演 題A-1-920
Porphyromonas gingivalis線 毛 タ ンパ ク抗 原投 与 マ ウ スに お け る リ ンパ 球 サ ブ セ ッ トの 動 向 札幌 医科 大 学 動 物 実験 施設 、東 日本 学 園 大 学 歯 学 部 口腔 衛 生 学 教 室 、愛 知 学 院 大 学 歯学 部 口腔 細 菌 学 教 室
○磯 貝 浩 、磯 貝 恵 美 子*、広 瀬 公 治*、脇 坂 仁 美*、吉 村 文 信*
Lymphocyte Subsets in mice treated with the fimbriae from Porphyromonas gingivalis Division of Animal Experimentation, Sapporo Medical College,*Department of Preventive Dentistry, Higashi Nippon Gakuen University,*Department of Microbiology,
Aichi-Gakuin University •›
Hiroshi ISOGAI, Emiko ISOGAI, Kimiharu HIROSE, Hitomi WAKIZAKA, Fuminobu YOSHIMURA
キ ー ワ ー ド: Porphyromonas gingivalis, fimbriae, lymphocyte subsets 目 的 Porphyromonas gingivalisは 成 人 性 歯 周 炎の 原 因 細 菌 と し て注 目 され てお り 、そ の 菌 体 表 層 には 線 毛 構 造 が 存 在 し て い る 。本 研 究 で は マ ウ スモ デ ル にお い て 全 身 お よび 局 所 の 免 疫 応 答 を リ ンパ 球 サ ブ セ ッ トの 変 動 と い う観 点 か ら解 析 す る こ とを 試 み た 。 材 料 と 方 法 1.線 毛 抗 原 の 調 製 吉 村 ら の 方 法 に よ りP.gingivalis 381株 か ら線 毛 を 単 離 し 、 イ オ ン 交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー で 精 製 し た 。 2.投 与 方 法 局 所 お よ び 全 身 へ の 応 答 を 見 る 目 的 で 線 毛 抗 原 を そ れ ぞ れ2つ の 経 路 でC3H/He (雄 、6週 齢) に 投 与 し た 。 す な わ ち 、 線 毛 抗 原 を マ ウ ス 口 腔 粘 膜 下 (10μg/マ ウ ス 、1皿g/ml、10μg) に 投 与 し 、2-16日 目 に 下 顎 リ ン パ 節 の 応 答 を 調 べ た 。 別 の 実 験 系 と し て 線 毛 抗 原 を 静 脈 内 (100μ9/マ ウ ス 、1mg/ml、100μg) に 投 与 し 、 脾 臓 に お け る 応 答 を 調 べ た 。 3.フ ロ ー サ イ トメ ト リー Tお よ びBリ ン パ 球 分 画 は マ ウ ス 脾 臓 お よ び 下 顎 リ ン パ 節 か ら 比 重 遠 心 法 お よ び ナ イ ロ ン ウ ー ル カ ラ ム 法 に て 得 た 。 こ れ ら を 抗Lyt-1.1、Lyt-2.1、Thy-1.2、 お よ びIa単 ク ロ ン 抗 体 と 反 応 さ せ た 後 、FITC標 識 抗
マ ウ スIgGを 反 応 さ せ た 。Ig陽 性 細 胞 の 分 析 に はFITC
標 識 抗 マ ウ ス19Gと 前 述 の よ う に 反 応 さ せ た リ ン パ 球
を 用 い た 。 こ れ ら の 細 胞 をflow cytometory (EPICS、
Coulter Co, Ltd) に よ り 分 析 し た 。 結 果 P.gingivalis線 毛 を 投 与 さ れ た マ ウ ス に お い て 各 種 リ ンパ 球 マ ー カ ー の 蛍 光 強度 お よ び 陽性 細 胞 の割 合 は 大 き く変 動 した 。 局所 と全身 応 答 を比 較 した と き 、 Tリ ンパ 球 表 面 マ ー カ ー (Lyt-1,Lyt-2,Ia,Thy-1) の 変 動 パ タ ー ンは 一 致 しな か っ た 。 た と え ば 、Lyt-1 陽 性Tリ ンパ球 は局 所投 与 に お け る 下顎 リンパ 節 で は 2日 目 に 一 過性 に そ の割 合 を増 加 させ たが 、全 身 投 与 に お け る 脾臓 で の応 答 は経 日的 に蛍 光強 度 が シ フ トす る パ タ ー ンを と っ た 。Bリ ンパ 球 表 面マ ー カ ー と して のIaお よびIgの 検 索 に お い て 、表 面Igの 変 化 と して 局 所 応答 では 強 い蛍 光強 度 を示 す ピー クが2日 目 に出 現 した の に対 し、全 身 応 答 で は9日 目 に出 現 し た 。 さ ら に 、Ia expressionが 表 面Igの 変 化 に関 連 して い る傾 向 が 認 め られ た 。 考 察 P.gingivalis線 毛 を 口腔 粘 膜 局 所 に投 与 す る と強 い 炎症 反 応 を惹 起 す る こ とが で き る 。局 所 リ ンパ 節 の 応 答 は この 炎 症 惹 起 に関 連 し た リ ンパ 球 の 応 答 を含 ん で い る と考 え られ る 。 この 応 答 に はT細 胞 サ ブ セ ッ ト の 活 性 化 お よび 抑 制 性 サ ーキ ッ トが 関 連 し、 歯 周疾 患 にお け る局 所 応 答 の 重 要 性 を 示 唆 し た。 さ らに 、 局所 応 答 と全 身 応 答 の 違 いは 本 菌 線 毛 に対 す る抗 体産 生 機 序 を考 え る う えで 興 味 深 い 。 結 論 1. P.gingivalis線 毛 を 投 与 され たマ ウ スに お け る局 所 反 応 と し てTお よびBリ ンパ 球 サ ブ セ ッ トの 変 動 が 見 られ た 。 2.線 毛 を全 身 投 与 し た と き と局 所 投 与 した と きで は 変 動 パ ター ンが 異 な り、 免 疫 調 節 が 異 な った ネ ッ ト ワー クで 動 く こ とを 示 唆 し た。
演 題A-2-930
Bacteroides gingivalliSに よ るT細 胞 サ ブ セ ッ トの 変動 九州 大学 歯 学 部歯 科保 存 学第 一 教室
○北 村裕 治,廣 藤 卓雄,米 田雅 裕,青 野正 男,前 田勝 正
Modulation of T-cell Subsets by Bacteroides gingivalis
Department of Periodontics & Endodontics, Faculty of Dentistry, Kyushu University •› Yuji KITAMURA, Takao HIROFUJI, Masahiro YONEDA, Masao AONO, Katsumasa MAEDA
キ ー ワ ー ド: T細 胞 サ ブ セ ッ ト,フ ロ ー サ イ トメ ト リ ―, Bacteroides gingivalis [ 目 的] 歯 周 炎 は 口 腔 内 細 菌 に よ っ て 起 こ る 感 染 症 で あ る が 、 そ の 発 症 に 生 体 防 御 細 胞 が 深 く関 わ り 合 っ て い る と さ れ て い る 。 近 年 、 歯 周 病 関 連 細 菌 に よ る免 疫 反 応 の 抑 制 が 報 告 さ れ て い る1) が 、 免 疫 反 応 に 於 て 重 要 な 作 用 を 及 ぼ す T細 胞 表 面 抗 原 に 対 す る 影 響 に つ い て は 、 現 在 ま で の と こ ろ 明 ら か に さ れ て い な い 。 そ こ で 我 々 は 、
Bacteroides ginivalis (以 下B.gingivalis) の 培 養
上 清 を 用 い 、 ヒ ト末 梢 血T細 胞 サ ブ セ ッ トに 及 ぼ す 影 響
に つ い て 検 索 し た の で 報 告 す る 。 [ 材 料 及 び 方 法]
1.各 種 細 菌 培 養 上 清 の 調 製
B.gingivalis 381株 、B.intermedius ATCC 25611株 、
B.melaninoenicus ATCC 25845株
、B.asaccharoly-ticus ATCC 27067株 、B.fragilis ATCC 25285株 、
Capnocytophaga 25株 、A.actinomycetemcomitans
ATCC 29522株 、S.mutans 6715株 、S.sangius ATCC
10557株 、E.coli IFO 3972株 、S.typhimurium B 2245
株 を 通 法 に 従 っ て 培 養 後 、 遠 心 に よ り上 清 を 採 取 し た 。 上 清 は 凍 結 乾 燥 後 、PBSに 透 析 し 、 ミ リ ポ ア ・フ ィ ル タ ー に て 濾 過 滅 菌 し て 使 用 し た 。 2.末 梢 血 リ ン パ 球 の 調 製 及 び 培 養 健 康 人 末 梢 血 を ヘ パ リ ン 存 在 下 に て 採 取 し 、Ficoll-Conrayに て 分 離 、 調 製 して リ ン パ 球 画 分 を 得 た 。 リ ン パ 球 は 、 エ ス ・ク ロ ン 無 血 清 培 地 (三 光 純 薬) に 浮 遊 さ せ 、 細 菌 上 清 (最 終 濃 度0∼1000μg/ml) と一 定 時 間 培 養 を 行 っ た 。 3.T細 胞 サ ブ セ ッ トの 測 定 T細 胞 サ ブ セ ッ トの 測 定 は 、FITC標 識 し た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い て フ ロ ー サ イ トメ ト リ ー に よ り行 っ た 。 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と して 、FITCで 標 識 し た 抗CD3抗 体 (しeu4) 、 抗CD4抗 体 (T4) 、 抗 CD8抗 体 (T8) を 使 用 し た 。 フ ロ ー サ イ ト メ ー タ ー は オ ー ソ ・サ イ トロ ン (オ ー ソ ・ダ イ ア グ ノ ス テ ィ ッ
表1.The effect of B.gingivalis culture supernatant on T-cell subset antigen
ク ・シス テム ズ) を用 い た。 [ 結 果] 各 種 細 菌の 培養 上 清 と培 養 した後 のT細 胞 表 面抗 原 を検 索 した と こ ろ、表1に 示 してい る よ うにB.gingivalis 培 養 上清 によ りCD4陽 性細 胞 は ほ とん ど検 出で きな く な った。 また、CD8陽 性 細胞 率 に も有 意 の低 下 が観 察 され たが 、CD3陽 性 細胞 率 に は変 化 は認 め られ な か っ た 。 [ 考 察 及び 結 論] 以上 の 実験 結 果 よ り、歯 周 炎関 連細 菌 の 内 の1つ と して 注 目さ れ て いるB.gingivalisに は 、 ヒ トT細 胞 の 表面 抗 原 を 障害 す る因 子 が存 在 して い る こ とが明 らか とな っ た。T細 胞 上のCD4,CD8,CD3等 の 抗原 は 、各 細 胞 の マ ーカ ー と しての み存 在 して いる ので はな く、T 細 胞 の免 疫反 応 発現 に強 く関 連 して い る こ とが明 らかに され て お り、B.gingivalisはT細 胞 機 能 を 障害 して い るこ とが 示 唆さ れ た。 [ 文 献] 1) Shenker, B. J. 1988. Immunosuppression: an etiopathogenic mechanism, p. 178-186. In B. Guggenheim (ed.) , Periodontology today. S. Karger AG, Basel.
演 題A-3-940
Ca9-22細 胞 へ のBacteroides gingivalisの 付 着 に 対 す る β-エストラジ オールの 影 響 に つ い て
日本 大 学 歯 学 部 保 存 学 教 室 歯 周 病 学 講 座 、 日本 大 学 松 戸 歯 学 部 生 化 学 教 室*
○ 増 田 晴 美 、 田 中 宏 司 、 小 林 雅 実 、 沼 崎 光 、 辻 康 雄 、 向 井 浩 、 伊 藤 公 一 、村 井 正 大
安 孫 子 宜 光*、 滝 口 久*
The Effect of ƒÀ-estradiol on the Adherence of Bacteroides giiigivalis to Ca9-22 cells
Department of Periodontology , Nihon University School of Dentistry Department of Biochemistry, Nihon University School at Matudo Dentistry*
•›
Harumi MASUDA,Kouji TANAKA, Masami KOBAYASHI,Hikaru NUMASAYI,Yasno TUJI, Hiroshi MUKAI,Koithi ITO,Seidai MURAI,Yosimitu ABIKO* and Hisashi TAKIGUTI *キー ワ ー ド: 付 着,培 養上 皮細 胞,bacteroides gin-givalis, 性 ホル モ ン 【目的 】 炎 症 性歯 周疾 患 の発 症 は 、歯面 へ の プ ラー クの形 成 と、歯 肉溝 上 皮お よび接 合 上皮 に細 菌 が付 着 、定 着す るこ とか ら始 ま る とい われ てい る 。一 方 、性ホ ル モ ン の変 調 を きたす 思 春期 や妊 娠 期 に歯 肉炎 が 増悪 す る こ とが報 告 され て い るが 、そ の機 構 につ いて は 、完 全 に は解 明 され て いな い。演 者 らは 、細 菌 が上 皮細 胞 に付 着 、定 着す る機構 に 、性 ホ ルモ ンが 何 らかの役 割 を演 じて い ると考 え 、手 始め に 、培 養 上皮 細 胞への 歯 周病 病 原細 菌の 付 着 に対 す る性 ホル モ ンの 影 響 を検 討 して きた 。 今 回 、演 者 らは 、成 人性 歯周 炎 の原 因 菌の一 つ と 目 されて い るBacteroides gingivalisを 用 い 、培 養 上 皮 細 胞 に対す る細菌 付 着 につ いて 検 討 し、興 味 あ る知見 を得 たの で報 告す る 。 【材 料お よ び方 法 】 1.材 料 供 試菌 株: Bacteroides gingivalis (日 本大学 松 戸 歯 学 部 生化学 教 室 保存 、以後 盤 と略す) 供 試 細胞: Ca9-22細 胞 (東 京 医科 歯科 大学 歯学 部 第2 口腔 外科 学教 室 保存 、以後Ca細 胞 と略す) ホル モ ン: β-エ ス トラ ジオ ール (シ グマ社 製 、以 後E 2と略す) 2.方 法 1) Ca細胞 の 細 胞数 の 計測 Ca細 胞 を培 養 皿 (￠60×15mm) に1×105/wellず つ 播 種 し 、24時間 後 、付着 した 細胞 が 指数 関 数増 殖期 には い るの を待 ち 、E2濃 度10-2∼104ng/mlの7段 階 に調 整 した 培養 液 と交 換 した 。それ ちの 細 胞 は 、24、48お よ び72時 間ご とに0.25%ト リプ シンで 単離 分散 し 、細 胞数 を コ ー ル タ ー カ ウ ン タ ーで 計 測 した 。 2) B.gの 付 着 実 験 Ca細 胞 は 、104個/wellず つ96穴 マ ル チ ウ ェ ル プ レ ー ト に 播 種 し 、 培 養24時 間 後 にE2を10-2∼104ng/mlに 調 整 した 培 養 液 (10%FBS+E-MEM) に 交 換 し 、E2を 作 用 さ せ た 。 作 用 時 間 は 、Ca細 胞 の 倍 加 時 間 と した 、一 方 、 3H-tymdineで ラ ベ ル したB.gを 調 整 し、細 菌 懸 濁 液 と し た 。E2作 用 後 のCa細 胞 か ら 培 養 液 を除 去 し 、 細 菌 懸 濁 液 を50μl/wellず つ 加 え 、37℃ で 作 用 さ せ た 、 そ の 後 、 付 着 して い な い 細 菌 を 取 り除 く 目 的 で 、PBSで 胴 洗 浄 した 、付 着 細 菌 数 は 、0.5N NaOHを 用 い て 付 着 細 菌 を 溶 解 さ せ 、 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン 法 を 用 い て 測 定 し 、 測 定 値 を 付 着 細 菌 量 と し た 。 【結 果 】 1、Ca細 胞 の 細 胞 数 の 経 時 的 変 化 E2作 用 後 、 コ ン トロ ー ル お よ びE2作 用 群 相 互 の 増 殖 曲 線 に 差 異 は 認 め ら れ な か っ た しか し な が ら 、10 4ng/mlE2作 用 群 は 、 そ の 他 の 群 と 比 較 し 、E2作 用24 時 間 後 、 増 殖 が 抑 制 さ れ た 。 2、B.gの 付 着 実 験 細 菌 付 着 時 の 指 適 条 件 を 求 め た 、 そ の 結 果 、 細 菌 懸 濁 液 濃 度OD600=1.0、 付 着 時 間1.5時 間 、pH7.0で 実 験 を 行 っ た 。
Ca細 胞 にE2を 作 用 させ た 場 合 、 作 用 さ せ たE2濃 度
が 上 昇 す る に つ れ 、細 菌 付 着 量 が 増 加 した 、 細 菌 付 着 時 の1well中 の 細 胞 数 に は 、E2作 用 群 間 の 差 は 認 め ら れ な か った 。 一 方、細 菌 懸 濁 液 にE2を 作 用 さ せ た 場 合 に は 、 細 菌 付 着 量 に 対 す るE2の 影 響 は 認 め ち れ な か った 【考 察 】 今 回 の 実 験 結 果 か ら 、 培 養 上 皮 細 胞 に 対 す る 細 菌 の 付 着 に 、 ホ ル モ ン が 何 ら か の 影 響 を 及 ぼ す こ と が 推 察 さ れ た.
演 題A-4-950
Bacteroides (Porphyromonas) gingivalis線 毛 構 造 遺 伝 子 の 近 傍 領 域 の ク ロー ニ ング と形 質 発 現 の検 討
北 海 道 大 学 歯 学 部 歯 科 保 存 学 第2講 座,*愛 知 学 院 大 学 歯 学 部 微 生 物 学 講 座 ○ 高 橋 幸 裕,吉 村 文 信*,川 浪 雅 光,加 藤 熈
Cloning and Expression of Adjacent Region of the Fimbrilin Gene in Bacteroides (Porphyromonas) gingivalis
Dept. of Periodontology and Endodontology, Hokkaido Univ. School of Dentistry, and * Dept. of Microbiology Aichi-Gakuin Univ. School of Dentistry
•›
Yukihiro TAKAHASHI, Fuminobu YOSHIMURA*, Masamitsu KAWANAMI and Hiroshi KATO
キ ー ワ ー ド: Bacteroides (Porphyromonas)
gingivalis,線 毛,ク ロ ー ニ ン グ
目 的
Bacteroides (Porphyromonas) gingivalisは,成
人 性 歯 周 炎 の 最 も 有 力 な 病 原 性 細 菌 と し て 注 目 さ れ て き て お り,そ の 菌 体 表 層 に 線 毛 が 存 在 し,歯 周 組 織 へ 定 着 す る 際 に 重 要 な 役 割 を 果 し て い る と 考 え ら れ て き て い る 。1988年,Dickinsonら に よ り,B. gingivalis線 毛 の 構 造 遺 伝 子 を 含 むDNA断 片 が ク ロ ー ニ ン グ さ れ て お り,そ の 塩 基 配 列 が 決 定 さ れ て い る 。 本 研 究 で は,組 換 え ク ロ ー ン に よ る 線 毛 構 成 蛋 白 質 の 産 出 を 可 能 に し,こ の 線 毛 の オ ペ ロ ン の 構 造 と 発 現 制 御 機 構 を 明 ら か に す る 目 的 で,B. gingivalis線 毛 構 造 遺 伝 子 の 近 傍 領 域 の ク ロ ー ニ ン グ を 行 い,さ ら に こ れ ら ク ロ ー ン の 形 質 発 現 に つ い て 検 討 し た 。 材 料 お よ び 方 法 B.gingivalis381の 染 色 体,DNAを,制 限 酵 素
HindIHま た はPstIに て 完 全 消 化 し,T4DNAリ
ガ ー ゼ に よ りpUC19プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー と結 合 さ せ た 。 こ れ をE.coliJM83へ 形 質 転 換 さ せ,B. gingivalisのHindMお よ びPstI断 片 の 遺 伝 子 バ ン ク を 作 製 し た 。 こ の 遺 伝 子 バ ン ク よ り,線 毛 構 造 遺 伝 子 の 全 部 あ る い は 一 部 を 含 む 組 換 え ク ロ ー ン を,B.gingivalis 線 毛 構 造 遺 伝 子 を 含 むDNA断 片 を プ ロ ー ブ と し て, コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 に よ り 同 定 し た 。 そ し て,得 ら れ た 組 換 え ク ロ ー ン に つ い て, SDS-PAGE,ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト法,お よ び コ ロ ニ ー イ ム ノ ブ ロ ッ ト法 に て,形 質 発 現 の 検 討 を 行 っ た 。 ま た,得 ら れ た 組 換 え ク ロ ー ン の プ ラ ス ミ ド をE. coliJMIo9へ 再 形 質 転 換 さ せ,こ の 組 換 え ク ロ ー ン に つ い て,同 様 に 形 質 発 現 の 検 討 を 行 っ た 。 結 果 お よ び 考 察 ク ロ ー ニ ン グ の 結 果,線 毛 構 造 遺 伝 子 の 全 部 を 含 むHin dIII断 片 と,線 毛 構 造 遺 伝 子 の 上 流 域 お よ び
下 流 域 の 一 部 を 含 む2つ のPstI断 片 が,E. coli
JM83を 宿 主 菌 と す るpUC 19プ ラ ス ミ ドベ ク タ ー に ク ロ ー ニ ン グ さ れ た 。 線 毛 構 造 遺 伝 子 の 上 流 域 を 含 む 約4.4kbのPstI 断 片 に つ い て,ク ロ ー ン の 制 限 酵 素 地 図 作 成 を 行 っ た 。 得 ら れ た ク ロ ー ン に つ い て,SDS-PAGE,ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 お よ び コ ロ ニ ー イ ム ノ ブ ロ ッ ト法 を 行 い,菌 体 抽 出 物 の 蛋 白 質 パ タ ー ン を 比 較 検 討 し た 。 そ の 結 果, 1) SDS-PAGEで は,蛋 白 質 の パ タ ー ン に 識 別 で き る 変 化 は 観 察 で き な か っ た 。 2) Yoshimuraら (1984) が 作 製 し たB.gingivalis 線 毛 サ ブ ユ ニ ッ ト に 対 す る 特 異 抗 体 を1次 抗 体 と し た ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 で,線 毛 構 造 遺 伝 子 の 全 部 を 含 むHin dIII断 片 を 持 っ た ク ロ ー ン に 分 子 量 45,000の 位 置 に 細 い バ ン ドが1本 検 出 さ れ た 。 こ れ は,Hin dIII断 片 の 挿 入 方 向 や,ク ロ ー ン の 培 養 条 件 に 関 ら ず 検 出 さ れ た が,ベ ク タ ー の ラ ク トー ス プ ロ モ ー タ の 方 向 とHin dIII断 片 中 の 線 毛 構 造 遺 伝 子 の 方 向 が 一 致 し,か つ 培 養 時 にIPTGで 誘 導 を か け た 場 合 に 最 も 顕 著 に こ の バ ン ド が 観 察 さ れ た 。 3) コ ロ ニ ー イ ム ノ ブ ロ ッ ト法 で は,形 質 発 現 を 確 認 で き な か っ た 。 4) プ ラ ス ミ ドの 宿 主 菌 を,E. coli JM83か ら ラ ク トー ス リ プ レ ッ サ を 積 極 的 に 合 成 で き るE. coli JM109に 変 え,同 様 の 実 験 を 行 っ た が,結 果 はJM83 を 宿 主 菌 と し た 時 と 基 本 的 に は 変 わ ら な か っ た 。 5) ベ ク タ ー の ラ ク トー ス プ ロ モ ー タ の 方 向 と線 毛 構 造 遺 伝 子 の 方 向 が 逆 方 向 に 挿 入 さ れ たHin dIII 断 片 を 持 っ ク ロ ー ン で も 形 質 発 現 を 確 認 で き た こ と か ら,線 毛 構 造 遺 伝 子 よ り 上 流 の 約2kb以 内 の 領 域 に,プ ロ モ ー タ な ど,形 質 発 現 を 調 節 す る 遺 伝 子 群 が 存 在 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
演 題A-5-1000
Actinobacillus actinomycetemcomitansの 型 特 異 莢 膜 多 糖 抗 原 変 異 株 の 免 疫 化 学 的 性 状 と病 原 性 に つ いて
愛 知 学 院 大 学 歯 学 部 歯 周 病 学 教 室,国 立 予研 歯 科 衛 生部*
○石 原 裕 一,西 原 達 次*,楠 崎 た ま き,黒 須 直子,野 口俊 英,古 賀 敏 比 古*
Pathogenic and immnological properties of serotype specific antigen defective mutant of Actinobacil/us actiflogyretescomitans Department of Periodontology,School of Dentistry, Aichigakuin Univercity, Department of Dental Research,N. I. H. *
•› Yuichi Ishihara,Tatsuji Nishihara*,Tamaki Kusuzaki, Naoko Kurosu,Toshihide NOGUCHI,and Toshihiko Koga *
キ ー ワ ー ド: A.actinomycetemcomitans,型 特 異 莢 膜 多 糖 抗 原, 致 死 活 性 目 的 限 局 型 若 年 性 歯 周 炎 の 病 原 菌 の1つ と して 注 目 さ れ て い るActinobacillus actinomycetemcomitans はa,b,c,の3つ の 血 清 型 に 分 類 さ れ て い る 。 我 々 は 、 最 近 こ の う ち も っ と も 歯 周 病 原 性 が 強 い と 考 え ら れ て い るb型 特 異 莢 膜 多 糖 抗 原 の 化 学 構 造 を 明 ら か に し た 。 今 回 、b型 の 、A.actinomycetemcomitans Y4株 の 中 か ら 、 こ の 型 特 異 抗 原 を 欠 落 し た 変 異 株 を 得 た 。 そ こ で 、 こ の 変 異 株 の 表 層 構 成 成 分 の 免 疫 化 学 的 性 状 と 病 原 性 に つ い て 調 べ た 。 材 料 と 方 法1) 本 研 究 で は 、A.actinomycetem-comitans Y4 Cap+株 (b型) と そ の 型 特 異 抗 原 欠 落 株Y4 Cap-株 を 用 い た 。2) 全 菌 体 か ら オ ー トク レ
ー プ 法 で 抽 出 し た 粗 抗 原 をDEAE -Sephadex A-25イ オ
ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー とSephacryl S-300ゲ ル 濾 過 で 精 製 し た も の を 型 特 異 抗 原 と し た 。3) 温 フ ェ ノ ー ル ・水 法 で 全 菌 体 よ り抽 出 し 、 ヌ ク レ ア ー ゼ 処 理 後 、 超 遠 心 を 繰 り 返 し て 精 製 し た も の を フ ェ ノ ー ル 抽 出 物 と し た 。 こ の 標 品 をSephadex G-200ゲ ル 濾 過 し た も の を リ ポ 多 糖 (LPS) 標 品 と し た 。4) 全 菌 体 お よ び フ ェ ノ ー ル 抽 出 物 のSDS-ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 (SDS-PAGE) を 行 い 、 ク マ シ ー ブ リ リ ア ン トブ ル ー お よ び 銀 染 色 を 行 っ た 。5) Y4 Cap+株 全 菌 体 を 家 兎 に 静 注 し て 得 た 抗b型 特 異 血 清 お よ びY4
Cap+株LPS (MAb L2) お よ びb型 特 異 抗 原 (MA
b S5) に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い て
、West-ernプ ロ ッ ト に よ る 分 析 を 行 っ た 。6) 病 原 性 に つ い
て 調 べ る た め に 、 リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 で 種 々 の 濃 度
に 調 整 し た 菌 液 をC3H/HeJマ ウ ス の 腹 腔 内 に 注 射 し
た 。 そ の 後 経 時 的 に マ ウ ス の 生 存 率 を 算 定 し た 。
結 果Y4 Cap+株 お よ びY4 Cap-株 全 菌 体
をSDS-PAGEで 泳 動 し た 後 、 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い て
Westernプ ロ ッ ト分 析 を 行 っ た 。Y4 Cap+株 全 菌 体 で
はMAb S5とMAb L2と の 間 に 反 応 が 認 め ら れ た の に
対 し 、Y4 Cap-株 で はMAb L2と の 間 に し か 反 応 は 認
め ら れ な か っ た 。Y4 Cap+株 お よ びY4 Cap-株 の オ
ー トク レ ー プ 抽 出 抗 原 と抗b型 血 清 との 反 応 性 を ゲ ル 内 沈 降 反 応 で 調 べ た と こ ろ 、Y4 Cap+株 オ ー トク レ ー プ 抽 出 抗 原 と の 間 に の み 明確 な 沈 降 線 が 得 ら れ、Y4 Cap-株 と の 間 に は 沈 降 線 は 生 じな か っ た 。 つ い で 、 Y4 Cap+株 の フ ェ ノ ー ル 抽 出 物 に つ い てSephadex G-200ゲ ル 濾 過 を 行 う とMAb S5と 反 応 す る 高 分 子 の ピ ー ク とMAb L2と 反 応 す る 低 分 子 の ピ ー ク が 認 め られ
た 。 しか し 、Y4 Cap-株 の フ ェ ノ ー ル 抽 出 物 で はMAb
L2と 反 応 す る ピ ー ク の み が 溶 出 さ れ た 。 さ ら にY4
Cap+株 お よ びY4 Cap-株 の フ ェ ノ ー ル 抽 出 物 を
SDS-PAGEで 泳 動 後MAb S5とMAb L2を 用 い
てWest-ernプ ロ ッ ト分 析 を 行 っ た と こ ろ 、Y4Cap+株 フ ェ ノ ー ル 抽 出 物 はMAb S5とMAb L2の 両 者 と反 応 し た 。 マ ウ ス に対 す る致 死 活 性 を 生 菌 を マ ウ ス 腹 腔 内 に 投 与 す る こ と で 調 べ た 。C3H/HeJマ ウ ス で は 、 マ ウ ス 一 匹 あ た り0.5×1010個 のY4 Cap+株 生 菌 を 投 与 す る と ほ ぼ100%の 致 死 毒 性 が 認 め ら れ た 。 しか しY4 Cap-株 で は マ ウ ス 一 匹 あ た り1×1011個 の 生 菌 を 投 与 して も 致 死 毒 性 は 全 く 発 現 さ れ な か っ た 。 考 察 今 回 我 々 はY4 Cap-株 を 分 離 し、 そ の 菌 体 表 層 構 成 成 分 に つ い て 抗b型 抗 体 お よ びY4 Cap+株 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い て 調 べ た 。 そ の 結 果 本 研 究 で 用 い たY4 Cap-株 はb型 特 異 莢 膜 多 糖 抗 原 を 欠 落 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま たY4 Cap+ 株 生 菌 は マ ウ ス の 腹 腔 内 投 与 に よ り強 い 致 死 毒 性 を 示 し た が 、Y4 Cap-株 で は 同 毒 性 が 著 し く低 か っ た 。 以 上 の 結 果 は 、A.actinomycetemcomitansのb型 特 異 莢 膜 多 糖 抗 原 が 同 菌 の 病 原 因 子 の1つ で あ る こ と を 示 唆 す る も の で あ る 。 1結論1) A.actinomycetemcomitans Y4 Cap-株 は 型 特 異 莢 膜 多 糖 抗 原 を 欠 落 し て い る こ と が 明 ら か に な っ
た 。2) C3H/HeJマ ウ ス へ の 致 死 活 性 は 、Y4 Cap+株
の 方 がY4 Cap-株 よ り強 か っ た 。3) 型 特 異 莢 膜 多 糖 抗
原 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い た 受 動 免 疫 で
演 題A-6-1010
Fusobacterium nucleatLtntより分離 した赤血球凝集 素の菌凝 集活性 広島大学歯学部歯科保存学第二講 座
○竹本俊伸,小 崎正晴 白川正治,岡 本 莫
Bacterial Aggregating Activity of Hernagglutinin Isolated from Fusobacteriunt nucleatun Department of Endodontology and Periodontology, Hiroshima University School of Dentistry
•› Toshinobu TAKEMOTO, Masaharu OZAKI, Masaharu SHIRAKAWA and Hiroshi OKAMOTO
キ ー ワ ー ド: Fusobacterium nucleatum,赤 血 球 凝集 素,共 凝 集 目的: 歯 周 病 原 因 菌 の 一 つ と考 え られて い るFuso-bacterium nucteatumは,ヒ ト細 胞 の み な らず 他 の 口腔 内 細 菌 に も付 着 す る こ とが わ か って い る。 異 種 の 口腔 内 細 菌 間 の 付 着 は,口 腔 内細 菌が プ ラ ー クを 形 成 し,歯 肉 縁 下 ポ ケ ッ ト内 へ 定 着 す る上 で 重 要 な 役 割 を 果 た す こ とが 明 らか に され て い る。 そ こで 今 回わ れ わ れ は,F.nucleatumよ り分 離 した赤 血 球 凝 集 素 を 用 い,異 種 細 菌 へ の付 着 に対 す る こ の凝 集 素 の関 与 に つ い て 検 討 を 行 った 。 材 料 お よ び 方 法; 菌 株 はF.nucleatum ATCC 10953 株 (F. n.) お よ びstreptococci標 準株12株 を 用 い た。 F. n.はGAM培 地 中 で,嫌 気 的 条 件 下37℃,48時 間, streptococciは ブ レ イ ンハ ー トイ ンフ ユ ー ジ ョン培 地 中 で37℃,14時 間 培 養 を 行 った後 集菌 し,0.15M NaClを 含 む10mMリ ン酸 塩緩 衝 液 (PBS, pH7.4) で3 回遠 心,洗 浄 を 行 った, L-ア ル ギ ニ ン感 受 性 赤 血球 凝集 素 (A-HA) の分 離 は 以 下 の方 法 で 行 った 。 す な わ ち,F. n.菌 体 を 超 音 波 破 砕 した 後2% Triton X-100で 処 理 し,さ ら にプ ロ ナ ーゼP (1mg/ml) で37℃,30分 間処 理 を行 っ た。 処 理 後,25mM n-オ クチ ル ー β-D-チ オ グル コ シ ドを 含 む10mMリ ン酸 塩 緩 衝 液 (pH7.4) で 可 溶化 した後,L-アル ギ ニ ンア フ ィニ テ ィー カ ラム に添 加 し,IM NaCl を含 む 同 緩 衝 液 で 十 分 に洗 浄 後,100mM L-ア ル ギ ニ ン (Arg) で 溶 出 して 得 られ た 各 画分 をPBSに 対 して 透 析 した もの をA-HAと した。 共 凝 集 活 性,A-HAに よ る菌 凝集 活 性 お よ び それ ら の阻 害 はマ イ ク ロタ イタ ー プ レー トを用 い て 系 列 二 倍 希 釈 法 で検 討 し,阻 害物 質 と して は ア ミ ノ酸,糖 お よ びEDTAを 用 い た 。 ま た,各 菌 株 の ζ-電 位 は 顕 微 鏡 電 気 泳 動 法 に よ り,疎 水 性 はn-ヘ キ サ デ カ ンへ の 吸 着 に よ り 測 定 し た 。 結 果: F. n.とstreptococci各 菌 株 の 間 の 共 凝 集 は, 力 価 が0∼256とstreptococciの 菌 株 に よ っ て 差 が み ら れ,い ず れ もArgに よ り 強 く阻 害 さ れ た 。 ま た, 共 凝 集 が 陰 性 の 菌 株 は,S.sobrinusで あ っ た 。A-HA ( 5μg/ml) に よ るstreptococci各 菌 株 の 凝 集 は 力 価 が0∼64で あ り,streptococciの 菌 株 で 差 が み ら れ た が,い ず れ もArgに よ り 強 く阻 害 さ れ た 。F. n.と streptococci各 菌 株 の 共 凝 集 力 価 お よ びA-HAに よ る 凝 集 力 価 と の 間 に は,強 い 正 の 相 関 が み られ た 。 し か し な が ら,streptococci各 菌 株 とF. n.の 共 凝 集 力 価 とn-ヘ キ サ デ カ ン へ の 吸 着 率 あ る い は ζ-電 位 と の 間 に は,い ず れ も相 関 関 係 は み ら れ な か っ た 。 考 察: StreptococciのA-HAに よ る 凝 集 の 特 性 は, F. n.と の 共 凝 集 の 特 性 と 同 様 で あ り,streptococci 各 菌 株 のA-HAに よ る 凝 集 力 価 とF. n.と の 共 凝 集 力 価 の 間 に は 強 い 正 の 相 関 が み られ た 。 こ の こ と か ら, A-HAがF. n.の 宿 主 細 胞,異 種 細 菌 の 両 方 に 対 す る 特 異 的 な 付 着 因 子 と して 働 い て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 結 論: (1) F. n.とstreptococci各 菌 株 の 共 凝 集 は,
Argに よ り 強 く阻 害 さ れ た 。 (2) A-HAに よ
るstrepto-cocci各 菌 株 の 凝 集 はArgで 強 く阻 害 さ れ,こ の 凝 集 力 価 とstreptococci各 菌 株 のF. n.と の 共 凝 集 力 価 の 間 に は 強 い 正 の 相 関 関 係 が み られ た 。 (3) F. N.と streptococci各 菌 株 の 闇 の 共 凝 集 力 価 と,strepto-cocci各 菌 株 のn-ヘ キ サ デ カ ンへ の 吸 着 率 あ る い は ζ-電 位 と の 間 に は,い ず れ も 相 関 関 係 は み ら れ な か っ た 。
演 題A-7-1020
Porphyromonas gingivalisリ ポ 多糖 投 与 に よ る リンパ 球 表 面 抗 原 の フ ロ ー サ イ トメ トリー に よ る解 析 ―全 身 お よび 局 所 応 答
東 日本 学 園 大学 歯 学 部 口腔 衛 生 学 教室 、札 幌 医科 大学 動 物 実 験 施 設 、愛 知 学 院 大学 歯 学 部 口腔 細 菌 学 教 室 ○磯 貝 恵 美 子 、 磯 貝 浩*、広瀬 公 治 、三 浦 宏 子 、上 田 五 男 、吉 村 文 信**
Analysis of marker expression on lymphocytes by flow cytometry in mice inoculated with LPS from Porphyromonas gingivalis---Systematic and local responses
Department of Preventive Dentistry, Higashi Nippon Gakuen University,*Division of Animal Experimentation,Sapporo Medical Collegertepartment of Microbiology, Aichi-Gakuin University
•› Emiko ISOGAI, Hiroshi ISOGAI, Kimiharu HIROSE, Hiroko MIURA, Ituo UEDA, Fuminobu YOSHIMURA
キ ー ワ ー ド: Porphyromonas gingivalis, flow cyto
metry, lipopolysaccharide, 目 的 Porphyromonas gingivalisの リ ポ 多 糖 (P-LPS) は 細 胞 壁 の 主 要 な 構 成 成 分 で あ り 、 様 々 な 生 物 活 性 を 有 し て い る 。 本 研 究 で は 局 所 お よ び 全 身 的 にP-LP Sを 投 与 し た 際 の リ ン パ 球 サ ブ セ ッ トの 変 動 の 解 析 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ っ て 試 み た 。 材 料 お よ び 方 法 1.リ ポ 多 糖 の 調 製
P.gingivalis 381株 か らhot phenol/Nater法 で 抽 出
し 、 核 酸 酵 素 処 理 お よ び 超 遠 心 法 に て 精 製 し た 。 2.投 与 方 法 P-LPSをC3H/He (雄 、6週 齢) マ ウ ス の 口 腔 粘 膜 下 (10μ9/マ ウス、1mg/ml、10μl) あ る い は 静 脈 内 (100 μg/マ ウ ス 、1mg/ml、100μl) に 投 与 し た 。2-16日 目 の 下 顎 リ ン パ 節 あ る い は 脾 臓 を 材 料 と し て 採 取 し た 。 3.免 疫 組 織 化 学 局 所 リ ン パ 節 お よ び 脾 臓 に お け るP-LPSの 局 在 を 抗P-LPS抗 体 を 用 い て 組 織 学 的 に 調 べ た 。 4.フ ロ ー サ イ トメ ト リ ー Tお よ びBリ ン パ 球 分 画 は マ ウ ス 脾 臓 お よ び 下 顎 リ ン パ 節 か ら 比 重 遠 心 法 お よ び ナ イ ロ ン ウ ー ル カ ラ ム 法 に て 得 た 。 こ れ ら を 抗Lyt-1.1、Lyt-2.1、Thy-1.2、 お よ びIa単 ク ロ ン抗 体 と 反 応 さ せ た 後 、FITC標 識 抗
マ ウ スIgGを 反 応 さ せ た 。Ig陽 性 細 胞 の 分 析 に はFITC
標 識 抗 マ ウ スIgGと 前 述 の よ う に 反 応 さ せ た リ ン パ 球
を 用 い た 。 こ れ らの 細 胞 をflow cytometory (EPICS、
Coulter Co,Ltd) に よ り 分 析 し た 。 結 果 P-LPSを マ ウ ス に 投 与 す る と 局 所 リ ン パ 節 、 脾 臓 あ るい は 肝 臓 に 多 数 のP-LPS陽 性 マ クロ フ ァー ジが 出 現 し た 。P-LPSは 観 察 期 間 中 常 に マ ク ロ フ ァー ジ内 に存 在 して い た 。局 所 リ ンパ 節 のTお よびB リ ンパ 球 サ ブ セ ッ トは著 しい 変 動 を 示 し た 。Lyt-1陽 性Tリ ンパ 球 の 割 合 は増 加 し、 そ の 状 態 を 維 持 し た 。 一方 、全 身 応 答 にお い て投 与後2日 目 に陽 性 細 胞 数 の 増 加 と蛍 光強 度 の 増 大 を示 し たが 、 その 応 答 は 再 び も との レベ ル に戻 り再 度 同 様 の 動 き を示 し た 。 この こ と はB細 胞 にお け るIg expressionが 局 所 で は 持 続 的 で あ る の に対 し 、 全身 で は初 期 のpolyclonal activati onに 関連 した 一過 性 の応 答 と後 期 の 特 異 抗 体 産 生 へ の 応 答 と に分 れ る現 象 に対 応 し て い る よ う に思 わ れ た 。 考察 成 人性 歯 周 炎 と関 連 の 深 いP.gingivalisの リポ 多 糖 は マ ウ ス の 局所 お よび 脾 臓 の リンパ 球 サ ブ セ ッ トを変 動 させ る こ とが 明 ら か に な っ た 。 この こ と はP-LP Sが リ ンパ球 に 直接 作 用 す る だ け で はな く、マ ク ロ フ ァー ジ に作 用 し 炎症 性 サ イ トカ イ ン で あ るIL-1, TNFお よびII.-6な ど を放 出 させ 間 接 的 に作 用 す る こ とも含 め た応 答 と考 え られ る 。局 所 にお け る応 答 性 と全 身 に お け る応 答 性 の違 い は 、機 能 的 役 割 が 両者 の 間 で 異 な る こ とを 示唆 して い る 。 な お 、本 菌LPS と線 毛 の 応答 性 が 異 な る こ と は歯 周 疾 患 にお け る細 菌 と宿主 の 相互 作 用 を理 解 す る う え で重 要 で あ ろ う 。 結 論 1. P-LPSは 局所 リンパ 節 、脾 臓 あ る い は肝 臓 の マ ク ロ フ ァ ー ジ 中 に長 期 に わ た り 局在 した 。 2. P-I.,PSは 局 所 と全 身 応 答 で は 異 な っ た リ ン パ 球 サ ブ セ ッ トの変 動 を も た らし た 。 3. Tリ ンパ球 サ ブ セ ッ トの変 動 は 炎 症調 節 に 、B リ ンパ 球 サ ブ セ ッ トの 変 動 は非 特 異 的 多 ク ロ ン性 抗体 産 生 と特 異抗 体 産 生 系 の2方 向性 を も っ と考 え られ た。
演 題A-8-1030
Porhromona gsinivalis菌 体 成 分 の宿 主 細 胞 に 対 す る 活 性 神 奈 川 歯 科 大 学 口 腔 細 菌 学教 室
*愛 知 学 院 大 学 歯 学 部 微 生 物 学 教 室 ○ 渡 辺 清 子 、 熊 田秀 文 、 梅 本 俊 夫 、*吉 村 文 信
Effects of bacterial components of Porphyromonas gingivalis on activation of macrophage and lymphocyte.
Department of Oral Microbiology, Kanagawa Dental College
*Departmemt of Microbiology, Aichigakuin University School of Dentistry •› Kiyoko WATANABE, Hidefumi KUMADA, Toshio UMEMOTO and *Fuminobu YOSHIMURA
<キ ー ワ ー ド>P.gingivalis、 菌 体 成 分 、 生 物 活 性 <目 的> 成 人 性 歯 周 炎 の 最 も 有 力 な 原 因 菌 と さ れ て い る Porhromonas ginivalis (以 下P.g) に 関 し て 、 多 糖 抗 原 、 外 膜 タ ン パ ク 、LPS、 お よ びFimbriae ( 線 毛) な ど の 菌 体 成 分 に つ い て 菌 株 間 で の 多 様 性 が 報 告 さ れ て お り、 吉 村 ら は 、P.g 381株 か ら 線 毛 お よ び 主 要 外 膜 タ ン パ ク で あ る75Kタ ン パ ク を 分 離 精 製 し 、 遺 伝 学 的 検 討 を 行 な う と 共 に 、 そ れ ら の 構 造 タ ン パ ク の 臨 床 応 用 へ の 有 用 性 に つ い て 報 告 し て い る 。 本 研 究 で は 、P.g 381株 か ら 調 製 し た75K膜 タ ン パ ク 、 線 毛 、LPSお よ び 可 溶 性 成 分 (SE) の マ ク ロ フ ァ ー ジ や リ ン パ 球 に 対 す る 直 接 的 な 作 用 に つ い て 、 マ イ トゲ ン 活 性 、PBA作 用 、 お よ び サ イ ト カ イ ン (IL-1、IL-6) 産 生 誘 導 能 を 検 索 し た 。 <材 料 お よ び 方 法> 1.菌 体 成 分 の 調 製: (1) 75Kタ ン パ ク ーCell en-velope画 分 をTritonで 処 理 後 、SDSに て 可 溶 化 し 、 ゲ ル 濾 過 に よ り 調 製 し た 。 ( 2) 線 毛 ― 菌 体 を 激 し く 攪 拌 す る こ と に よ り剥 離 し た 線 毛 を 、40%飽 和 硫 安 で 塩 析 し 、DEAE陰 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り精 製 し た 。 (
3) LPS-Westphal & Jannの フ ェ ノ ー ル ・水 法 に よ
り調 製 し た 。 (
4) SE-菌 体 の 超 音 波 破 砕 上 清 を 凍 結 乾 燥 し て 実
験 に 用 い た 。
2.実 験 動 物: LPS応 答 性C3H/HeN、LPS低 応 答 性
C3H/HeJマ ウ ス 或 はBALB/cお よ びBALB/c (nu/nu)
マ ウ ス を 用 い た 。 3.免 疫 生 物 活 性 の 測 定: (1) マ イ ト ゲ ン 活 性 ― マ ウ ス の 脾 細 胞 お よ び 胸 腺 細 胞 を 各 菌 体 成 分 で 刺 激 し 、 DNA合 成 の 程 度 を3H-TdRの 取 り 込 み に よ り 測 定 し た 。 ( 2) PBA作 用 ― マ ウ ス 脾 細 胞 を 各 成 分 で72h刺 激 後 、 多 ク ロ ー ン 性 の 抗 体 産 生 細 胞 数 を 溶 血 ブ ラ ッ ク 法 に よ り 計 測 し た 。 ( 3) サ イ ト カ イ ン 産 性 誘 導 能 ― 各 菌 体 成 分 で 刺 激 し たC3H/HeNマ ウ ス 腹 腔 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 培 養 上 清 を 用 い て 、IL-1活 性 は 、C3H/HeJマ ウ ス 胸 腺 細 胞 に 対 す る 増 殖 刺 激 能 を 指 標 と し て 測 定 し 、IL-6 活 性 は 、IL-6依 存 細 胞 で あ る7TD1 cellに 対 す る 増 殖 刺 激 能 を 指 標 と し て 測 定 し た 。 <結 果> 1.P.g. 381株 の75Kタ ン パ ク 、LPSお よ びSEは 、
BALB/c、BALB/c (nu/nu) 、C3H/HeNお よ びC3H/HeJ
マ ウ ス の 脾 細 胞 に 対 し て 濃 度 依 存 的 に マ イ ト ゲ ン 活 性 を 示 し た 。 特 に 、75Kタ ン パ ク は100μg/ml濃 度 で 、BALB/c (nu/nu) マ ウ ス に 対 し て 刺 激 係 数 で 10.24、C3H/HeJマ ウ ス に 対 し て11.87と 強 い 活 性 を 示 し た 。 し か し 、 い ず れ の マ ウ ス の 胸 腺 細 胞 に 対 し て も 活 性 は 認 め ら れ な か っ た 。PBA作 用 に 関 し て も 、75Kタ ン パ ク 、PSお よ びSEに 於 て 強 い 活 性 が 認 め ら れ た が 、 線 毛 は 同 様 の 作 用 を 示 さ な か っ た 。 2.IL-1産 生 誘 導 能 は 、10μg/ml濃 度 で は75Kタ ン パ ク で 最 も 強 く、 マ ウ ス マ ク ロ フ ァ ー ジ 刺 激 後24 時 間 か ら96時 間 ま で 持 続 し てIL-1産 生 誘 導 能 が 認 め ら れ た 。SEお よ びLPSに お い て は 、 陽 性 対 照 で あ るSalmonella LPSと 同 程 度 の 作 用 が 認 め ら れ 、 線 毛 で は100μg/ml濃 度 で 活 性 が 認 め ら れ た 。 3. IL-6産 生 は 、LPSお よ び 線 毛 に よ り マ ク ロ フ ァ ー ジ 刺 激48時 間 を ピ ー ク に 誘 導 さ れ た が 、75K タ ン パ ク お よ びSEに は 、 強 い 誘 導 能 は 認 め ら れ な か っ た 。 <考 察> 本 実 験 の 結 果 、P.g.の 各 菌 体 成 分 は 、 多 彩 な 免 疫 生 物 活 性 を 示 す 事 が 示 唆 さ れ た 。 特 に75Kタ ン パ ク は 、 強 い 抗 原 性 を 示 す だ け で は な く 明 ら か に マ ウ スB細 胞 マ イ ト ゲ ン と し て の 性 質 を 有 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 一 方 、 線 毛 は 直 接 リ ン パ 球 に 対 し て は 作 用 し な い も の の 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ か ら の サ イ ト カ イ ン 産 生 を 誘 導 し 、 初 期 の 免 疫 応 答 に お け る イ ン デ ュ ー サ ー に な る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 今 後 、 各 活 性 と 組 織 障 害 の 関 係 に つ い て の 検 討 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ る 。
演 題A-9-1040
Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4株 由来細 胞 質 内蛋 白の ヒ ト歯 肉線 維 芽細 胞 へ の増 殖 阻 害 につ い て
徳 島 大学 歯学 部 歯 科保 存 学 第二 講座
○ 近藤 保 、河 村 敬三 、筒 井 英 士 、片 岡 正 俊 、石 田 浩 、若 野 洋 一
Inhibition of fibroblast proliferation by intracellular protein fraction from Actinobacillus actinomycetemcomitans Y4
Department of Periodontology and Endodontology,Tokushima University School of Dentistry
Tamotsu Kondoh,Keizoh Kawamura,Hideshi Tutui,Masatoshi Kataoka,Hiroshi Ishida Yohichi Wakano
キ ー ワ ー ド
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyrom-onas ginivalis, Escherichia coli,線 維 芽 細 胞 増 殖 抑 制 (目的) Actinobacillus actinomycetemcomitansは 、限局 型 若 年 性歯 周 炎患 者 の歯 周 ポ ケ ッ トか ら高 頻度 に分離 さ れ た こ とか ら 、 そ の主 要 な原 因菌 と して 理解 され て き た 。 しか しな が ら 、最 近 、成 人 型 歯 周 炎 の歯 周 ポ ケ ッ ト中 に も 同菌 種 の 存在 す る こ とが 明 らか にな って お り 現 在 で は 、Porphyromonas gingivalisと 共 に 、成 人型 歯 周 炎 の 病 原菌 の一 つ と考 え られ て い る。A.actinom-ycetemcomitansの 歯 周 炎 の病 原 因子 と しては 、 ロ イコ トキ シ ン、 莢膜 、線 維 芽 細 胞 増 殖 抑 制 因 子 な ど が報告 さ れ て い る 。 今 回 、我 々 は 、線 維 芽 細 胞 増 殖抑 制 因子 の 分 画 を行 な い 、 この 因子 が ヒ ト歯 肉線 維 芽細 胞 の増 殖 に いか な る 影 響 を与 え る か をP.gingivalis及 びEsc-herichia coliの そ れ と比較 した の で そ の結果 を報 告 す る。 ( 材 料 と方 法) 1使 用 菌 株 及 び 培 養: A.actinomycetemcomitans Y4 株 、P.gingivalis 381株 及 びE.coli HB 101株 を用 い て GAM-brothに てlate log phaseま で培 養 し、以下 の 実 験 に供 した 。 2菌 体 の 分 画: 各 菌 株 を培 養 後 、 集菌 洗 浄 し、 それ ぞれ セル ホ モ ジナ イザ ー を用 い て菌 体 を破 壊 後 9,000Xg、45分 間 遠 心 した 。 得 られ た 上清 を、 さ ら に100,000Xg、2時 間 遠心 して 、 上 清 を細 胞 質 内画 分 (以 下S-100と 略 す) と し沈 渣 は膜 画 分 (以 下P-100と 略 す) と し実 験 に用 い た 。 また 、A.actinomyc-etemcomitans Y4株 につ い て は 、S-100に 硫 酸 ア ンモ ニ ウ ム を最 終 濃 度 が100%と な る よ うに 添 加 し、 同部 に 含 ま れ る蛋 白質 を 回収 した 。 全 て の 画 分 は 、凍 結乾 燥 試 料 と しPBSに て 適 宜 溶 解 し実 験 に供 した。 3歯 肉線 維 芽 細 胞: ヒ トの 要 抜 去 歯 の 炎症 の な い部 位 よ り抜 歯 と 同時 に歯 肉 を採 取 し、 十 分 洗浄 後 細切 し た 。10% FBS添 加DMEM培 地 中 で 歯 肉 細 切 片 よ りout-growthし た線 維 芽 細 胞 を ヒ ト歯 肉 線 維 芽 細胞 (以 下 HGFと 略す) と した。 実 験 には4∼19代 継代 した もの を用 い た 。 4各 画 分 のHGFの 増 殖 に及 ぼす 影響: 各画 分 の凍 結 乾 燥 試料 をPBSに 溶 解 し、HGF培 養 開始 時 に 、培 養 液 の1/100容 量添 加 し、3日 間 、5%CO,、95%気 相下 で HGFと 共 に インキ ュベ ー トした。 培 養終 了後 トリプ シ ン にて 細胞 を分 散 さ せ 、コ ール タ ーカ ウ ン ターに て細 胞 数 を算定 した。 (結 果) 1 P.gingivalis 381株 、E.coli HB 101株 のS-100及 びP-100は1∼100μg/ml (乾 燥重 量) の濃 度 ではHGF の増 殖 に対 す る影 響 は認 め られ な か った。 2 A.actinoinyceterncomitans Y4株 のP-100は 他 の 二 株 と同 様 にHGFの 増 殖 に対す る影 響 はみ られ なか っ た が 、S-100は 、概 ね 濃度 に依 存 して増殖 抑 制 効果 を示 し、50μg/mlで は対 照 の約70%以 上 と著 しい増 殖 阻害 が認 め られ た。 3 A.actinomycetemcomitans Y4株 のS-100を50℃30 分 間 の熱処 理 を加 えて も抑制 効 果 は ほ とん ど変化 しな か っ たが 、90℃、30分 間の熱 処 理 で は増殖 抑 制効 果 は 著 明 に低 下 した 。 4 A.actinomycetemcomitans Y4株 のS-100に 硫 酸 ア ンモ ニ ウム を最 終濃 度 が100%と なる よ うに添 加す る と 沈 渣 に増 殖 抑制 活性 が 回収 さ れた 。 ( 考察) P.gingivalis及 びA.actinomycetemcomitansは いず れ も歯 周 炎 の原 因菌 と考 え られ てい る。 しか しな が ら これ らの菌 の菌 体成 分 が歯 周組 織 を構 成 す る細胞 にい かな る影 響 を及ぼ すか を比 較検 討 した報 告 は少 な い。 本 結 果 は、 ヒ ト健康 歯 肉 由来線 維 芽 細胞 の培 養 系 にお いて 、A.actinomycetemcomitans Y4株 の細胞 質 内画 分 に増殖 抑 制 活性 が存 在 す る事 を示 した。 また 、90℃30 分 間 の熱 処 理 でほ ぼ活 性 が消 失す るこ と、 及び硫 酸 ア ンモ ニ ウム 処理 によ る蛋 白画 分 に この活 性 が 回収 され る こ とか ら、 この増 殖 抑制 因子 は細胞 質 内蛋 白で あ る と考 え られ る。 そ して、A.actinomycetemcomitansに よ る線維 芽 細胞 の増 殖 抑制 は、LPS等 の外膜 に関連 し た因 子 よ りも 、 この細 胞 質 内蛋 白 に負 う と ころが大 で あ る と示唆 さ れ る。現 在 、 この線 維 芽細 胞 増殖 抑制 因 子 を イオ ン交換 ク ロマ トグ ラ フィ ー 、ゲル ク ロマ トグ ラ フ ィー等 を用 いて さ らに精 製 を行 な い、 そ の性状 の 確 認 を行 な って いる。'
演 題A-10-1050歯 周 ポ ケ ッ ト内 運 動 性 桿 菌 の 病 原 性 に関 す る研 究 ― 菌 体 成 分 お よ び 産 生 物 の 細 胞 障 害 性 ― 神 奈 川 歯 科 大 学 口 腔 細 菌 学 教 室 ○ 山地 矢 須 子,渡 辺 清 子,熊 田 秀 文,梅 本俊 夫
Pathogenic potentials of motile rods in periodontal pocket -Effect of cell components and products from Selenomonas
sputigena and Wolinella recta on the proliferation and viability of human epithelial cell and periodontal
ligamentfibroblast-Department of Oral Microbiology Kanagawa Dental College
○ Yasuko YAMAJI, Kiyoko WATANABE, Hidefumi KUMADA and Toshio UMEMOTO
<キ ー ワ ー ド>Selenomonas sputigena、 Wolinella recta、 歯 根 膜 線 維 芽 細 胞 、 上 皮 細 胞 、 細 胞 障 害 性 <目 的> 成 人 性 歯 周 疾 患 の 病 原 菌 と し てPorphyromonas ( Bacteroides) gingivalisが 最 も 注 目 さ れ て い る が 、 一 方 で は 、 歯 周 病 の 進 行 に 伴 っ て 病 的 歯 周 ポ ケ ッ ト内 の 運 動 性 桿 菌 の 比 率 が 著 し く 増 加 す る こ と か ら 、 運 動 性 桿 菌 の 病 原 的 意 義 も 注 目 さ れ て い る 。 し か し 、 そ れ ら の 病 原 因 子 に つ い て は 、 ほ と ん ど 明 ら か に さ れ て い な い 。 本 研 究 で は 、 歯 肉 縁 下 細 菌 叢 中 の 代 表 的 な 運 動 性 桿 菌 で あ るSelenomonas sputigenaお よ び Wolinella rectaの 菌 体 成 分 お よ び 産 生 物 の 歯 周 組 織 細 胞 に 対 す る 障 害 性 を 検 討 す る 目 的 で ヒ ト 歯 根 膜 線 維 芽 細 胞 (HPLF) お よ び ヒ ト歯 肉 癌 由 来 上 皮 細 胞 (Ca9-22) に 対 す るDNA合 成 抑 制 作 用 お よ び 細 胞 致 死 作 用 に つ い て 測 定 し た 。 <材 料 お よ び 方 法> 1、 細 胞 刺 激 標 品: 培 養 細 胞 の 刺 激 に は 、 菌 体 成 分 と し てS.sputigena ATCC 33150、K6お よ び
W.recta ATCC 33238の 菌 体 破 砕 上 清 (SE) とLPS、 産
生 物 と し て 培 養 上 清 お よ びS.sputigenaの 終 末 代 謝 産 物 で あ る プ ロ ピ オ ン 酸 を 供 試 し た 。 2、DNA合 成 抑 制 作 用 の 測 定: 5×105cells/mlに 調 整 し た 細 胞 浮 遊 液 を100μlず つ96穴 マ イ ク ロ プ レ ー ト に 播 種 し 、37℃ 、5% CO2条 件 下 で4時 間 培 養 後 、 非 付 着 細 胞 を 除 去 し た 後 、 各 標 品 を 添 加 し た 。 48時 間 培 養 後 [3H] TdRを 添 加 し 、 さ ら に24時 間 培 養 し て 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー に て [ 3H] TdRの 取 り 込 み 量 を 測 定 し、 無 刺 激 群 と 比 較 し た 。 3、 細 胞 致 死 作 用 の 測 定: DNA合 成 抑 制 作 用 と 同 様 に 各 細 胞 浮 遊 液 に 各 標 品 を 添 加 し 、48時 間 培 養 後 、 プ レ ー ト に 付 着 し た 細 胞 を ト リ プ シ ン で 剥 離 し て 、 血 球 算 定 盤 を 用 い て 生 存 細 胞 数 を 測 定 す る こ と に よ り 、 細 胞 致 死 作 用 を 判 定 し た 。 <結 果> 1、DNA合 成 抑 制 作 用: S.sputiganaお よ び W.rectaのSEと 培 養 上 清 は 、 い ず れ の 細 胞 に 対 し て も 濃 度 依 存 的 にDNA合 成 抑 制 作 用 を 示 し た が 、 LPSは 抑 制 作 用 を 示 さ な か っ た 。 2、 細 胞 致 死 作 用: W.rectaの 培 養 上 清 、SE、LPS は と も にHPLFに 対 し て 濃 度 依 存 的 に 致 死 作 用 を 示 し た が 、LPSはCa9-22に 対 し て100μg/ml濃 度 で も 致 死 作 用 は 示 さ な か っ た 。S.selenomonasの 培 養 上 清 は 、 濃 度 依 存 的 に 強 い 致 死 作 用 を 示 し た がSE とLPSはHPLFに 対 し て は 致 死 作 用 を 示 し た がCa9-22に 対 し て は 、 効 果 を 示 さ な か っ た 。 3、S.selenomonasの 培 養 上 清 中 に 含 ま れ る プ ロ ピ オ ン 酸 濃 度 で い ず れ も 細 胞 に お い て も100%の DNA合 成 抑 制 お よ び 細 胞 致 死 作 用 が 認 め ら れ た 。 <考 察> S.sputigenaの 培 養 上 清 で は 、 い ず れ の 細 胞 に 対 し て も 濃 度 依 存 的 にDNAの 合 成 抑 制 お よ び 細 胞 致 死 作 用 が 認 め ら れ た が 、 そ の 作 用 は 、 培 養 上 清 中 に 含 ま れ る プ ロ ピ オ ン 酸 に 起 因 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 尚 、 培 養 上 清 のpHの 影 響 に つ い て は S.sputigenaで5.7,W.rectaで は 、7.1で い ず れ も 100%のDNAの 合 成 抑 制 お よ び75%の 細 胞 致 死 作 用 を 示 す こ と か ら 必 ず し もpHの 影 響 に よ る も の と は 考 え ら れ な い 。 ま た 主 と し て 菌 体 可 溶 性 タ ン パ ク か ら 構 成 さ れ て い るSEは 両 細 胞 に 対 し て ほ ぼ 濃 度 依 存 的 にDNA合 成 抑 制 お よ び 細 胞 致 死 作 用 を 示 し た が 、LPSは 、 い ず れ の 細 胞 に 対 し て も 顕 著 な 障 害 作 用 は 示 さ ず 、 む し ろ 細 胞 に 対 し て 増 殖 促 進 的 に 作 用 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 尚 、 本 研 究 で 用 い た 各 刺 激 標 品 の 濃 度 は そ の ま ま ポ ケ ッ ト 内 で の 濃 度 を 表 し て い る わ け で は な く 実 際 よ り か な り 高 濃 度 で あ る こ と か らDNA合 成 抑 制 や 細 胞 致 死 作 用 が 強 く 現 れ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。 今 後 ポ ケ ッ ト内 で の 濃 度 を 考 慮 し て 検 討 し て い く 必 要 が あ る と 考 え ら れ る 。
演 題A―11-1100
歯 周 病 原 性 細 菌 の 抗 原 性 タ ンパ ク質 に 関 す る研 究 (IID
―Actinobacillus actinomycetemcomitans (Y4) 菌 体 外 産 物 の 抗 原 性 タ ン パ ク質 に つ い て― 長 崎 大 学 歯 学 部 歯 科 保 存 学 第 二 講 座*口 腔 細 菌 学 講 座
○ 谷 真 彦,谷 芳 子,小 林 浩 明*,山 田 毅*,加 藤 伊 八
Study on antigenic proteins of periodontopathic bacteria (IH) -Antigenic protein of A . a (Y4) culture
extract-Department of Periodontology and *Oral Bacteriology, Nagasaki university School of Dentistry
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Masahiko TANI, Yoshiko TANI, *Hiroaki KOBAYASHI, *Tsuyoshi YAMADA, Ihachi KATO
キ ー ワ ー ド: Actinobacillus actinomycetemcomitans, 菌 体 外 産 物,二 次 元 電 気 泳 動 目 的 歯 周 炎 の 発 症 と進 行 に は 歯 肉 縁 下 プ ラ ー ク の 幾 つ か の 細 菌 が 関 与 し て い る と考 え ら れ 、 近 年 そ れ ら の 細 菌 と 宿 主 側 と の 免 疫 反 応 に つ い て も 着 目 さ れ て い る 。 我 々 は 歯 周 炎 に 特 有 の 抗 原 性 タ ン パ ク 質 の 検 索 を 目 的 と し 、 第32回 歯 科 基 礎 医 学 会 総 会 と 第33回 秋 季 日 本 歯 周 病 学 会 総 会 に お い て 、Actinobacillus
actino-mycetemcomitans (Y4株) 、Bacteroides gingivalis (38
1株) 菌 体 に 対 す る 健 康 人 お よ び 重 度 歯 周 炎 患 者 のIg Gの 反 応 に つ い て 報 告 し た 。 今 回 、 二 次 元 電 気 泳 動 法 を 用 い て 、A. a (Y4株) の 菌 体 外 産 物 に 対 す る 健 康 人 お よ び 重 度 歯 周 炎 患 者IgGの 反 応 に つ い て 検 索 し た 。 材 料 お よ び 方 法 1. IgGの 採 取 健 康 人 と 重 度 歯 周 炎 患 者 か ら 末 梢 血 を 採 取 し血 清 を 分 離 後 、 ア フ ィ ニ テ ィ ー カ ラ ム (MAbTrapG (R) ) に てIgG を 精 製 し た 。 2.菌 体 外 産 物 の 抽 出
A. a (Y4株) の 単 コ ロ ニ ー をTodd-Hewitt broth透 析
培 地 に て37℃ 、4日 間 嫌 気 培 養 し た 。 そ の 培 養 上 清 を 硫 安 沈 殿 し た 後 、 透 析 し 濃 縮 し て サ ン プ ル と し た 。 3.抗 原 性 タ ン パ ク 質 の 抽 出 ま ず サ ン プ ル を100℃,5minで 可 溶 化 処 理 し 、SDS-PAGEを 行 い タ ン パ ク 質 バ ン ドの 泳 動 パ タ ー ン を 確 認 し た 。 次 に サ ン プ ル を37℃,30minで 可 溶 化 処 理 し 二 次 元 電 気 泳 動 を 行 っ た 。 ゲ ル 上 の タ ン パ ク 質 をWestern blot法 を 用 い てPVDF膜 に 転 写 し 、 ヒ トIgG (約130-140μ g/ml; 血 清100倍 中 のIgG量 に 相 当) と ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 標 識 抗 ヒ トIgヒ ツ ジIgGを 反 応 さ せ た 。 結 果 1. SDS-PAGEの 結 果 ク マ ジ ー ブ ル ー 染 色 の 結 果 、12本 の タ ン パ ク 質 バ ン ドが 見 ら れ 、 な か で も37,19kDaの バ ン ドが 濃 染 し た 。 こ れ ら は 西 原 ら (1986) の 結 果 と ほ ぼ 同 様 で あ っ た 。 2.二 次 元 電 気 泳 動 の 結 果 銀 染 色 の 結 果 、 図 に 示 す よ う に 少 な く と も50個 以 上 の タ ン パ ク 質 ス ポ ッ トが 認 め ら れ た 。 3. Western blot法 の 結 果
図 の ス ポ ッ トA (50kDa) は 全 被 検 者IgGに 対 し て 発
色 し た 。 健 康 人IgGに 対 し て 発 色 し た ス ポ ッ トはAを 含 む1-2個 で あ っ た が 、 重 度 歯 周 炎 患 者IgGに 反 応 し た ス ポ ッ トは5-10個 認 め ら れ 、 特 に ス ポ ッ トB (37kDa ) , C (35kDa) に つ い て は ほ と ん ど の 重 度 歯 周 炎 患 者IgG に 反 応 し た 。 考 察 お よ び 結 論 今 回 、A. a (Y4株) の 菌 体 外 産 物 に 対 す る 健 康 人 と 重 度 歯 周 炎 患 者IgGの 反 応 を 調 べ た 結 果 、 健 康 人IgGと 反 応 す る タ ン パ ク 質 ス ポ ッ トは1-2個 で 、 重 度 歯 周 炎 患 者IgGに 反 応 す る ス ポ ッ トは5-10個 認 め ら れ た 。 特 に ス ポ ッ トAは 全 被 検 者IgGに 対 し て 反 応 し た が 、 ス ポ ッ トB,Cは 重 度 歯 周 炎 患 者IgGに の み 反 応 し た 。 こ れ ら の タ ン パ ク 質 は 歯 周 病 に お け るA. a (Y4株) の 抗 原 性 を 考 え る 上 で 興 味 深 い タ ン パ ク 質 と思 わ れ る 。
演 題A-12-1120ヒ ト歯齦 縁 下 プ ラー クの超 微 形 態学 的研 究 (そ の 、)
東京 歯 科大 学歯 科 保存 学 第II講 座 ○ 山 田善裕 、山 田 了、佐 藤徹 一 郎 、石川 達 也
Ultrastructural Studies of Subgingival Plaque in Man (Part 1) Department of Periodontics,Tokyo Dental College
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Yoshihiro YAMADA, Satoru YAMADA, Tetsuichiro SATO and Tatsuya ISHIKAWA
キ ー ワ ー ド: 歯 齦 縁 下 プ ラ ー ク 、TEM 目的: 歯 周 疾 患 の 成 立 とそ の 進 行 には 歯 齦 縁 部 歯 垢 や 歯 周 ポ ケ ッ ト内 に生 息 して い る細 菌 が 深 く関 与 し て い る こ とは 種 々 な る 細 菌 学 的 研 究 よ り明 確 に さ れ て き た 。 深 い 歯 周 ポ ケ ッ ト内 に 存 在 す る プ ラ ー ク に 関 して は 、 根 表 面 付 近 に 存 在 す る プ ラ ー ク と歯 周 ポ ケ ッ ト上 皮 付 近 に存 在 す る プ ラ ー ク と にわ け られ る 。 特 に ポ ケ ッ ト上 皮 層 付 近 に 存 在 す る プ ラ ー クが 歯 周 疾 患 の 病 態 に深 く関 与 して い る こ と が報 告 さ れ て い る 。 しか し、 ヒ トの歯 周 ポ ケ ッ ト内 プ ラー ク 、 特 に上 皮 層 付 近 には い か な る 細 菌 が 分 布 し、 上 皮 細 胞 と関 与 し て 歯 齦 の組 織 内 に 影 響 を 及 ぼ す か に 関 して は 、 い ま だ 不 明 な 点 が 認 め られ る 。 今 回 、 ヒ ト歯 周 ポ ケ ッ ト内 プ ラ ー ク 、特 に上 皮 層 付 近 の プ ラ ー ク を検 索 す る に あ た り 、 上 皮 層 と 付 近 の プ ラー ク を 一 塊 と して 採 取 し、 更 に こ の 両 者 の 位 置 的 関 係 を 正 確 に再 現 す る検 索 法 に 重 点 を 置 き、 さ ら に 、 一 部 ヒ ト歯 周 ポ ケ ッ ト内 の 上 皮 層 に 関 与 す るプ ラ ー ク を 超 微 形 態 学 的 に検 索 して 得 た こ と を 報 告 す る 。 材 料 と方 法: 被 験 部 位 は過 去6カ 月 以 内 に 抗 生 物 質 の 投 与 を 受 け て い な い成 人 性 歯 周 炎 に罹 患 した 患 者 で 、 抜 歯 予 定 の3週 間 以 上 前 に 臨 床 検 査 を 行 い 、 予 後 不 良 と診 断 さ れ た 歯 牙 を対 象 と し た。 ま た 、 ポ ケ ッ トの 深 さ が6mm以 上 の 患 者 に つ い て検 索 した 。 被 験 歯 に関 して は抜 去 予 定 歯 を 中 心 に 周 囲 歯 周 組 織 と 完 全 に離 断 さ れ た こ と を確 認 し た後 、 注 意 深 く歯 齦 と一 塊 に して 抜 歯 し た。 そ の 後 、0.1M 燐 酸 緩 衝2%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド-2.5%グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド (pH7.4) に て24時 間 浸 漬 固 定 した 。 固 定 後 、overnightで0.1M燐 酸 緩 衝 液 に て 洗 浄 を 行 っ た後 、0.1M燐 酸 緩 衝2% OsO4に て4時 間 、 後 固 定 を 行 っ た。 そ の 後 段 階 的 に30%か ら濃 度 を 上 昇 さ せ て い っ たethanolに て 脱 水 を 行 い 、 置 換 剤 と し て、 QY-1を 用 いてEpon 812に て 一 次 包 埋 を 完 了 した 。 48時 間60℃ に て 重 合 後 に、 歯 牙 一歯 齦 を 一 塊 と し て約2mm幅 に歯 軸 に対 して 垂 直 に ダ イ ヤ モ ン ドデ イ ス ク に て ト リ ミ ング を行 っ た 。 そ の ブ ロ ッ ク を10 % EDTA-2Na溶 液 にて3週 間 脱 灰 を行 っ た。 脱 灰 後 、 再 度 段 階 的 にethanolに て 脱 水 、QY-1に て 置 換 後 、 Epon 812に て 二 次 包 埋 を 行 っ た 。48時 間 、60℃ に て重 合 後 、LKB 2088 (V型) 超 ミ ク ロ トー ム を 用 い て 、 ガ ラ ス ナ イ フ に て 準 超 薄 切 片 を 作 製 後 、 プ ラー ク と上 皮 が 位 置 移 動 を 起 こ して いな い と思 わ れ る部 位 を 対 象 に ダ イ ヤ モ ン ドナ イ フ に て 超 薄 切 片 を作 製 し、 酢 酸 ウ ラ ン ・ク エ ン酸 鉛 二 重 電 子 染 色 を施 して 、 日 立 社 製H-600型 電 子 顕 微 鏡 に て観 察 撮 影 した 。 結 果: 6mm以 上 の 、 ボ ケ ッ ト底 部 付 近 の歯 根 面 に位 置 す る プ ラ ー ク の 、 細 菌 は 密 に 凝 集 し、 付 着 して い る 。 グ ラ ム 陰 性 菌 を主 体 と して お り形 態 的 に は 比 較 的 大 型 の 桿 菌 、 線 状 菌 が 認 め られ た 。 細 菌 は そ の 多 くが 変 性 し、 石 灰 化 を 開 始 して い た。 上 皮 側 に接 近 す る プ ラ ー ク で は 集 団 化 して い る細 菌 だ け で な く、 細 菌 間 は ラ フ に種 々 の 方 向 に 分 散 して 配 列 し た。 細 菌 の種 類 は グ ラ ム 陰 性 桿 菌 、 球 菌 、 ス ピ ロ ヘ ー タ 、 線 状 菌 が 認 め られ た。 特 に上 皮 側 最 表 層 付 近 は 桿 菌 、 ス ピ ロヘ ー タ が 主 に 確 認 さ れ た 。 さ ら に こ の 領 域 で は 細 胞 分 裂 途 中 の 細 菌 も確 認 さ れ た。 上 皮 表 層 には 炎 症 性 細 胞 の 密 な 層 が 認 め られ た 。 炎 症 性 細 胞 は そ の 多 くが 多 形 核 白血 球 で あ り、 プ ラ ー ク 層 に 接 して 存 在 す る 白 血 球 は 、 破 壊 して い る も の 、 細 胞 質 中 に細 菌 を取 り込 ん で 、 貪 食 中 の も の な ど種 々 の 形 態 を示 して い た。 考 察 お よ び 結 論: 今 回 の 研 究 で は 、 成 人 性 歯 周 炎 に お け る ポ ケ ッ ト内細 菌 に 関 し て 上 皮 層 と関 連 す る 細 菌 性 プ ラ ー ク間 に は ほ とん どの 場 合 、 炎 症 性 細 胞 、 特 に多 形 核 白血 球 の 遊 走 が 確 認 さ れ 、 そ れ が 層 を成 して お り、 歯 周 ポ ケ ッ ト上 皮 へ の 直 接 関 与 し て い る細 菌 は 少 な か っ た 。 ま た 、Saglieら が 述 べ て い る よ う な 歯 周 組 織 内 へ の 細 菌 侵 入 も確 認 で き な か っ た 。 今 後 さ ら に症 例 数 を増 や し、 検 索 を 続 け て い く 予定 で あ る 。
演 題A-13-1130
多形 核 白血 球 の 活 性 酸 素 産 生 能 及 び
貪 食 能 か らみ た歯 周 病 関 連 細 菌 の検 索
新 潟 大 学 歯 学 部 歯 科 保 存 学 第2教 室 ○ 小 林 哲 夫,田 井 秀 明,原 耕 二
Oxidative Burst and Phagocytosis of Polymorphonuclear Leukocytes Stimulated by Periodontitis-related Bacteria.
Department of Periodontology, Niigata University School of Dentistry
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Tetsuo KOBAYASHI, Hideaki TAT, Kohji HARA
キ ー ワ ー ド: 多 形 核 白 血 球,歯 周 病 関 連 細 菌, 活 性 酸 素 産 生 能, [ 目 的] 近 年,多 く の 歯 周 ポ ケ ッ ト内 細 菌 叢 の 検 索 に よ り 歯 周 病 の 発 症 ・進 行 に 特 定 の グ ラ ム 陰 性 桿 菌 の 検 出 率 が 深 く 関 わ っ て い る こ とが 明 ら か に さ れ て い る 。 ま た,歯 周 ポ ケ ッ ト内 で 第1次 的 防 御 機 能 を に な う 多 形 核 白 血 球 (以 下PMNL) は 歯 周 病 発 症 機 序 と 密 接 な 関 連 が あ る と い う 点 で 極 め て 重 要 視 さ れ て い る 。 今 回 我 々 は,上 述 し た 各 種 歯 周 病 関 連 細 菌 が PMNL の 細 胞 内 活 性 酸 素 産 生 能 及 び 貪 食 能 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た の で 報 告 す る。 [ 材 料 及 び 方 法] 1) 各 種 細 菌 培 養 上 清 の 調 製; 歯 周 病 関 連 細 菌 と し て Bacteroides gingivalis 381 (Bg) , Bacteroides intermedius ATCC 33563 (Bi) ,
Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 (Fn) , Wolinella recta ATCC 33238 (Wr) ,
対 象 菌 と し てStreptococcus sanguis ATCC
10556 (Str) を 用 い た 。 培 養,遠 心 の 後,上 清 を 採 取,PBSに 透 析 し て 使 用 し,蛋 白 量 はLowry法 に て 測 定 し た 。 2) PMNLの 調 製; 健 常 成 人12名 の ヘパ リン加 末 梢 血 を Dextran及 びFicoll-paqueを 用 い て 分 離 後 低 張 溶 血 しPBSに てlxlO6cells/mlに 調 製 し た 。 3) 細 胞 内 活 性 酸 素 産 生 能 の 測 定; Bassら1) の 方 法 に 準 じDCFH-DAを 用 い フローサイトメトリーに よ り以 下 の 3つ の 実 験 を 行 っ た 。 Ex. 1 PMNL+培 養 上 清 (37℃,60min)
Ex. 2 Ex. 1ぞ妾}こPNA刺 激 Ex. 3 Ex. 1ぞ妾 すこfMLP刺 激 4) PMNLの 貪 食 能 の 測 定; HTC標 識 し たポ リスチレン粒 子 ( 2um,Polyscience Inc) を 用 い,フ ローサイト潜 り一に よ っ てEx. 1と 同 様 の 実 験 を 行 い 貪 食 率,貪 食 度 を 測 定 し た 。 [ 結 果] 1) Ex. 1; 培 地 の み (以 下Med) の 場 合 と 比 べ 有 意 に PNNL細 胞 内 活 性 酸 素 産 生 量 はBg,Bi,Str上 清 に よ っ て 増 加 し,特 にBg上 清 で は 約6倍 の 増 加 が 認 め ら れ た 。 ま た,貪 食 能 はBg上 清 に よ っ て 唯 一 Medよ り 低 下 傾 向 を 示 し た 。 逆 にBi,Str上 清 は 有 意 にPXNLの 貪 食 能 を 増 加 さ せfMLP様 の 反 応 を 示 し た。 2) Ex. 2; Bg,Bi,Str上 清 に よ って 前 処理 され た PMNLの 活 性酸 素 産 生 量 はPMA刺 激 に よっ て更 に 減 少 し た。 特 にBg上 清 によ り約30%減 少 したが Medと の 比 較 で は依 然 産生 量 は高 か った。 3) Ex. 3; Bg上 清 で 前 処 理 さ れ たPMNLはfMLP刺 激 を 受 け る と更 に産 生 量 が 減少 した。 しか しMedと 比 べ る と活 性酸 素 産 生 量 は高 か っ た。 [ 考 察] PMNLの 殺 菌 能 の検 索 法 と して は これ まで,1シミノー・1b 依存 性 の化 学発 光 (ケミルミネッセンス) を指 標 に した報 告 が 多 く,米 田 らはBg上 清 の 前処 理 に よ ってPMNLの ケミルミネッセンス反 応 が 抑制 され る こ とを報 告 して い る。 今 回 の 実験 結 果 で は歯 周 病 関 連細 菌 の 中 で も特 に Bg上 清 中 にPMNLの 活性 酸 素 産 生 を増 大 させ る因 子 が 存 在 す る こ とを 示唆 してい る。 ま た,Bg上 清 の 前 処 理 後 にPMA,fMLPい ず れ の 刺激 に よ っ ても活 性 酸 素 産 生量 が コントロールに比 べ 有 意 に 高 か っ た こ とか らBg上 清成 分 はPMNLに 付 着 し持続 的 に刺 激 して い る こ とが推 測 され る。 こ の よ うに ケミルミネッセンス反 応 と 異 な る結果 が 生 じ た原 因 につ い て 詳 細 は検 討 中 で あ るが,お そ ら くは本 実験 の 活 性 酸 素産 生 能 の 検 索 法 が フローサイトメトワーによ るDCFH-DA oxidationを 利用 した もの で,PMNLの 細 胞 内 に産 生 され た活 性 酸 素 と りわ け過酸 化 水 素 を検 出 し た ため で は な いか と 考 え られ る。 一方,貪 食 能 で はBg上 清 の みが 唯 一 コントロールよ りPMNLの 貪 食 率,貪 食 度 を 共 に低 下 させ た。 この こ とはBg上 清 が 歯周 炎 発 症 の過 程 で何 ら か の 影 響 を及 ぼ してい る 可能 性 が 考 え られ る。 ま たBi,Str上 清 の み が 何 故fMLP様 の 反応 を示 し た のか 詳 細 につ い て は現 在 検討 中で あ る。 今 後はBg 上清 に よ ってPMNL細 胞 内 に多 大 に産 生 され る活 性 酸 素 が す べ て殺 菌 に関 与 して い るの か,あ る いは 殺 菌 以 外 に も何 か重 要 な 役 割 を果 た して い るの か この 点 につ い て更 な る検 索 を続 けて い く予 定で あ る。 [参考 文 献 〕
1) Bass D. A. et. al.: J Immunol, 130: 1910-1917, 1983.
