栓三角フラスコに入れ、アセトニトリル－水（ 21+4） 150 mL を加え、30 分間振り混ぜて抽出した。抽出液を 50 mL の遠心沈殿管に入れ、1000×g で 5 分間遠心分離した。上澄み液を多機能カラム（ MultiSep 226 AflaZon+）に入れ、カラム内の充填剤を通過した初めの流出液 4 mL を捨て、その後の流出液 3 mL から 2 mL を正確に 10 mL の遠心沈殿管に入れ、遠心エバポレーターを用いて、 50 °C でほとんど乾固するまで減圧濃縮した後、窒素ガスを送って乾固した。アセトニトリル－水（1+1） 1 mL および ZAN 内標準液（ 5 µg/mL） 20 µL を正確に残留物に加えて溶かし、ポリプロピレン製遠心沈殿管（容量 1.5 mL）に移し、 5000×g で 5 分間遠心分離し、上澄み液を LC-MS に供 する試料溶液とした。一方、各標準液 1 mL を正確にバイアルに入れ、それぞれ ZAN 内標準液 20 µL を正確に加えて、よく撹拌したものを LC-MS に供する標準液とした。試料溶液および各標準液各 10 µL を LC-MS に注入し、 Table 2-5 の測定条件に従い SIM クロマトグラムを得た。得られたクロマトグラムからピーク高さを求めて内標準法により検量線を作成し、試料中の ZEN 量を算出した。

(24)

16

Mobile phase Acotonitrile-methanol-10 mmol/L ammonium acetate solution (4+7+9)

Ionization Atmospheric pressure chemical ionization (APCI) (negative)

Nebulizer gas N2 (2.5 L/min)

Interface temperature 300 °C Heat block temperature 200 °C

CDL temperature 200 °C

Monitor ion m/z 317 (ZEN), 319 (ZAN)

Table 2-5. LC-MS conditions for ZEN

２－１１ LC-MS/MS によるゼアラレノン関連化合物定量法分析試料 50 g を量って 300 mL の共栓三角フラスコに入れ、アセトニトリル－水（ 21+4） 100 mL（振り混ぜることができない試料は 150 mL）を加え、30 分間振り混ぜて抽出した。抽出液を 50 mL の遠心沈殿管に入れ、1000×g で 5 分間遠心分離した。上澄み液を多機能カ ラム（MultiSep 226 AflaZon+）に入れ、カラム内の充填剤を通過した初めの流出液 4 mL を捨て、その後の流出液 2 mL のうち一定量を同量の酢酸（ 1+100）で希釈した。希釈した液をポリプロピレン製遠心沈殿管（容量 1.5 mL）に移し、5000×g で 5 分間遠心分離し、上澄 み液を LC-MS/MS に供する試料溶液とした。試料溶液および各混合標準液各 10 µL を LC-MS/MS に注入し、Table 2-6 および Table 2-7

の測定条件に従い SRM（ selected reaction monitoring、選択反応検出）クロマトグラムを得

た。得られたクロマトグラムからピーク面積を求めて検量線を作成し、試料中の ZEN 類量

(25)

17

Mobile phase A; 10 mmol/L ammonium acetate, B; acetonitrile

0 min; 90 % B, 1 min; 90 % B, 20 min; 20 % B, 35 min; 20 % B

Ionization Electrospray ionization (ESI) (negative)

Source block temperature 120 °C

Desolvation gas

N2 (600 L/min, 300 °C)

Table 2-6. LC-MS/MS conditions for ZEN and the related compounds

Precursor Product Cone Collision

（m/z ）（m/z ）（V）（eV） ZEN 317 175 40 25 ZAN 319 205 30 20 α -ZEL, β-ZEL 319 160 30 30 α -ZAL, β-ZAL 321 277 30 25 Mycotoxins

Table 2-7. MS/MS parameters for ZEN and the related compounds

２－１２ LC-MS/MS によるゼアラレノン関連化合物確認法２－９により ZEN 関連化合物が検出された試料の一部については、以下の方法により確認を行った。分析試料 25 g にアセトニトリル－水（ 21+4） 100 mL を加え、 30 分間振り混ぜて抽出した。抽出液を遠心分離（1000×g、5 分間）し、上澄み液を多機能カラム（ MultiSep 226 AflaZon+）に入れ、初めの流出液 4 mL を捨て、その後の流出液 2 mL を 40 °C 以下で濃縮乾固した。10 mmol/L 酢酸アンモニウム－メタノール（ 9+1） 1 mL を加えて残留物を溶かし、高速遠心分離（5000×g、 5 分間）した上澄み液を LC-MS/MS により測定した。 LC-MS/MS の測定条件は Table 2-8 および Table 2-9 のとおり。

(26)

18

Column ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2.1 mm i.d.×150 mm, 3.5 µm)

Mobile phase A; 10 mmol/L ammonium acetate, B; methanol

0 min; 90 % B, 1 min; 90 % B, 40 min; 100 % B

Injection volume 10 µL

Ionization Electrospray ionization (ESI) (negative)

Source block temperature 120 °C

Desolvation gas

N2 (500 L/h, 350 °C)

Table 2-8. LC-MS/MS conditions for ZEN and the related compounds

Precusor Product Cone Collision

（m/z ）（m/z ）（V）（eV） Target 275 Qualifier 205 Target 160 30 Qualifier 275 20 Target 277 Qualifier 303

Table 2-9. MS/MS parameters for ZEN and the related compounds

25 α -ZEL, β-ZEL 319 30 α -ZAL, β-ZAL 321 30 Mycotoxins ZAN 319 30 20 ２－１３添加回収試験検討濃度相当量となるように各カビ毒の標準液を添加した試料について、各定量法に従い分析を行った。得られた結果から各カビ毒の回収率および繰返し精度を算出した。なお、検討は 3 点併行で行った。また、各カビ毒の自然汚染が見られる試料については、試料のブランク値を求めて補正を行った。２－１４定量下限および検出下限定量下限は、クロマトグラムにおける各カビ毒のピークの SN 比が 10 以上であり、添加 回収試験の結果が良好である濃度とした。また、検出下限は定量下限の 10 分の 3 とした。

(27)

19 第３節結果および考察

３－１ HPLC によるオクラトキシン A およびシトリニン同時定量法

３－１－１定量法の検討

オクラトキシン A の定量法としては、薄層クロマトグラフ（ Thin-Layer Chromatograph、

TLC）法（矢崎ら , 198213 0 )）、HPLC 法（ Akiyama et al., 19974 ); Aresta et al., 20035 ); Reinhard

and Zimmerli, 19996 9 ); Vrabcheva et al., 20001 02 ); Zimmerli and Dick, 199510 9 )）、酵素免疫法

（Sibanda et al., 200287 ); Vrabcheva et al., 20001 02 )）等が報告されている。一方、シトリニン

の定量法としては、蛍光分析法（Trantham and Wilson, 19849 8 )）、TLC 法（矢崎ら , 19821 3 0)）、

HPLC 法（ Abramson et al., 19993); Franco et al., 199628 ); Reinhard and Zimmerli, 199969 )）、酵

素免疫法（Abramson et al., 19993 ); Vrabcheva et al., 200010 2 )）、ガスクロマトグラフ（Gas

Chromatograph、 GC）法（ Shu and Lin, 20028 5 )）等が報告されている。しかしながら、現在

では、どちらのカビ毒も HPLC 法による定量が主流である。オクラトキシンA とシトリニンは共にイソクマリン類似骨格およびカルボン酸を有することから、同時分析が可能であり、いくつか報告もされている（矢崎ら, 198213 0 )_{）。しかし} ながら、いずれの報告においても精製の際に、試験者に悪影響のあるクロロホルムを使用している。なお、飼料分析基準にはオクラトキシン A の定量法として、 Sep-Pak カートリッジで精製後、HPLC で定量する方法も収載されているが、この定量法もクロロホルムを使用している。そこで今回は、クロロホルムを用いず、かつ穀類および配合飼料に適用可能なオクラトキシン A およびシトリニン同時定量法を検討した。オクラトキシン A およびシトリニンの同時定量法を検討するにあたり、財団法人日本食品分析センターが検討した方法が適用可能かどうかを確認した。この方法は、アセトニトリル－塩酸－水（8+1+1）で抽出した液を、硫酸アンモニウムを加えることにより 2 層に分離し、その上層をジエチルアミノプロピル基による固相抽出により精製する方法である。この方法により配合飼料および飼料原料の分析を行ったところ、配合飼料の一部において、硫酸アンモニウムを加えても 2 層に分離しないものが見られた。従って、この方法は一部の配合飼料には適用できないことが判明した。そこで、ゲル浸透クロマトグラフィー、ケイソウ土カラム、シリカゲルカラム等を用いて精製方法の検討を行ったところ、いずれの方法でもオクラトキシン A の回収率は良好で

(28)

20 あるが、シトリニンの回収率が悪くなる傾向が見られた。検討の結果、各種クリーンアップカラムを使用せずに単に溶媒置換を行っただけの第２節２－５の方法で良好な結果が得られた。３－１－２妨害物質の検討鶏用配合飼料（3 試料）、豚用配合飼料（ 3 試料）、牛用配合飼料（ 4 試料）、大麦、小麦、ライ麦、えん麦、とうもろこし、マイロ、大豆油かすおよびごま油かすについて、第２節２－５に従ってクロマトグラムを作成し、オクラトキシン A およびシトリニンの定量を妨害するピークの有無を検討した。なお、各カビ毒と同じ位置にピークが確認された試料については、第２節２－６に従って確認を行った。その結果、配合飼料の一部において、シトリニンの定量を妨害するようなピークが確認された。従って、配合飼料においてシトリニンの位置にピークが確認された場合、LC-MS により、そのピークがシトリニンであることを確認する必要がある。３－１－３添加回収試験大麦、とうもろこし、鶏用および豚用配合飼料にオクラトキシン A として 10 および 100 µg/kg 相当量、シトリニンとして 100 および 400 µg/kg 相当量をそれぞれ添加した試料について、第２節２－５で示した方法の回収率および繰返し精度を求めた。その結果、Table 2-10 のように、オクラトキシン A およびシトリニンの平均回収率はそれぞれ 96.3~107 %および 77.2~90.8 %であり、その繰返し精度は相対標準偏差（ RSDr）としてそれぞれ 13 %および 14 %以下であった。なお、添加回収試験で得られたクロマトグラムの一例を Fig. 2-1 に示した。 EC では、食品中カビ毒の公定検査に用いる分析法の基準を、カビ毒ごとに策定している。シトリニンは基準が策定されていないが、オクラトキシン A は策定されており、その基準は濃度が 1 µg/kg 未満の場合、回収率および RSDrはそれぞれ 50~120 %および 40 %以下である。また、オクラトキシン A 濃度が 1~10 µg/kg の場合は、それぞれ 70~110 %および 20 % 以下である。シトリニンについてもこの基準を参考にすると、Table 2-10 の結果はオクラトキシン A、シトリニン共に良好であった。

(29)

21

Mycotoxins Recoverya) _RSD

rb) Recovery RSDr Recovery RSDr Recovery RSDr

(µg/kg) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 10 96.3 13 103 14 107 8.9 104 10 100 97.1 7.1 98.6 7.0 106 7.6 98.2 7.4 100 85.0 3.0 87.5 2.7 90.8 13 84.0 7.4 400 86.2 0.5 88.7 3.0 77.2 5.5 83.0 3.6 Spiked levels Citrinin Ochratoxin A

Table 2-10. Recovery test of ochratoxin A and citrinin

a) Mean (n =3), b) Relative standard deviation of repeatability

(30)

22 0 5 10 15 20 (min) Ochratoxin A Citrinin (A) (B) (C) 0.1 0.2 0.3 0.4 (LU) 0.1 0.2 0.3 0.4 (LU) 0.8 0.4 0.6 1.2 (LU) 0.2 1.0 Ex: 335 nm, Em: 480 nm

Fig. 2-1. HPLC chromatograms of ochratoxin A and citrinin in recovery test . (A) Standard solution. The amounts of ochratoxin A and citrinin are each at 2.5 ng. (B) Sample solution of barley spiked at 100 µg/kg as ochratoxin A and 400 µg/k g as citrinin. (C) Sample solution of formula feed for pig spiked at 100 µg/kg as ochratoxin A and 400 µg/kg as citrinin.

(31)

23 ３－１－４定量下限および検出下限本法の定量下限および検出下限を確認するため添加回収試験を実施した。大麦および牛用配合飼料にオクラトキシン A として 2.5 および 5 µg/kg 相当量、シトリニンとして 10 および 20 µg/kg 相当量をそれぞれ添加した試料について、その回収率および繰り返し精度を算出した。その結果、Table 2-11 のように、オクラトキシン A として 2.5 µg/kg 相当量添加した場合は良好な結果が得られなかったが、オクラトキシン A として 5 µg/kg 相当量、シトリニンとして 10 および 20 µg/kg 相当量添加した場合はほぼ良好な回収率および RSDr が得られた。また、オクラトキシン A として 5 µg/kg、シトリニンとして 20 µg/kg 相当量を添加した場合、クロマトグラムにおけるピークの SN 比が 10 となった。以上より、定量 下限および検出下限は試料中で、オクラトキシン A が 5 µg/kg および 2 µg/kg、シトリニンが 20 µg/kg および 7 µg/kg であった。なお、牛用配合飼料にオクラトキシン A として 2.5 µg/kg 相当量添加した場合、平均回収率は 158 %となったが、これはピークの SN 比が 5 程 度であるため、ノイズの影響を受けたものと推察された。

(32)

24

Mycotoxins Recoverya) RSDrb) Recovery RSDr

(µg/kg) (%) (%) (%) (%) 2.5 92.5 27 158 45 5 93.9 23 101 20 10 82.0 19 110 9.5 20 90.0 19 94.9 8.5 Ochratoxin A Citrinin

a) Mean (n =3), b) Relative standard deviation of repeatability Table 2-11. Recovery around the limit of quantification

Spiked levels

(33)

25 ３－２ HPLC によるオクラトキシン A 定量法３－２－１ HPLC 測定条件の検討自然汚染濃度を調査する場合、通常の自然汚染濃度よりも低く、かつできる限り低い定量下限を有する定量法を利用することが望ましい。オクラトキシン A の自然汚染濃度は、通常、数 µg/kg 程度である。また、 Codex 委員会が設定した穀物中のオクラトキシン A の最大基準値は 5 μg/kg である。しかしながら、３－１で検討した定量法におけるオクラトキシン A の定量下限は 5 µg/kg である。従って、定量下限がより低い定量法の開発を行った。

Romer Labs 社からはオクラトキシン A 精製用の多機能カラム（ MultiSep 229 Ochra）が

市販されているが、その分析例における定量下限は 4 µg/kg である。一方、 Dall'Asta ら（200422 )）は、オクラトキシン A は HPLC においてアルカリ性の溶離液（アセトニトリル－アンモニア緩衝液（15+85））を用いると、酸性の溶離液に比べ蛍光強度が増大したと報告している。しかし、通常の HPLC カラムでは使用可能範囲が酸性から中性であるため、アルカリ性の溶離液は実用的ではない。一方、Burdaspal ら（ 200111)_{）はベビーフード中の} オクラトキシン A の分析において、ポストカラムアルカリ化 HPLC 法を用いた方法を報告している。この方法は、酸性の溶離液（酢酸水溶液とメタノールのグラジエント）を用い、カラム通過後に 25 %アンモニア水溶液でアルカリ性にする方法である。この方法は通常の HPLC カラムを使用することが可能であるため、この方法を参考に検討を行った。ただし、 Burdaspal らの方法では、用いたアンモニア水溶液が HPLC の廃液に残ってしまうため、廃液容器を密閉するなどの処理が必要である。そこで、アンモニア水溶液の代わりに水酸化ナトリウム（NaOH）水溶液を用いて検討を行うこととした。アルカリ化に用いる水酸化ナトリウム水溶液の濃度および流速を変化させ、各区の蛍光強度の比較を行った（Table 2-12）。なお、蛍光強度はアルカリ化溶液を用いない場合を基準とした。また、アルカリ性にするとオクラトキシン A の最大励起および蛍光波長も変化するため、蛍光強度はその時の最大波長で測定を行った。まず、アルカリ化溶液の NaOH 濃度を 100 mmol/L に固定し、流速を変えたときの蛍光強度の変化を見た。その結果、流速が 0.2 mL/min の場合に 4.2 倍の強度上昇が見られた。しかしながら、流速が遅い場合、クロマトグラムのベースラインが乱れた。そこで、流速

(34)

26

を 0.3 mL/min とし、 NaOH 濃度を 50 および 60 mmol/L に変化させたところ、蛍光強度は

それぞれ 0.9 および 4.3 倍の強度上昇が見られた。しかしながら、 50 および 60 mmol/L の

間では、わずかな濃度の変化で蛍光強度の上昇が見られなくなったため、余裕を見て、ア

ルカリ化溶液として 100 mmol/L NaOH 水溶液、流速 0.3 mL/min の条件を本法に採用する

(35)

27 Concentration; A Flow rate; B A×B

(mmol/L) (mL/min) (µmol/min) (nm) (nm)

0 0 3.8 336 464 1.0 0.1 10 5.7 336 450 1.0 0.2 20 10.5 385 444 4.2 0.3 30 12.6 385 444 3.9 0.4 40 12.8 385 444 3.7 50 0.3 15 6.2 337 449 0.9 60 0.3 18 6.9 383 444 4.3 100

a) pH after mixing with NaOH solution, b) Maximum excitation wavelength, c) Maximum emission wavelength Table 2-12. Examination of alkalifying condition

NaOH solution

(36)

28 ３－２－２多機能カラムからの流出挙動の確認多機能カラムである MultiSep 229 Ochra からオクラトキシン A が流出する画分を確認するため、オクラトキシンA 標準液をライ麦の抽出液で希釈したものを多機能カラムに入れ、その流出液を 1 mL ごとに分取し、各画分の回収率を求めた（ Table 2-13）。なお、オクラトキシン A の濃度は 5 および 50 µg/kg 相当量汚染された試料を抽出した場合と同じ濃度になるように設定した。その結果、 0~1 mL の画分は回収率が少し低くなった。従って、実際の操作では初めの流出液 1 mL を捨て、その後の流出液 3 mL から 2 mL を正確に分取することとした。なお、シトリニンとの同時定量についても検討したが、多機能カラムからシトリニンが溶出されなかったため、検討から除外した。

(37)

29 Fraction volumes (mL) 5 µg/kg 50 µg/kg 0~1 94.7 89.1 1~2 103 103 2~3 102 101 3~4 99.3 102 4~5 103 99.4 Recovery of ochratoxin A (%) Table 2-13. Elution pattern from MultiSep 229 Ochra