High Mobility Group Box 1 (HMGB1) が培養ヒト歯根膜細胞に与える影響

原

著

High Mobility Group

Box 1(HMGB1)が

培 養 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に 与 え る 影 響

Effect of High Mobility Group Box 1 (HMGB1)

in Cultured Human Periodontal Ligament Cells

HASEGAWA Nami

Section of Periodontology, Department of Hard Tissue Engineering, Division of Bio-Matrix, Graduate School, Tokyo Medical and Dental University

(Chief and Director: Prof. IZUMI Yuichi)

The periodontal ligament (PDL) is a fibrous connective tissue that exists in the cementum and the alveolar bone. Periodontitis is a chronic inflammatory disease that is caused by a bacterial infection in the periodontal region. This infection increases the production of inflammatory cytokines and causes the destruction of periodontal tissue.

High mobility group box 1 (HMGB1) is a nuclear nonhiston DNA-binding protein that is present in many eukaryotic cells. HMGB1 is released actively from macrophages and monocytes stimulated by lipopolysaccharide or tumor necrosis factor-a and passively from damaged cells and necrotic cells. Extracellular HMGB1 signals through a specialized receptor for advanced glycation end products (RAGE), toll-like receptor 2 (TLR2), and toll-like receptor 4 (TLR4). According to a recent report, HMGB1 is of concern in periodontitis. The purpose of this study was to examine the effect of HMGBI in PDL cells.

To investigate RAGE, TLR2 and TLR4 mRNA in PDL cells, reverse transcript-polymerase chain reaction experiments were performed. PDL cells were stimulated with HMGB1, with or without anti-RAGE, TLR2 and TLR4 antibodies. IL-6 and IL-ll production was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay, and mRNA expression was quantified by real-time PCR.

PDL cells expressed RAGE, TLR2 and TLR4 mRNA. Production and mRNA expression of IL-6 and IL-11 were augmented in PDL cells stimulated with HMGB1. In addition, they were also suppressed by anti-RAGE, TLR2 and TLR4 antibodies.

In conclusion, PDL cells produce IL-6 and IL-11 in response to HMGB1 via RAGE, TLR2 and TLR4.

I.緒 言 歯 根 膜 は 歯 槽 骨 とセ メ ン ト質 の 間 に介 在 して い る線 維 性 結 合 組 織 で あ り,歯 を顎 骨 に 固 定 す る と とも に,咬 合 圧 を緩 衝 す る重 要 な役 割 を担 っ て い る。 さ ら に,歯 へ の 栄 養,恒 常 性 の 維 持,お よ び損 傷 した 組 織 の 修 復 に も関 与 して い る1)。歯 根 膜 細 胞 は,こ の 歯 根 膜 組 織 を 構 成 す る主 た る細 胞 群 で あ り,線 維 芽 細 胞 に 類 似 した 形 態 を も っ て い るが,そ の性 質 ・機 能 は 大 き く異 な る。 また, 歯 根 膜 細 胞 は骨 とセ メ ン ト質 の 間 に介 在 し,そ れ ぞ れ の 細 胞 群 と密 接 な 関 係 が あ り,組 織 再 生 に関 して 重 要 な役 割 を 担 っ て い る2,3)。 歯 周 病 は,歯 周 病 原 細 菌 に よ る感 染 性 の 慢 性 炎 症 疾 患 で あ り,そ の疾 患 進 行 に は 細 菌 因子 に 対 す る個 体 の 生 体 反 応 が 大 き くか か わ っ て い る4)。歯 周 病 原 細 菌 が 歯 肉 溝 内 で 増 殖 し,歯 肉 溝 滲 出液 中 の 好 中 球 や 抗 体 で の 排 除 の 限界 を超 え る と,生 体 内 で リ ンパ 球 と単 球 を 中 心 と した 炎 症 反 応 が 惹 起 され る。 この リン パ 球 と単 球 を 中 心 と し

ト お よ び 壊 死 細 胞 か ら 放 出 さ れ たHMGB1は,receptor

for advanced glycation end products (RAGE), toll-like receptor 2 (TLR2),toll-like receptor 4(TLR4)を 介 し て 前 駆 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン と し て 働 く8∼10)。ま た,細 胞 外 のHMGB1は 敗 血 性 シ ョ ッ ク,関 節 リ ウ マ チ,ア テ ロ ー ム 性 病 変 な ど の 慢 性 疾 患 の 進 行 に 大 き く関 与 し て い る こ とが 報 告 さ れ た11,12)。HMGB1は75以 下 の ア ミ ノ酸 か ら な るA boxお よ びB boxの ドメ イ ン と,30の ア ミ

ノ 酸 か ら な る 酸 性C末 端 で 構 成 さ れ て い る13,14)。 Morimotoら15)は,歯 周 炎 の 歯 肉 溝 滲 出 液 中 お よ び 歯 肉 組 織 に お い てHMGB1の 発 現 を 確 認 し,TNF-α 刺 激 し た 歯 肉 上 皮 細 胞 か ら濃 度 ・時 間 依 存 的 にHMGB1の 放 出 が み られ,さ ら に そ の 細 胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 はp38に 依 存 した 経 路 に よ る も の と報 告 し た 。 こ れ に よ り,TNF -α 刺 激 に よ っ て 歯 肉上 皮 細 胞 か ら 放 出 さ れ たHMGB1が 歯 周 病 の 進 行 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 歯 周 組 織 に お い て,IL-6は 歯 槽 骨 吸 収 を 促 進 す る な ど の 働 き を も ち,炎 症 性 サ イ トカ イ ン と し て 知 ら れ て い る 。 ま た 近 年,IL-11は ヒ ト歯 根 膜 細 胞 の 骨 芽 細 胞 分 化 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 報 告 さ れ て い る 。 し か し な が ら,歯 根 膜 細 胞 に お け るHMGB1の 役 割 は 十 分 解 明 さ れ て い な い 。 そ こ で,本 研 究 で はHMGB1刺 激 に よ っ て ヒ ト歯 根 膜 細 胞 が 産 生 す るIL-6お よ びIL-11に 関 し て 検 討 した 。 II.方 法 1.細 胞 培 養 東 京 医 科 歯 科 大 学 歯 学 部 附 属 病 院 に 来 院 し,東 京 医 科 歯 科 大 学 大 学 院 倫 理 委 員 会 に て 承 認 さ れ た 実 験 主 旨 を 説 明 し 同 意 の 得 ら れ た 患 者 か ら 便 宜 抜 去 さ れ た 健 全 歯 よ り,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 をSomermanら16)のout growth法 に 従 い 採 取 培 養 し た 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 は,抜 去 歯 を 滅 菌 phosphate-buffered saline (PBS)に て2度 洗 浄 後,滅 菌 メ ス を 用 い て 歯 根 根 尖1/3の 部 分 よ り採 取,10%ウ シ 胎 児 血 清(FBS)含 有 α-MEM(Gibco)培 養 液 中 に て5% CO2濃 度,37度 の 条 件 下 に て 培 養 を 行 っ た 。1週 間 に2 回 培 養 液 を 交 換 し,細 胞 が コ ン フ ル エ ン ト に 達 す る 前 に 継 代 を 行 っ た 。 す べ て の 実 験 に お い て,継 代P3か らP5 の 細 胞 を 用 い た 。 2.HMGB1刺 激 条 件 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 を24穴 培 養 皿 に1×105cells/wellの 密 度 で 均 一 に 播 種 し た 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1 (Abcam)刺 激 を 行 い,6,12,18,24時 間 後 に ヒ ト歯 根 膜 細 胞 培 養 上 清 を 回 収 し た 。 ま た,受 容 体 の 阻 害 実 験 を 行 う た め 抗RAGE抗 体(Chemicon),抗TLR2抗 体 (BioLegend),抗TLR4抗 体(BioLegend)の 各 中 和 抗 体 を 添 加 し,1時 間 後 にHMGB1刺 激 を 行 い,24時 間 後 に ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 のmRNAお よ び ヒ ト歯 根 膜 細 胞 培 養 上 清 を 回 収 し た 。 3.mRNA抽 出 お よ び 逆 転 写

RNeasy Mini Kit (Qiagen)を 用 い て ヒ ト歯 根 膜 細 胞 か ら 全RNAを 抽 出 し た 。1μg全RNAをQuantiTect

Reverse Transcription (Qiagen)に て 逆 転 写 し,cDNA の 合 成 を 行 っ た 。

4.PCR

Advantage PCR Kit (BD Biosciences-Clontech)を 用 い てPCR反 応 を 行 っ た 。PCRに 用 い たRAGE,TLR2, TLR4の プ ラ イ マ ー デ ザ イ ン と ア ニ ー リ ン グ 温 度 お よ び

プ ロ ダ ク トサ イ ズ を,表1に 示 す 。35サ イ ク ル 増 幅 後, PCRプ ロ ダ ク トを1.3%TAEア ガ ロ ー ス ゲ ル に て 電 気 泳 動 を 行 い,エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド(Wako)に て 染 色 し,GENE GENIUS BIO IMAGING SYSTEM with GENE SNAP version 6.03 (Syngene)に て,PCRプ ロ

ダ ク トを 確 認 し,比 較 お よ び 検 討 を 行 っ た 。 5.Real-TimePCR法

ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 のIL-6お よ びIL-11発 現 量 の 変 化 をLightCycler system (Roche)に て,IL-6LightCycler primer set (search LC),IL-11 LightCycler primer set

(search LC)お よ びGAPDH LightCycler primer set (search LC)を 用 い てReal-Time PCR法 に よ り 検 討 し た 。LightCycler分 析 ソ フ ト ウ ェ ア に て 定 量 分 析 を 行 っ た 。

図1ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お け るRAGE,TLR2, TLR4のmRNA発 現 out growth法 に よ っ て 得 た ヒ ト歯 根 膜 細 胞 の RAGE,TLR2,TLR4のmRNA発 現 をRT-PCR法 に て 調 べ た 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お い てRAGE, TLR2,TLR4のmRNA発 現 が 認 め られ た 。 図3HMGB1刺 激 に よ る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 培 養 上 清 中 のIL-11産 生 量 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1刺 激 を 行 い,培 養 上 清 中 のIL-11産 生 量 をELISA法 に て 測 定 し た 結 果, 濃 度 ・時 間 依 存 的 にIL-11産 生 が 認 め られ た 。 6.ELlSA法 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 培 養 上 清 中 のIL-6お よ びIL-11産 生 量 をIL-6ELISA Kit(R&D Systems), IL-11 ELISA Kit (R&DSystems)を 用 い て 測 定 し た 。

7.統 計 分 析

す べ て の 実 験 は 同 じ 条 件 で3回 繰 り返 し 行 い,統 計 処 理 はStatView ver 5.0 (SAS)に て,one-way ANOVA

を 用 い て 行 っ た 。P<0.05で 有 意 差 あ り と判 定 し た 。 図2HMGB1刺 激 に よ る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 培 養 上 清 中 のIL-6産 生 量 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1刺 激 を 行 い,培 養 上 清 中 のIL-6産 生 量 をELISA法 に て 測 定 し た 結 果,濃 度 ・時 間 依 存 的 にIL-6産 生 が 認 め られ た 。 III.結 果 図1に 示 した 通 り,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お け るRAGE, TLR2,TLR4のmRNA発 現 をRT-PCR法 に て 確 認 し た 結 果,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お け るRAGE,TLR2,TLR4 のmRNA発 現 が確 認 され た 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1刺 激 を 行 い,培 養 上 清 中 の IL-6産 生 量 をELISA法 にて 測 定 した 結 果 を 図2に 示 し た 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 か ら濃 度 ・時 間 依 存 的 にIL-6産 生 が 認 め られ た 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1刺 激 を 行 い,培 養 上 清 中 の IL-11産 生 量 をELISA法 に て 測 定 し た結 果 を 図3に 示 した 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 か ら濃 度 ・時 間 依 存 的 にIL-11産 生 が 認 め られ た 。 各 受 容 体 の 中 和 抗 体 で あ る抗RAGE抗 体,抗TLR2 抗 体,抗TLR4抗 体 を 添 加 後,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に HMGB1刺 激 を 行 い,培 養 上 清 中 のIL-6お よ びIL-11 産 生 量 をELISA法 に て 測 定 した 結 果 を 図4,5に 示 し た 。HMGB1刺 激 に よ る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 か ら のIL-6お よびIL-11産 生 が 認 め られ た 。 また,各 受 容 体 の 中和 抗 体 添 加 に お け る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 か らのIL-6お よ びIL-11産 生 は 有 意 に抑 制 され た 。 さ ら に,各 受 容 体 の 中 和 抗 体 で あ る抗RAGE抗 体,抗 TLR2抗 体,抗TLR4抗 体 を 添 加 後,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に HMGB1刺 激 を行 い,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 のIL-6mRNA お よ びIL-11mRNA発 現 量 の 変 化 をRea1-Time PCR法 に て 検 討 した 。 この 結 果,図6,7に 示 す よ う にmRNA

図4各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,HMGB1刺 激 に よ る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 のIL-6産 生 量 各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1刺 激 を 行 い,培 養 上 清 中 のIL-6 産 生 量 をELISA法 に て 測 定 した 結 果,IL-6産 生 が 抑 制 され た 。 エ ラー バ ー は 平 均 値 ±標 準 偏 差 を 示 す(n=3)。 *:各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 条 件 に お い て,HMGB1単 独 培 養 群 と有 意 差 が あ る こ と を 示 す(p<0.05)。 図5各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,HMGB1刺 激 に よ る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 のIL-11産 生 量 各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1刺 激 を行 い,培 養 上 清 中 のIL-11産 生 量 をELISA法 に て 測 定 し た 結 果,IL-11産 生 が 抑 制 さ れ た 。 エ ラ ー バ ー は 平 均 値 ±標 準 偏 差 を示 す(n=3)。 *:各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 条 件 に お い て,HMGB1単 独 培 養 群 と有 意 差 が あ る こ と を 示 す(p<0.05)。 に お い て もHMGB1刺 激 に お け る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 の IL-6お よ びIL-11産 生 が 認 め られ た 。 また,各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 に お け る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 のIL-6mRNA お よ びIL-11mRNA発 現 量 は 有 意 に抑 制 され た 。 IV.考 察 HMGB1はLPSやTNF-α で 刺 激 され た マ ク ロ フ ァー ジ や モ ノ サ イ ト お よ び 壊 死 細 胞 や 損 傷 を 受 け た 細 胞 か ら 放 出 さ れ17∼20),RAGE,TLR2,TLR4を 介 し て 前 駆 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン と し て 働 くDNA結 合 タ ン パ ク で あ り8,9),慢 性 疾 患 の 進 行 に 関 与 し て い る こ と が 報 告 さ れ た10)。 HMGB1と 歯 周 炎 の 関 係 は 不 明 で あ っ た が,Morimoto ら15)は,歯 周 炎 の 歯 肉 溝 滲 出 液 中 お よ び 歯 肉 組 織 に お い

図6各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,HMGB1刺 激 に よ る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 のIL-6mRNA発 現 量

ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に 各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,HMGB1刺 激 を 行 い,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 のIL-6mRNA発 現 量 をReal-TimePCR法 に て 測 定 した 結 果,IL-6mRNA発 現 が 抑 制 さ れ た 。 エ ラ ー バ ー は平 均 値 ±標 準 偏 差 を 示 す(n=3)。 *:各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 条 件 に お い て,HMGB1単 独 培 養 群 と有 意 差 が あ る こ とを 示 す(p<0.05)。 図7各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,HMGB1刺 激 に よ る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 のIL-11mRNA発 現 量 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に 各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 後,HMGB1刺 激 を 行 い,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 の IL-11mRNA発 現 量 をReal-Time PCR法 に て 測 定 し た 結 果,IL-11 mRNA発 現 が 抑 制 され た 。 エ ラ ー バ ー は平 均 値 ±標 準 偏 差 を 示 す(n=3)。 *:各 受 容 体 の 中 和 抗 体 添 加 条 件 に お い て,HMGB1単 独 培 養 群 と有 意 差 が あ る こ とを 示 す(p<0.05)。 てHMGB1の 発 現 を 確 認 し,TNF-α 刺 激 に よ っ て 歯 肉 上 皮 細 胞 か ら放 出 さ れ たHMGB1が 歯 周 病 の 進 行 に 関 与 して い る こ と を示 唆 した 。 HMGB1の 受 容 体 と してRAGE,TLR2,TLR4が 報 告 され て い る。RAGEは 免 疫 グ ロ ブ リ ン ス ー パ ー フ ァ ミ リー の 一 種 で あ り,AGEやSl00タ ンパ クの 受 容 体 と し て も知 られ て い る。 さ ま ざ ま な細 胞 で 発 現 が 認 め られ, ホ メ オ ス タ シ ス や 発 育,炎 症 に 関 与 して い る。TLRは 多 くの病 原 体 関 連 分 子 を認 識 す るパ タ ー ン認 識 受 容 体 と して,先 天 性 免 疫 に お い て 必 須 の 役 割 を 担 っ て い る。 TLRは 現 在 ま で に10種 類 の フ ァ ミ リー が 確 認 され て お り,そ の う ちHMGB1の 受 容 体 と してTLR2とTLR4が 報 告 され て い る。TLR2は 主 に ペ プ チ ドグ リカ ン を 認 識 し,TLR4は 主 にLPSを 認 識 す る 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お い て もTLR2,TLR4の 存 在 は 確 認 さ れ て い た が,RAGEの 存 在 は 明 らか に さ れ て い な か っ た 。 今 回,RT-PCR法 に て ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お け る RAGEの 存 在 が確 認 さ れ た 。 ヒ ト歯 根 膜 細 胞 にHMGB1刺 激 を行 い,培 養 上 清 中 の IL-6お よ びIL-11産 生 量 をELISA法 に て 測 定 した 結 果,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 か ら濃 度 ・時 間 依 存 的 にIL-6お よ び IL-11産 生 が 認 め られ た 。 この こ とか ら,HMGB1刺 激

歯 根 膜 細 胞 中 のIL-6mRNAお よ びIL-11mRNA発 現 量 の 変 化 をReal-Time PCR法 に て 検 討 し た 結 果, mRNAに お い て も ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 のIL-6お よ びIL-11発 現 が 認 め られ た 。 ま た,各 受 容 体 を 阻 害 した ヒ ト歯 根 膜 細 胞 中 のIL-6mRNAお よびIL-11mRNA発 現 量 は 有 意 に抑 制 され た。 この こ とか ら,HMGB1はRAGE, TLR2,TLR4を 介 して ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お け るIL-6お よびIL-11産 生 を調 節 して い る こ とが 示 唆 され た 。 しか しな が ら,各 受 容 体 の 中和 抗 体 を1種 類 だ け で な く2,3種 類 添 加 して も,IL-6お よびIL-11産 生 に 相 加 あ るい は相 乗 効 果 は認 め られ なか っ た 。 こ の こ とか ら, ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お い てRAGE,TLR2,TLR4の 他 に HMGB1の 受 容 体 が 存 在 す る可 能 性 が 示 唆 され た 。 IL-11は 炎 症 性 サ イ トカ イ ンや 成 長 因 子,ホ ル モ ン な どに よっ て 線 維 芽 細 胞,骨 芽 細 胞,白 血 球 な ど さ ま ざ ま な細 胞 か ら産 生 され る21,22)。IL-11は,脂 質 生 成23,24)や前 駆 炎 症 性 サ イ トカ イ ン25,26),糖質 コル チ コ イ ド27)の阻 害 作 用 を もつ 多 様 性 の あ るサ イ トカ イ ン で あ る。TGF-β 刺 激 に よっ て ヒ ト歯 根 膜 細 胞 は,ヒ ト歯 肉 線 維 芽 細 胞 に 比 べ て 有 意 にIL-11を 産 生 す る22)。近 年,IL-11は ア ス コル ビ ン酸 存 在 下 に お い てI型 コ ラー ゲ ン産 生 を 引 き起 こ し,歯 根 膜 細 胞 の ア ル カ リ フ ォス フ ァ ター ゼ 活 性 を 増 加 させ る こ とが 報 告 され て い る。 こ の こ とか ら,IL-11 は ヒ ト歯 根 膜 細 胞 の 骨 芽 細 胞 分 化 に 関 与 して い る可 能 性 が報 告 され て い る28)。 今 回,タ ンパ ク レベ ル だ け で な くmRNAレ ベ ル に お い て も,HMGB1刺 激 に お け る ヒ ト歯 根 膜 細 胞 か ら の IL-6お よ びIL-11産 生 が確 認 さ れ,ま た 各 受 容 体 の 阻 害 に よ りIL-6お よ びIL-11産 生 が 抑 制 され た 。 こ の こ と か ら,HMGB1はRAGE,TLR2,TLR4を 介 して ヒ ト歯 根 膜 細 胞 に お け るIL-6お よびIL-11産 生 に 関 与 し,歯 周 組 織 の 炎 症 お よび 修 復 に 関 与 して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た。 今 後,ヒ ト歯 根 膜 細 胞 で のHMGBI刺 激 に お け る 他 の サ イ トカ イ ン産 生 を検 索 す る と と もに,歯 周 病 との 関 連 性 を検 討 して い く必 要 が あ る。 示 唆 さ れ た 。 謝 辞 本 稿 を 終 え る に あ た り,本 研 究 の ご 指 導,ご 校 閲 を 賜 っ た 本 学 歯 周 病 学 分 野 和 泉 雄 一教 授 に 謹 ん で 深 謝 い た し ま す 。 ま た,本 研 究 の 遂 行 に 際 し,終 始 ご助力,ご 指 導 お よ び ご校 閲 を 賜 っ た 小 林 宏 明 博 士,福 井 朋 恵 博士;岩 崎 剣 吾 博士 に 心 よ り深 謝 い た し ます 。 本 論 文 の 要 旨 は 第51回 春 季 日 本 歯 周 病 学 会 学 術 大 会(2008 年4月25日,大 宮)に お い て 発 表 し た。 文 献

1) Bartold, P. M.. McCulloch, C. A., et al.: Tissue engineer-ing: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontol. 2000: 24253-24269, 2000.

2) Seo, B. M., Miura, M., et al.: Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet 364: 149-155, 2004.

3) Nagatomo, K., Komaki,M., et at.: Stem cell properties of human periodontal ligament cells. J. Periodont. Res. 41: 303-310, 2006.

4) Socranskv, S. S., Haffajee, A. D., et al.: Microbial complexes in subgingival plaque. J. Clin. Periodontol. 25: 134-144,1998.

5) Graves, D. T., Jiang, V., et al.: Periodontal disease: bacterial virulence factors, host response and impact on systemic health. Curr. Opin. Infect. Dis. 13:227-232, 2000.

6) Mosevitsky, M. I., Novitskaya, V. A., et al.: Tissue specificity of nucleo-cytoplasmic distribution of HMG1 and HMG2 proteins and their probable functions. Eur . J. Biochem.185: 303-310, 1989.

7) Lu, J., Kobavashi, R., et al.: Characterization of a high mobility group 1/2 homolog in yeast. J. Biol. Chem. 271 : 33678-33685, 1996.

8) Taguchi, A., Blood, D. C., et al.: Blockade of RAGE-amphoterin signalling suppresses tumour growth and metastases. Nature 405: 354-360, 2000.

9) Taniguchi, N., Kawahara, K., et al.: High mobility group box chromosomal protein 1 plays a role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis as a novel cytokine.

Arthritis. Rheun. 48: 971-981, 2003.

10) Park, J. S., Svetkauskaite, D., et al.: Involvement of toll-like receptors 2 and 4 in cellular activation by high mobility group box 1 protein. J. Biol. Chem. 279:

7370-7377, 2004.

11) Kalinina, N., Agrotis, A., et al.: Increased expression of the DNA-binding cytokine HMGB1 in human athero-sclerotic lesions: role of activated macrophages and cytokines. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24: 2320-2325, 2004.

12) Dumitriu, I. E., Baruah, P., et al.: HMGB1: guiding immunity from within. Trends Immunol. 26: 381-387, 2005.

13) Hardman, C. H., Broadhurst, R. W., et al.: Structure of the A-domain of HMG1 and its interaction with DNA as studied by heteronuclear three- and four-dimensional NMR spectroscopy. Biochemistry 34:16596-16607,1995. 14) Weir, H. M., Kraulis, P. J., et al.: Structure of the HMG

box motif in the B-domain of HMG1. EMBO. J.12 :1311-1319,1993.

15) Morimoto, Y., Kawahara, K. I., et al.: Tumor necrosis factor-alpha stimulates gingival epithelial cells to release high mobility-group box 1. J. Periodont. Res. 43: 76-83, 2008.

16) Somerman, M. J., Archer, S. Y., et al.: A comparative study of human periodontal ligament cells and gingival fibroblasts in vitro. J. Dent. Res. 67: 66-70, 1988. 17) Wang, H., Bloom, O., et al.: HMG-1 as a late mediator of

endotoxin lethality in mice. Science 285 : 248-251, 1999. 18) Mullins, G. E., Sunden-Cullberg, J., et al.: Activation of

human umbilical vein endothelial cells leads to relocation and release of high-mobility group box chromosomal protein 1. Scand. J. Immunol. 60 : 566-573, 2004. 19) Wang, H., Vishnubhakat, J. M., et al.: Proinflammatory

cytokines (tumor necrosis factor and Interleukin 1) stimulate release of high mobility group protein-1 by

pituicytes. Surgery 126: 389-392,1999.

20) Scaffidi, P., Misteli, T., et al.: Release of chromatin protein HMGBI by necrotic cells triggers inflammation.

Nature 418: 191-195, 2002.

21) Du, X. and Williams, D. A.: Interleukin-11: review of molecular, cell biology, and clinical use. Blood 89: 3897-3908,1997.

22) Yashiro, R., Nagasawa, T., et al.: Transforming growth factor-beta stimulates interleukin-11 production by human periodontal ligament and gingival fibroblasts. J. Ciln. Periodontol. 33: 165-171, 2006.

23) Keller, D. C., Du, X. X., et al.: Interleukin-11 inhibits adipogenesis and stimulates myelopoiesis in human long-term marrow cultures. Blood 82 :1428-1435,1993. 24) Tenney, R., Stansfield, K., et al.: Interleukin 11 signaling

in 3T3-L1 adipocytes. J. Cell. Physiol. 202:160-166, 2005. 25) Trepicchio, W. L., Bozza, M., et al.: Recombinant human IL-11 attenuates the inflammatory response through down-regulation of proinflammatory cytokine release and nitric oxide production. J. Immunol.157: 3627-3634, 1996.

26) Johnson, R. B., Wood, N., et al.: Interleukin-11 and IL-17 and the pathogenesis of periodontal disease. J. Periodontol. 75: 37-43, 2004.

27) Dovio, A., Sartori, M. L., et al.: Autocrine down-regula-tion of glucocorticoid receptors by interleukin-11 in human osteoblast-like cell lines. J. Endocrinol.177:

109-117, 2003.

28) Leon, E. R., Iwasaki, K., et al.: Osteogenic effect of interleukin-11 and synergism with ascorbic acid in human periodontal ligament cells. J. Periodont. Res. 42: