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リボソームによる遺伝子導入とその分子機構

 レーザ顕微鏡 ・プローブ顕微鏡による展開 

中西 守 ・野口安里 ・川浦稚代

遺伝子治療の際の非ウイルスベクターとして,正電荷コレステロール誘導体を用いた正

電荷 リボソームを紹介する.この新しいタイプのリボソームは正電荷脂質を用いた市販の

リボソーム (

リポフェクチン)よりも遺伝子導入の効率がはるかに高かった.また,共焦

点レーザ顕微鏡と原子間力顕微鏡を用いたDNAや リボソームの画像解析からは,細胞内へ

の遺伝子導入がエンドサイトーシスで進行し,エンドソームとリボソームの膜融合の際に

DNAは リボソームから遊離し,核内へ選択的に移行していることが明らかになった.

【遺 伝 子 導 入 】 【正 電 荷 リ ボ ソ ー ム 】 【共 焦 点 レー ザ 顕 微 鏡 】

原子 間力顕微 鏡 】

は じ め に  ワ ト ソ ン と ク リ ッ ク が 遺 伝 情 報 の本 体 を 明 ら か に して か ら半 世 紀 が 過 ぎ よ う とし て い る1). 二 重 ら せ ん構 造 の発 見 は そ の 後 の 生 物 学 を大 き く変 貌 させ た . 分 子 生 物 学 や 生 命 科 学 が 新 し く誕 生 し, 生 物 学 は20世 紀 後 半 , サ イ エ ン ス の 舞 台 の 中 心 に登 場 した . と こ ろ で , 新 しい 世 紀 を 目の 前 に して , 生 物 学 は ま た 新 た な発 展 を遂 げ よ う と して い る. そ れ は, 生 物 学 が こ れ ま で の よ うな 基 礎 研 究 と して の 発 展 に留 ま らず , 疾 病 の 治 療 と い う 大 き な 目標 の も と に , 医 療 との 関 連 を よ り い っ そ う色 濃 く した もの へ と変 貌 し よ う と し て い る か ら で あ る . ゲ ノ ム 計 画 や 遺 伝 子 治 療 は ま さ に そ の よ う な特 質 を 強 く もっ た 研 究 とい え る. い まや , 分 子 生 物 学 や 生 命 科 学 の 基 礎 研 究 の 成 果 が , 疾 病 の 解 明 や 治 療 へ の 指 針 を打 ち 出 そ う と して い る よ う に み え る. しか し, 基 礎 研 究 の 成 果 が 臨 床 応 用 へ と結 び つ く まで に は, ま だ ま だ 多 くの 解 決 しな け れ ば な らな い 問 題 が 残 っ て い る. 本 稿 で述 べ る遺 伝 子 治 療 も そ の よ う な も の の ひ とつ で あ る . 遺 伝 子 治 療 は , 遺 伝 子 疾 患 だ け で な く, 癌 や エ イ ズ に も有 用 で あ る .21世 紀 の 新 し い 医 療 技 術 の ひ とつ に な る こ と は 間 違 い な い で あ ろ う. し か し, 先 天 的 な 代 謝 酵 素 の 異 常 の場 合 な ど を 除 い て , 遺 伝 子 治 療 は い ま だ に試 験 的 な医 療 技 術 の 域 を 出 て い ない2}. この問 題 を 解 決 す るひ とつ と し て , 外 来 遺 伝 子 の 安 全 か つ効 率 よ い 導 入 法 (ベ ク タ ー ) の 確 立 が 必 要 で あ る . 遺 伝 子 導 入 の 方 法 と し て は, ウ イ ル ス を 用 い る方 法 (ウ イ ル ス ベ ク タ ー 法 )と ウ イ ル ス を用 い な い 方 法 (非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー 法 ) に分 け られ る. ア デ ノ ウ イ ル ス に代 表 さ れ る ウ イ ル ス ベ ク タ ー 法 は 外 来 遺 伝 子 を比 較 的 効 率 よ く生 体 (細 胞 ) 内 に 導 入 で き る の が 特 長 で あ る. し か し, ウ イ ル ス を用 い て い る た め に , 増 殖 性 ウ イ ル ス に よ る 病 原 性 の 問 題 が 常 に 指 摘 され て い る. 一 方 , 非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー 法 は 安 全 性 に 関 す る 問題 点 は 少 な い もの の , 導 入 効 率 が ウ イ ル ス ベ ク タ ー 法 よ り も

Mamoru  Nakanishi,Ari  Noguchi,,Chiyo  Kawaura, 名 古 屋 市 立 大 学 薬 学 部 (〒467-8603名 古 屋 市 瑞 穂 区 田 辺 通3-1) [Faculty  of

Pharmaceutical  Sciences,Nagoya  City  University,Tanabe-dori,Mizuho-ku,Nagoya  467-8603,Japan]E-mail:mamoru@

phar.nagoya-cu.ac.jp

Gene  Transfection  Mediated  by Cationic  Liposomes  with  a Cationic  Cholesterol  Derivative

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リポソーム による遺伝 子導入 とその分子機構 49 は る か に低 い 欠 点 が あ る. 増 殖 性 ウ イ ル ス の 問 題 を考 え る と, 非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー の 導 入 効 率 を上 げ る 検 討 は遺 伝 子 治 療 の 基 礎 研 究 と し て た い へ ん 重 要 で あ る. さ て, 筆 者 は こ こ数 年 , 新 し い タ イ プ の 非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー の 開 発 を企 て て き た . そ れ は, 正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル を用 い た 非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー で あ る . 本 稿 で は この 新 し い タ イ プ の 非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー の 紹 介 を行 な い , 同 時 に 共 焦 点 レ ー ザ 顕 微 鏡 や プ ロ ー ブ顕 微 鏡 を 用 い て 遺 伝 子 導 入 機 構 を 追 究 し て い る研 究 の概 要 を紹 介 した い . Ⅰ . 正 電 荷 リポ ソー ム 図1  2種 類 の 正 電 荷 コ レ ス テ ロー ル 誘 導 体 の 構 造 式 誘 導 体1は 側 鎖 末 端 に ア ル キ ル 鎖 を 結 合 さ せ た 誘 導 体 の な か で最 も 導 入 効 率 が 高 い も の . 誘 導 体Ⅱ は親 水性 基 を末 端 にも っ た誘 導 体 . 血 清 の 影 響 を あ ま り受 けず ,in vivo実 験 で有 望視 され る誘 導 体 . 遺 伝 子 導 入 の 際 の非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー と し て 正 電 荷 リポ ソー ム が よ く用 い られ る. リポ ソー ム は リ ン脂 質 を水 に 懸 濁 した とき に生 じる小 胞 で ,DNAを 細 胞 内 に 導 入 す る と き の キ ャ リ ア ー (ベ ク タ ー ) と し て 利 用 で き る , い ろ い ろ な タ イ プ の 正 電 荷 リボ ソ ー ム が 知 られ て い るが ,DOTMA*1,DOSPA*2の よ うな正 電 荷 脂 質 を用 い た リ ボ ソ ー ム が 最 も よ く知 られ て い る3∼5). 正 電 荷 リポ ソ ー ム を遺 伝 子 導 入 の ベ ク タ ー と して 用 い る の は 細 胞 膜 が 負 電 荷 を帯 び て い る か ら で あ る . 正 電 荷 リ ポ ソー ム で 負 電 荷 のDNAを 包 み, 細 胞 へ の導 入 の手 助 け を す る. 正 電 荷 リ ボ ソ ー ム の 作 製 は 正 電 荷 脂 質 と DOPE*3の よ うな 中 性 リン脂 質 とを適 切 な割 合 で混 合 し て 行 な う. こ の タ イ プ の リ ボ ソー ム に は, リ ポ フ ェ ク チ ン とい う商 品 名 で す で に 市 販 され て い る もの もあ る. さ て , 筆 者 ら は正 電 荷 脂 質 の代 わ り に正 電 荷 を もつ コ レ ス テ ロ ー ル 誘 導 体 (以 下 , 正 電 荷 コ レ ス テ ロー ル ) を 用 い た 正 電 荷 リポ ソ ー ム に よ る遺 伝 子 導 入 の 研 究 を 進 め て い る . この 場 合 も, 正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル と中 性 リ ン脂 質 を 適 切 な 割 合 で 混 合 して リボ ソ ー ム を作 製 す る. この コ レ ス テ ロ ー ル を素 材 と した 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム は細 胞 毒 性 が 少 な く, 導 入 効 率 も高 い の で , 新 し い タ イ プ の 非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー とし て期 待 で き る6∼10). 参 考 まで に 図1に 筆 者 らが 用 い て い る 正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル 誘 導 体 の構 造 式 の 一 例 を 示 し た . 構 造 式1の よ う に コ レ ス テ ロ ー ル の 側 鎖 末 端 に ア ル キ ル 鎖 を 結 合 さ せ た 三 級 ア ミ ン (お よび 四 級 ア ミ ン) の 誘 導 体 を 二 十 数 種 合 成 し た . そ れ ら誘 導 体 を用 い て正 電 荷 リボ ソー ム を作 製 し, 培 養 細 胞 (NIH3T3,COS-7,HeLa) へ の 遺 伝 子 導 入 を行 な っ た . そ の 結 果 , 図1の コ レ ス テ ロー ル 誘 導 体Ⅰ を用 い た 正 電 荷 リ ボ ソー ム の 遺 伝 子 導 入 の 効 率 が 最 も高 い こ とが わ か っ た . また 同 時 に , ① 図2  正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル 誘 導 体1お よ びⅡ と リポ フ ェ ク チ ン の 遺 伝 子 導 入 効 率 を 比 較 し た グ ラ フ 実 験 に は ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺伝 子 を用 い た. 正 電 荷 リボ ソ ー ムは そ れ ぞ れ の 最 も 導 入 効 率 の よ い 条件 を用 い て 比較 した . *1  N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium  chloride *

22,3-dioleyloxy-N-[2(spermine  carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propa  naminium  trifluoroacetate

*3dioleoyl  phosphatidyl  ethanolamine

*4固 体 と液 体 の 界 面 に お け る電 位 差 の う ち界 面 導 電 現 象 に有 効 に作 用 す る電 位 の こ と. ゼ ー タ電 位 が 高 い と遺 伝 子 導 入 の効 率 が 高 く な る理 由 は, リボ ソー ム 膜 表 面 の 正電 荷 の 値 が 高 く,DNAと の相 互 作 用 と細 胞 膜 へ の 吸 着 に有 効 に働 い て い る もの と考 え られ る.

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50 蛋 白 質  核 酸  酵 素  Vol.44No.11(1999) 三 級 ア ミ ンの 誘 導 体 は 四 級 ア ミ ン の 誘 導 体 よ り も導 入 効 率 が 高 い , ② 末 端 の ア ル キ ル 基 が か さ高 くな る (大 き くな る) と導 入 効 率 が 減 少 す る, ③ 正 電 荷 リボ ソ ー ム の 表 面 電 荷 (ゼ ー タ電 位 *4)と導 入 効 率 とは よ い 相 関 関 係 を示 す , こ と な どが 明 ら か に な っ た . また , 誘 導 体1を 用 い た 正 電 荷 リボ ソ ー ム は 市 販 の リポ フェ クチ ン (正 電 荷 脂 質 よ りな る ) よ り も数 倍 高 い 導 入 効 率 が 得 ら れ た . 図2に 培 養 細 胞 へ の 遺 伝 子 の 導 入 効 率 を ル シ フ ェ ラーゼ活 性 で比 較 した結 果 を示 した (野 口 ・長 谷 川 ら : 未 発表 ). 誘 導 体Ⅰ は リポ フ ェ ク チ ン よ り も明 らか に遺 伝 子 導 入 効 率 が 高 い こ とが わ か る. 一 方, 筆 者 は コ レ ス テ ロ ー ル の 側 鎖 末 端 に 親 水 性 基 を もっ た 新 し い タ イ プ の 誘 導 体Ⅱ (図1) が 高 い遺 伝 子 導 入 効 率 を 与 え る こ と を 最 近 発 見 し た . この 親 水 性 側 鎖 末 端 基 を も った コ レス テ ロー ル 誘 導 体Ⅱ は血 清 存 在 下 で も遺 伝 子 導 入 効 率 が そ れ ほ ど減 少 せ ず , 今 後 ,in aivoで の 遺 伝 子 導 入 の 研 究 を 進 め る に あ た っ て有 用 で あ る と考 え て い る11). II, 正電 荷 リボ ソ ー ムの 形 態 プ ロ ー ブ 顕 微 鏡 は ナ ノ メ ー トル レベ ル で の 物 質 の 表 面 構 造 や プ ロ ー ブ と物 質 表 面 の 相 互 作 用 の 物 理 定 数 を 測 定 で き る12,13). そ こで , プ ロー ブ顕 微 鏡 の ひ とつ で あ る 原 子 間 力 顕 微 鏡 (AFM) を 用 い て プ ラ ス ミ ドDNA と正 電 荷 リボ ソー ム の観 察 を行 な った . 図3(a)は環 状 図3  プ ラ ス ミ ドDNAと 正 電 荷 リポ ソ ー ム 複 合 体 のAFM画 像

(a)プ ラ ス ミ ドDNA単 独 .CAT( ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル ・ア セ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ )遺伝 子 を用 い た . (b)正電 荷 リボ ソ ーム とDNA の 正 負 比 が0.6の と きの 画 イ象 複 合 体 は数 珠 状 構 造 を形 成 して い る . (c)正 負 比1.2の と きの 画 像 , 遺 伝 子 導 入 の 実 験 は この 条 件 で行 な う.DNAは 正 電 荷 リボ ソー ム で カ プセ ル化 さ れ て い る ,

図4  正 電 荷 リポ ソー ム ーDNA複 合 体 のAFM画 像

コ レス テ ロ ー ル 誘 導 体 の 違 い に よ り, 複 合 体 の サ イ ズ が 大 き く変 動 す る . 中 程 度 の サイ ズ の複 合体 (c)の 導 入 効 率 が 最 も 高 い. コ レス テ ロ ー ル 誘 導 体Ⅰ を使 用 . 小 さ いサ イ ズ (a)や 大 き いサ イ ズ (b)の複 合 体 の 導 入 効 率 は低 い.

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の プ ラ ス ミ ドDNAが 単 独 に存 在 す る ときのAFM像 で あ る. 図3(b) は正 電 荷 リボ ソーム とDNAの 正 負 比 (正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル とDNAの ヌ ク レオ チ ドの モ ル 比 ) が0.6の と き の 画 像 で あ る. また , 図3(c) は正 電 荷 リ ボ ソ ー ム とDNAの 正 負 比 が1.2の とき の画 像 で あ る . 正 負 比1.2は 遺 伝 子 導 入 に 実 際 に 使 用 して い る最 適 な 正 負 比 で あ る. 正 電 荷 リボ ソ ー ム の 量 が 少 な い と き に は , 環 状 プ ラ ス ミ ドDNA鎖 に 沿 って 図3(b) の よ うに リボ ソ ー ム が 数 珠 状 に 結 合 し て い た . 遺 伝 子 導 入 に 適 切 な 正 負 比 (=1.2)で は 図3(c) の よ う にDNAは 正 電 荷 リポ ソー ム で 覆 わ れ た (カ プ セ ル 化 ) 形 態 を とっ て い た. 正 電 荷 リポ ソー ム に よ るDNAの カ プセ ル 化 は膜 表 面 が 負 電 荷 を帯 び て い る細 胞 内へDNAを 導 入 す るの に必 要 で あ る と筆 者 らは考 えてい る14∼16). また , 図3(b) の 数 珠 状 の構 造 で はDNAの カプセル 化 が不 十 分 であ り, 高 い遺 伝 子 導 入 効 率 を得 る こ とが で き な い こ と も明 ら か に な っ た16). と ころ で ,DNAを カ プセ ル 化 した リボ ソー ム の 表 面 構 造 は コ レ ス テ ロ ー ル 誘 導 体 の 種 類 に よ る 違 い は ほ と ん ど観 測 で き な か っ た . た だ , カ プ セ ル 化 され た 複 合 体 の サ イ ズ は誘 導 体 の 違 い に よ り大 き く変 化 し た . そ の 一 例 を 図4に 示 し た . 複 合 体 の サ イ ズ は3種 類 に大 別 で き, 複 合 体 の サ イ ズ と遺 伝 子 導 入 の 効 率 との 間 に は 密 接 な 相 関 が あ る よ う に み えた . た とえ ば , 図4(c) に 示 した よ う な 中 間 サ イ ズ の 複 合 体 は遺 伝 子 導 入 の 効 率 が 最 も高 く, 複 合 体 の サ イ ズ が 大 きす ぎ て も, また , 小 さ す ぎて も導 入 効 率 は 減 少 した9). この こ とは, 遺 伝 子 導 入 に細 胞 の エ ン ドサ イ トー シ ス が 重 要 な か か わ り を も っ て い る よ う に み え た .

. 遺伝子の細胞内導入

そ こ で , 正 電 荷 リボ ソ ー ム に よ る 遺 伝 子 導 入 の 分 子 機 構 に つ い て 考 え て み る こ と に した . 遺 伝 子 導 入 機 構 の 追 究 に は 導 入 遺 伝 子 の 細 胞 内 動 態 を明 らか に す る の が ま ず 第 一 で あ る . そ こで , 蛍 光 標 識 し た ア ンチ セ ン スDNAを 導 入 遺 伝 子 とし て用 い る こ とに した. 蛍 光 性 の フ ル オ レセ イ ン を ア ンチ セ ンスDNAに 結 合 させ , 誘 導 体1か らな る 正 電 荷 リボ ソー ム で培 養 細 胞 内 にア ンチ セ ン スDNAを 導 入 した . マ ウス繊 維 芽 細 胞 (NIH3T3) に 導 入 し た 結 果 を 図5に 示 し た . こ こで は , ア ン チ セ ン スDNA以 外 に正 電 荷 リボ ソー ム を蛍 光 性 (ロ ー ダ ミ リポソームによる遺伝子導入 とその分 子機構 51 ン)リ ン脂 質 に よ り標 識 し た . 図5(a) は 導 入4時 間 後 の 共 焦 点 レ ー ザ 顕 微 鏡 画 像 で あ る. ア ンチセ ンスDNA は オ レ ン ジ色 で , リポ ソー ム とア ンチセ ンスDNA複 合 体 を ピ ン ク 色 で 示 した . そ の 結 果 , 正 電 荷 リポ ソ ー ム とDNAの 複 合 体 は細 胞 質 内 に取 り込 まれ , 核 内 で は ア ン チ セ ン スDNA( オ レ ン ジ色 )の 蛍 光 だ け が 観 察 さ れ た . 複 合 体 の細 胞 内 へ の 取 込 み は前 述 した よ う に , エ ン ドサ イ トー シ ス を介 し て 行 な わ れ て い る の で は な い か と推 察 され た . そ こで , エ ン ドサ イ トー シ ス の 阻 害 剤 (wortmannin,PI3キ ナ ー ゼ の 阻 害 剤 ) でNIH3T3細 胞 を前 処 理 し た あ とで, ア ン チ セ ンスDNAの 細 胞 内 へ の 導 入 を 行 な っ た17・18). そ の 結 果 , 図5(b) の よ う に正 電 荷 リポ ソ ー ム-DNA複 合 体 は ほ とん ど細 胞 内 に は取 り込 まれ ず , 複 合 体 は エ ン ドサ イ トー シス で細 胞 内 に 取 り込 ま れ て い る と結 論 で き た9,19).

. 遺伝子の核移行

と こ ろ で , エ ン ドサ イ トー シ ス で細 胞 内 に導 入 さ れ た 正 電 荷 リポ ソー ム-DNA複 合 体 か らDNAは どの よ う に して 核 に移 行 す る の で あ ろ う か . カ リ ウ ム イ オ ン の イ オ ノ ホ ア で あ るnigericinは エ ン ドソー ム 内 のpH の低 下 を阻 害 す る作 用 を もって い る20,21). そ こで ,nigeri-cinの 存 在 下 で 正 電 荷 リポ ソ ー ム-DNA複 合 体 を NIH3T3細 胞 に 導 入 した. 導 入 後 の 蛍 光 画 像 を図5(c) に示 した . 複 合 体 は 細 胞 内 に 効 率 よ く導 入 され て い る もの の,DNAは 正 電 荷 リポ ソー ム との 複 合 体 か ら遊 離 せ ず , 細 胞 質 内 に と ど ま っ て い た . この こ と は, エ ン ドソ ー ム 内 液 の 酸 性 化 が 正 電 荷 リポ ソー ムか らDNAが 遊 離 す るの に 密 接 に 関 与 して い る もの と推 察 され た .つ ま り, エ ン ドソ ー ム 内 のpHの 低 下 に よ って , 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム は エ ン ドソー ム と膜 融 合 を起 こ し, その と き, DNAは 正 電 荷 リボ ソー ム か ら遊 離 し, 核 に選 択 的 に移 行 す る もの と考 え ら れ た . そ こで , 蛍 光 エ ネル ギー移 動 (fluorescence resonance  energy  transfer;FRET) 法 を用 い て この 仮 説 の検 証 を行 な っ た22∼24). 蛍 光 色 素NBDを ドナー分 子 に し, ロ ー ダ ミ ン を ア クセ プ タ ー分 子 に してFRET法 に よ り膜 融 合 の 程 度 を 解 析 し た . まず , 正 電 荷 リポ ソー ム に ド ナ ー 分 子 (NBD標 識 リ ン脂 質 )と ア ク セ プ タ ー 分 子 (ロ ー ダ ミ ン標 識 リ ン脂 質 )の 両 者 を標 識 し,DNAと 複 合 1593

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52 蛋 白質  核 酸  酵 素  Vol.44No.11(1999) 体 を 形 成 させ た . そ し て, 複 合 体 中 の ドナ ー 分 子 だ け を励 起 した と こ ろ , エ ネ ル ギ ー移 動 が 効 率 よ く起 こ り, ア ク セ プ タ ー 分 子 の 蛍 光 だ けが 観 測 さ れ た . 一 方 , 複 合 体 を形 成 して い る正 電 荷 リボ ソ ー ム とエ ン ド ソ ー ム と の膜 融 合 が 起 こ る と, ドナ ー 分 子 と ア ク セ プ タ ー 分 子 の 距 離 が 離 れ , 蛍 光 エ ネ ル ギ ー 移 動 の効 率 が 減 少 し た . そ の結 果 , ドナ ー 分 子 と ア ク セ プ タ ー 分 子 の 両 者 の 蛍 光 が観 察 で き る よ うにな った . 実 際 に,NIH3T3細 胞 で 正 電 荷 リボ ソ ーム とエ ン ドソー ムの 膜 融 合 をFRET 法 で観 察 した 結 果 を 図6に 示 した19J.膜 融 合 の進 行 と と もに 図6(b) に示 した よ う に, ドナ ー 分 子 の 蛍 光 が 明 瞭 に 観 察 で き た . 一 方 ,nigericinに よ りエ ン ドソ ー ム 内 のpHの 低 下 を抑 制 す る と, 正 電 荷 リポ ソー ム とエ ン ド ソー ム の 膜 融 合 が 起 こ らな くな り, も は や ドナ ー 分 子 の 蛍 光 は観 察 さ れ な くな った . これ らの 結 果 か らは, エ ン ドソ ー ム 内 で 正 電 荷 リポ ソ ー ム とエ ン ド ソー ム の 膜 融 合 が 起 こ り, そ の 際 ,DNAは リボ ソー ムか ら遊 離 し 核 に 選 択 的 に 移 行 す る も の と判 断 で き た . つ ま り, 正 電 荷 リ ポ ソー ム ーDNA複 合 体 はエ ン ドサ イ トー シ ス に よ っ て 細 胞 内 に取 り込 まれ た の ち , エ ン 図5 導 入 遺 伝 子 の 細 胞 内 動 態 ア ン チ セ ンスDNAと リボ ソー ム を二 重 染 色 し共 焦 点 レー ザ 顕 微 鏡 で 観 察 . リポ ソ ーム に よ り遺 伝 子 導 入 した 後 の 蛍 光 画像 リポ ソー ム ー DNA複 合 体 は ピ ン ク色 で, ア ン チ セ ンスDNAは オ レ ン ジ 色 で 示 し た. (a)未 処 理 のNIH3T3細 胞 . ア ン チ セ ンスDNAが 選 択 的 に核 に 移 行 して い る , (b)wortmanninで エ ン ドサ イ トー シ ス を阻 害 した と きの 画像 複 合 体 は細 胞 質 内 に取 り込 まれ て い な い. (c)nigericin で膜 融 合 を阻 害 . 複 合 体 は細 胞 質 内 に 取 り込 まれ て い る が , ア ン チ セ ン スDNAは リポ ソ ー ム か ら遊 離 せ ず 細 胞 質 内 に 留 ま って い る. 図6 FRET法 に よ る 膜 融 合 の 観 測 リボ ソ ー ム膜 と エ ン ドソー ム 膜 の 融 合 が 起 こ る と, ドナ ー分 子 とア クセ プタ ー分 子 の 両 者 の 蛍 光 が 観 測 で きる .nigericin存 在 下 で は膜 融 合 は起 こ ら ず, ドナ ー 分 子 の 蛍 光 は観 測 で き な い . こ こ で は ,nigericinが 存 在 して い な い と きの 画 像 を示 す . (a)細 胞 の 微 分 干 渉 画 像 , (b) ドナ ー 分 子 か ら の 蛍光 画像 , (c)FRET法 に よ る ア クセ プ タ ー 分 子 か らの 蛍 光 画像 (b), (c)の 蛍 光 画 像 は ア ル ゴン イオ ン レ ー ザ (488nm) 励 起 に よ り観 測, 膜 融 合 の 結 果 (b)に示 した よ うな ドナ ー分 子 の 蛍 光 が 観 察 で き る.

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リポソーム による遺伝 子導入 とその分子機構 53

効 率 の増強効 果 は興 味 あ る現 象 で あ る と考 えて い る.

図7  正 電 荷 リポ ソ ー ム に よ る外 来 遺 伝 子 の 細 胞 内 導 入 の模 式 図 DNAは 正 電 荷 リポ ソ ー ム と複 合 体 を形成 しカ プ セル 化 され, 細 胞 内 にエ ン ドサ イ トー シ ス され る . エ ン ドソーム 内 でpHの 低 下 に よ りエ ン ドソー ム 膜 と リポ ソー ム膜 の融 合 が 起 こ り,DNAは リポ ソ ー ム か ら解 離 し選 択 的 に 核 に移 行 す る と考 え られ る . ドソ ー ム 内 の 酸 性 化 に 伴 っ て , リポ ソ ー ム とエ ン ドソ ー ム が 膜 融 合 を 起 こ し, それ に伴 い,DNAは リポ ソー ム か ら遊 離 し て 核 へ 移 行 す る もの と考 え られ た . この よ うな 正 電 荷 リポ ソ ー ム に よ る標 的細 胞 へ の遺 伝 子 導 入 の 分 子 機構 を 模 式 的 に 図7に 示 した .

. 糖脂質の効果

お わ り に 本 稿 で は筆 者 ら が 現 在 行 な っ て い る正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル 誘 導 体 を 素 材 と した 正 電 荷 リポ ソ ー ム に よ る遺 伝 子 導 入 の研 究 を 紹 介 した . 研 究 の 遂 行 に あ た っ て は , レー ザ 顕 微 鏡 と プ ロ ー ブ顕 微 鏡 に よ り遺 伝 子 導 入 の 分 子 機 構 の追 究 も行 な っ て お り, そ の 結 果 も あ わ せ て 紹 介 し た . 遺 伝 子 導 入 の 分 子 機 構 に つ い て は, こ れ まで 種 々 の 説 が 提 唱 さ れ て きた . し か し , そ れ らの 多 くは ほ とん ど実 証 を 伴 わ な い も の で あ っ た . 本 稿 で は レ ー ザ 顕 微 鏡 とプ ロ ー ブ 顕 微 鏡 技 術 を 駆 使 して 遺 伝 子 導 入 の 分 子 機 構 に対 し て , 一 部 で は あ る が 具 体 的 な 説 明 を 加 え る こ とが で き た もの と考 え て い る. と こ ろ で , 正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル を 用 い た 非 ウ イ ル ス ベ ク タ ー に よ る 遺 伝 子 導 入 法 は安 全 性 が 高 い うえ に , 遺 伝 子 導 入 の 効 率 も リ ポ フ ェ ク チ ン よ り も数 段 優 れ て い た . 今 後 , 非 ウ イ ル ス 系 の ベ ク タ ー と して 大 い に検 討 に値 す る もの と考 え て い る . そ の 際 , 正 電 荷 コ レ ス テ ロー ル 誘 導 体 をin vivoで の 研 究 に展 開 して い く際 に は, 図1の 誘 導 体Ⅱ の 活 用 や 糖 脂 質 を含 有 した正 電 荷 リポ ソ ー ム の検 討 も重 要 だ と 思 っ て い る. また , そ の よ う な 検 討 もす で に少 し ず つ 始 め て お り, 適 当 な 機 会 に今 後 の 進 展 に つ い て も報 告 で き る こ とを願 って い る . こ れ ま で 述 べ て き た 正 電 荷 リポ ソ ー ム は 正 電 荷 コ レ ス テ ロ ー ル と 中 性 リ ン 脂 質 と を単 純 に 混 合 し た も の で あ っ た . リポ ソー ム を 用 い た 薬 物 輸 送 の 研 究 で は, 糖 脂 質 を含 有 さ せ る こ と に よ り有 効 性 が 増 大 す る と報 告 さ れ て い る. また , リポ ソー ム ベ ク タ ー へ の糖 脂 質 の 効 果 を調 べ たin  vivo実 験 に お い て は, 糖 脂 質 は リポ ソ ー ム の 安 定 性 に 寄 与 して い る な ど とい う報 告 が な され ている25,26). 一 方, 筆 者 ら は ガ ン グ リオ シ ドGM1を 組 み 入 れ た リ ボ ソーム を用 い て ,HeLa細 胞 へ の遺 伝 子 導 入 の効 果 を 検 討 した . そ の 結 果 , 正 電 荷 リポ ソ ー ム に糖 脂 質GM1 (2%) を含 有 さ せ る と,HeLa細 胞 へ の 遺 伝 子 導 入 の 効 率 が 糖 脂 質 を含 ま な い リポ ソ ー ム と比 べ て4∼5倍 増 大 し た27). これ は ,GM1レ セ プ タ ー を 介 した エ ン ドサ イ トー シ ス の 増 強 と も考 え ら れ るが , そ の 理 由 は現 在 の と こ ろ明 確 で は な い . た だ , こ の糖 脂 質 に よ る 導 入

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Two Postdoctoral

Research

Fellows

Beth Israel Deaconess

Medical Center

Postdoctoral

positions

are available

at the Center

for Molecular Imaging Diagnosis and Therapy in

the Department of Radiology to develop molecular

technologies

for enhanced diagnostic

and

therapeu-tic strategies

for cancer,with particular

emphasis

on drug/gene targeting using genetically

engineer-ed proteins

and viruses.Good communication skills

and expertise

in one or more of the following areas

required:Recombinant

DNA

techniques;viral

gene transfer

vectors;expression of proteins

using

bacterial

and mammalian systems and their

charac-terization;and protein chemistry/biochemistry.

BIDMC is

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Send curriculum vitae and two references

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Dr.Takeshi Sano,Harvard Institutes

of Medicine,

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日韓 合 同 トラ ン ス グ ル タ ミ ナ ー ゼ カ ン フ ァ レ ン ス 日 時 :平 成11年12月10日 (金 ),11日 (土 ) 場 所 :九 州 大 学 国 際 ホ ー ル (福 岡 市 東 区 箱 崎6-10-1) 特 別 講 演 :SooⅡChung博 士 (韓 国 牧 岩 研 究 所 長 ) 演 題 募 集 要 項 :発 表 時 間 は , 講 演15分 , 討 論5分 の 予 定 で す .9月 末 日 ま で に 「演 題 の タ イ トル , 演 者 名 (発 表 者 に ○ 印 ), 所 属 」を 英 文 で 作 成 し てE-mailで 下 記 まで お 送 り くだ さ い .10月 末 日 まで に上 記 の 「演 題 の タ イ トル , 演 者 名 (発 表 者 に ○ 印 ), 所 属 」に 「発 表 要 旨 」を 含 ん だ 英 文 の 抄 録 (A4版1枚 分 に ま と め て ) をE-mailで 下 記 ま で お 送 り く だ さ い . 参 加 申 込 み :参 加 希 望 の 方 は ,10月 末 日 ま で に下 記 に お 申 し込 み くだ さ い . 事 前 に 最 終 プ ロ グ ラ ム を お 送 りい た し ま す . 参 加 費 :2,000円 申 込 ・間 合 せ 先 :〒990-9585山 形 市 飯 田 西2-2-2 山 形 大 学 医 学 部 分 子 病 態 学 講 座 一 瀬 白 帝 Te1.023-628-5275 FAX023-628-5280 E-mail:bunbyo@idw03.id.yamagata-u.ac.jp 1596

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