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あ った. 最 初 の成 果 と して, 111.4kbの 連 続 した大 腸 菌 当 初 は サ イ エ ンス に お け る活 動 と して, な か な か理 解 さ の 配 列 が デ ー タバ ン ク に登 録 さ れ た が, そ の 配 列 長 は そ れ に くか った と記 憶 し

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SEMINAR ROOM

セミ ナー室

細胞の完全理解 に向 けて:

大 腸 菌 を用 い た シス テ ム バ イ オ ロ ジ ー の 現 状 と展 望 (1)

浩禎

奈良先端科学技術大学 院大学バイオサ イエンス研究科/ 慶應義塾大学先端生命科 学研究所

1986年, Renard Dulbecco(1)に よ り Science 誌 に

“Perspective”と い う形 で ゲ ノ ム研 究 の 重 要 性 が 論 じ ら れ, そ の 後 多 くの 議 論 の 末, 1990年 代 に大 き く飛 躍 した ゲ ノ ム解 析 研 究 が もた ら した もの は, 何 で あ っ た だ ろ う か. ヒ トゲ ノ ム の み な らず, 大 腸 菌 や 酵 母 な どの 微 生 物, 原 生 動 物, 昆 虫, 魚 類, 哺 乳 動 物 や 植 物 な ど, あ らゆ る 分 類 学 上 の生 物 の ゲ ノム 研 究 が大 き く飛 躍 した. ゲ ノ ム 研 究 はサ イ エ ン ス と して の 興 味 だ けで は な く, 大 き く生 物 産 業 を変 え う る可 能 性 まで, 多 くの側 面 を もつ. そ の 中 で, 科 学 と して もた ら され た もの の一 つ に, 有 限 個 の 対 象 を示 す こ とが で き た と い う こ と は, そ の 後 の バ イ オ イ ン フ ォマ テ ィ ク ス, シ ス テ ム バ イオ ロ ジー 分 野 に大 き な影 響 を与 え た(2). ま た, 技 術 的 に も多 くの 開 発 が 進 み, そ れ ま で不 可 能 と考 え られ て い た こ とが可 能 とな り, 細 胞 や 遺 伝 子 全 体 を見 渡 す こ とが で き る解 析 が 大 き く発 展 した. DNA分 子 の 構 造 発 見 後 の分 子 生 物 学 の 目覚 ま しい 発 展 に よ り, これ ま で 多 くの生 命 現 象 の 分 子 機 構 が 解 明 さ れ て き た こ と は疑 う余 地 の な い 事 実 で あ る. しか し, そ れ らは あ る意 味 “部品 ”の 科 学 で あ る. 今 “部品 ”に よ り構 築 され て い る シ ス テ ム と して の生 命 の 解 明 が 注 目 さ れ て き て い る. シス テ ムバ イ オ ロ ジー と い う分 野 で あ る が, この 言 葉 自体 は 新 しい もの で は な い. しか し, ゲ ノ ム研 究 に よ り対 象 が有 限 個 に な った こ とで 大 き く加 速 さ れ た. こ の 「セ ミナ ー 室 」 で は, ゲ ノ ム研 究 か ら シス テ ム バ イ オ ロ ジー へ の流 れ を 見 な が ら, 大 腸 菌 を例 に, 3 回 に 分 け て現 状 を解 説 し, 展 望 を 議 論 した い. 大腸菌ゲノムプロジェクト 1980年 代 半 ば に ゲ ノ ム 解 析 研 究 の 重 要 性 が 急 速 に 論 じ られ 出 した 背 景 と, 1987年 に 小 原 らに よ る大 腸 菌 染 色 体 の 物 理 地 図 と コ ンテ ィ グ ク ロ ー ンの 完 成(3)が契 機 に な り, 日本 で も大 腸 菌 ゲ ノ ム 研 究 へ の 取 り組 み が 始 ま っ た. プ ロ ジ ェ ク トは1989年, 当 時 の文 部 省 に よ る重 点 領 域 研 究 と して, 京 都 大 学 の 由 良 を 代 表 と して ス ター トし た. 当 時 は 自動DNAシ ー ケ ンサ ー が 出 始 め た こ ろで, まだ ま だ大 規 模 配 列 決 定 に利 用 で き る状 態 で は な か っ た し, 機 能 不 明 な領 域 の 塩 基 配 列 決 定 を行 な う こ との 意 味 自体 の議 論 も不 十 分 な ま ま で あ っ た. 何 事 もそ う で あ ろ う が, 新 しい こ とを ス タ ー トさせ よ う とす る と, そ れ まで の常 識 に囚 わ れ て しま う. 日本 に お け る ゲ ノ ム研 究 も例 外 で は な か った. 結 局, 世 界 で 初 め て の シ ス テ マ テ ィ ック な配 列 決 定 の プ ロ ジ ェ ク トで は あ っ た が, な か な か 効 率 的 に 進 め る こ とが 難 しい 状 況 が 続 い た. と られ た 最 終 的 な 方 法 は, 企 業 委 託 とい う形 で 化 学 と 生 物 Vol. 44, No. 10, 2006 699

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あ った. 最 初 の成 果 と して, 111.4kbの 連 続 した大 腸 菌 の 配 列 が デ ー タバ ン ク に登 録 さ れ た が, そ の 配 列 長 は そ れ ま で の 登 録 配 列 の最 長 記 録 を 更 新 した(4). 最 終 的 に3年 間 の成 果 と して は, 不 十 分 と い わ ざ る を え な か っ た が, こ の プ ロ ジ ェ ク トの 最 大 の 成 果 は, 意 味 の わ か らな い領 域 のDNA配 列 の決 定 か ら, 予 想 以 上 に 多 くの 情 報 が 発 掘 で き る こ と を 内 外 の 研 究 者 に示 した こ とで あ る. 当 時 の新 た な 興 味 深 い遺 伝 子 の 発 見 と して は, 根 粒 菌 Azorhizobium caulinodans の 窒 素 固 定 に機 能 す る fix 遺 伝 子 群 が そ の オ ペ ロ ン構 造 を 保 持 した 形 で 大 腸 菌 ゲ ノム に存 在 す る こ と や, SOS誘 導 を 受 け る と考 え られ る遺 伝 子 な ど が 見 つ か っ た. そ の 後, シ ス テ マ テ ィ ック な配 列 決 定 の意 味 が理 解 され, 電 気 通 信 大 学 の 溝 渕, 基 礎 生 物 学 研 究 所 の 堀 内 を 代 表 と して 配 列 決 定 プ ロ ジ ェ ク トが 進 み, 最 終 的 に は1997年1月 に Wiscon-sin 大 学 の Blattner ら と 同 時 に, 大 腸 菌K-12株 の 全 ゲ ノ ム 配 列 を示 す こ とが で き た. 大 腸 菌 は, 現 在 もそ うで あ る が, 最 も解 析 の進 ん で い る生 物 の 一 つ で あ る. プ ロ ジ ェ ク ト開 始 当 時 も同様 で あ り, 多 く の 断 片 の 配 列 が す で に 決 定 さ れ て い た. プ ロ ジ ェ ク ト開 始 当 初 は, そ れ ら決 定 され て い る領 域 を 除 い て, 穴 を 埋 め る形 で 配 列 決 定 が 進 め られ た. しか し, 1990年 台 に ゲ ノ ム研 究 が 進 ん だ こ と に よ っ て 配 列 決 定 法 が 劇 的 に効 率 化 され た た め, 堀 内 らに よ る第 三 期 の プ ロ ジ ェ ク トで は 決 定 さ れ て い る領 域 も含 め て す べ て 配 列 決 定 を 進 め た. 1997年 に プ ロ ジ ェ ク トが終 了 した後 も, そ れ ま で プ ロ ジ ェ ク トで は 手 を つ けな か った 領 域 の 配 列 決 定 が 堀 内 らを 中 心 に進 め られ た. ポストゲノムにおける研究リソース リソ ー ス の 重 要 性 ロ ス ア ラ モ ス研 究 所 か ら始 ま ったDNA配 列 の デ ー タ ベ ー ス が20世 紀 の 後 半 に果 た した 役 割 に つ い て は, 誰 も異 論 を 唱 え る者 は い な い で あ ろ う. ゲ ノ ム 配 列 も, 現 在 で は500を 超 え る 生 物 種 の も の が 明 らか に さ れ て い る. ゲ ノ ム 間 の 比 較 か ら産 み 出 さ れ た 研 究 成 果 も大 き

く, COG (Clusters of Ortholog Groups of Proteins)

デ ー タベ ー ス は, そ の 大 き な成 果 の 一 つ で あ る(5). 系 統 的 に集 め ら れ た 情 報 が 如 何 に重 要 で あ る か を 如 実 に物 語 って い る と感 じる. 非 常 に個 人 的 な 印 象 で あ るが, 日 本 で は 系 統 的 に物 を 集 め る と い う仕 事 は過 小 評 価 さ れ が

ち で は な い だ ろ うか. もち ろん, KEGG (Kyoto

Ency-clopedia of Genes and Genomes) デ ー タベ ー ス(6)のよ

うに例 外 的 な デ ー タベ ー ス が 存 在 す るが, そ れ で も設 立 当 初 は サ イ エ ンス に お け る活 動 と して, な か な か理 解 さ れ に くか った と記 憶 して い る. 情 報 の み な らず, 均 質 で 網 羅 性 の あ る研 究 材 料 も, ポ ス トゲ ノ ム研 究, シス テ ム 生 物 学 に お い て 非 常 に 重 要 に な って き た. シー ケ ンサ ー や ロ ボ ッ ト技 術 な ど実 験 技 術 の 革 新 に よ り, 全 遺 伝 子 を 対 象 と した 研 究 が 可 能 に な って き た た め で あ る. 全 体 を 見 渡 す 研 究 と, こ れ ま で の個 別 の遺 伝 子 研 究 は互 い に相 補 的 な 関係 に あ り, これ か ら全 体 と個 を 行 き来 で き る研 究 が 可 能 とな っ て き て い る. 個 の 研 究 の 蓄 積 が あ るか ら こそ 全 体 へ の ア プ ロー チ に意 味 が もて, 全 体 を 見 渡 す こ とで 個 の研 究 の 位 置 づ けが 明確 にな る. そ して, 知 識 の 蓄 積 か ら ル ー ル を見 い だ そ う と す る バ イ オ イ ン フ ォマ テ ィ ク ス, シ ス テ ム 生 物 学 が 発 展 し, 21世 紀 に な り, 大 き く生 物 学 が 変 化 を遂 げ よ う と して い る今, リ ソー スが 如 何 に重 要 で あ る か を 考 え る必 要 が あ る. 1. 大 腸 菌 ゲ ノム 配 列 我 々 の研 究 で 最 も基 本 とな る情 報 は ゲ ノ ム配 列 情 報 で あ る. 1997年 に 明 らか に さ れ た 大 腸 菌 ゲ ノ ム配 列 は, そ の 後 日米 に よ り独 立 に決 定 され た ゲ ノ ム 配 列 の 比較 に よ り, IS (挿 入 配 列) な どの 違 い を 除 き, 両 者 に存 在 す る 遺 伝 子 上 で267個 所, 350塩 基 に上 る 食 い違 い の あ る こ とが 明 らか に な って き た. そ れ らの食 い 違 い が本 来 の 配 列 上 の 違 い な の か, あ る い は単 な る配 列 決 定 上 の ミスな の か の 確 認 作 業 が 堀 内 らが 中 心 と な って 進 め られ た(7). 方 法 は, 食 い 違 い の あ る領 域 を 日米 両 大 腸 菌 の ゲ ノ ム よ りPCRで 増 幅 し, そ れ らを 直 接 配 列 決 定 し, 確 認 す る とい う もの で あ る. 日本 で 決定 を進 め た 株 は, 小 原 らに よ り 物 理 地 図 お よ び λフ ァ ー ジ に よ る コ ンテ ィ グ ク ロー ンが 作 製 さ れ たW3110株 で あ り, ア メ リ カ で 決 定 さ れ た 株 はMG1655株 で あ る. 系 統 関 係 は, 図1に 示 す よ う に, 同 一 の 株 か ら約50年 前 に分 離 され た 非 常 に 近 縁 な 株 で あ る. 解 析 の結 果, 図2に 示 す よ うに, わ ず か8個 所, 9塩 基 が本 来 の違 い で, そ れ 以 外 は配 列 決 定 の ミスで あ る こ と が判 明 した. 本 来 の違 いが 存 在 す る場 所 は す べ て コー ド 領 域 で, 7個 所 がORF領 域, 1個 所 が23Sリ ボ ソー ム RNAの 領 域 で あ った. 塩 基 配 列 上 の違 い に 比 べ, ISや フ ァー ジ の挿 入 に よ る違 い は大 きい (図3). 食 い違 い の 見 られ るISは 直 接ORFの 内 部 に挿 入 され, 遺 伝 子 を破 壊 して い る場 合 も6個 所 見 ら れ る. 直 接ORFを 破 壊 し て い な くと も, 発 現 に影 響 を与 え る こ と は十 分 に考 え ら れ, 両 大 腸 菌 の 性 質 の違 い を生 み 出 して い る原 因 の 一 つ と考 え られ る. これ らの違 い は, 後 で 述 べ る 遺 伝 子 の ク ロ ー ンや 欠 失 株 作 製 時 に増 幅 や 欠 失 の た め の プ ライ マ ー

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設 計 に影 響 を 及 ぼす もの で あ るの で, 注 意 を 要 す る. 2. 遺 伝 子 ア ノ テ ー シ ョン情 報 ア ノ テ ー シ ョ ン情 報 は, ゲ ノ ム配 列 と同 様 に最 も重 要 な 基 盤 情 報 の 一 つ で あ る. これ まで, 多 くの遺 伝 子 領 域 の 予 測 プ ロ グ ラ ム が 開 発 さ れ, 精 度 も飛 躍 的 に 良 くな っ た が, 大 腸 菌 な どの モ デル 生 物 の場 合 は, 他 生 物 の 解 析 の 対 照 と して 用 い られ る た め, よ り正 確 性 が 要 求 さ れ る. ま た, 国 際 的 な コ ンセ ンサ ス を得 る こ と が研 究 推 進 の た め に も重 要 で あ る. そ こで, 我 々 は 配 列 確 認 作 業 の 段 階 で, 国 際 的 な共 同 作 業 を 計 画 し, 日米 欧 の 大 腸 菌 関 係 者 に よ る遺 伝 子 ア ノ テ ー シ ョ ン会 議 を2003年 よ り, ア メ リカの Woods Hole 研 究 所 で 開 始 し, す べ て の 遺 伝 図1 ■使 用 大 腸 菌 株 の 系 統 関 係 日本 で大 腸 菌 ゲ ノ ム構 造 を解 析 した 株 はW3110株 で, ア メ リカ が 決 定 し た 株 はMG 1655株 で あ る. 遺 伝 子 欠 失 株 を 作 製 した 株 はBW25113 で あ る. 図2 ■W3110株 とMG1655株 と の 配 列 の 食 い 違 い 日米 で 独 立 に 決 定 さ れ た ゲ ノ ム 配 列 の比 較 に よ り明 らか に な っ て き た食 い違 い. ISな ど, 動 く遺 伝 子 は 除 き, 両 株 と も に存 在 す る遺 伝 子 に お け る食 い違 い を示 す. そ れ ら食 い 違 い を, そ れ ぞ れ の ゲ ノム か らのPCR断 片 の配 列決 定 で 修正 を 行 な う. 図3 ■W3110株 とMG1655株 と の 間 のISと フ ァ ー ジ由 来 の 染 色 体 断 片 の 違 い 2種 の 株 で 挿 入 さ れ て い るISが 違 う もの を そ の 周 辺 のORFと と も に示 す. そ れ ぞ れ 上 部 にW3110株 の 場合, 下 部 にMG1655 株 の 場 合 を 示 す. 8) で はMGI655に Cryptic prophage の挿 入 が 観 察 され る. 4) の よ う に 同 じ場 所 に違 うISが 挿 入 さ れ て い

るケ ー ス も観 察 され た.

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子 の 定 義 の 見直 しを行 な っ た. 配 列 の修 正 に よ り, こ れ ま で 予 測 さ れ て い た遺 伝 子 の分 断 や 融 合 が 見 られ るだ け で は な く, 特 に開 始 コ ドン の位 置 の 修 正 も全 員 の 合 意 の も とで 進 め られ た結 果, 全 体 で700に も上 る遺 伝 子 の 修 正 が 行 な わ れ た. 図4に 示 す よ う に, 極 端 な 例 で は 逆 鎖 のORFに な る ケ ー ス も見 られ た.

3. 遺 伝 子 ク ロー ン (ASKA clone library)

遺 伝 子 ク ロー ンは, そ の 遺 伝 子 お よ び遺 伝 子 産 物 を簡 便 に 扱 う こ と を 可 能 に す る. 我 々 は 大 腸 菌 の 遺 伝 子 ク ロー ン ラ イ ブ ラ リー を 作 製 す る に あ た り, (1)IPTG (イ ソ プ ロ ピル1-チ オ-β-D-ガラ ク トシ ド) に よ る発 現 誘 導, (2)厳密 な発 現 抑 制, (3)タ グ の付 加 に よ る 簡 便 な遺 伝 子 産 物 の 精 製, (4)GFP (緑 色 蛍 光 タ ンパ ク質) な どの リポ ー タ ー 遺 伝 子 の 融 合, を行 な っ た. これ ら の 目的 の た め に, pCA24Nと い う ベ ク タ ー を 開 発 した (図5). pCA24N はpUC系 統 の複 製 起 点 を もち, 細 胞 内 コ ピー 数 が 多 い が, lacIqを もた せ る こ とでPT5-lacか らの 発 現 を抑 制 す る こ とを 可 能 に して い る. 全 予 測ORFク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リー作 製 の 方 法 を 図6 に示 す. 予 測ORFの 開 始 コ ドン と終 始 コ ドンを 除 き, 2 番 目の コ ドンか らア ミノ酸 を最 後 の コ ドン まで の領 域 を 増 幅 す る た め の 合 成 オ リゴDNAを 設 計 し, 予 測 され た す べ て のORFの 増 幅 を 行 な った. そ の際, ク ロ ー ン化 断 片 の簡 便 な 移 し換 え を可 能 に す る た め に, 各ORFの N末 端 増 幅 用 合 成DNAの5'側 に3塩 基, C末 端 増 幅 に は2塩 基 を 付 加 しPCR増 幅 を行 な う, 増 幅 断 片 を ベ ク タ ー のStuI制 限 酵 素 サ イ トに ク ロ ー ン化 す る こ とで, SfiI制 限 酵 素 サ イ トがN末 端, C末 端 両 方 に再 生 す る よ う に工 夫 を施 した. これ らのSfiIの 切 断 部 位 は異 な る配 列 で あ り, SfiIに よ る断 片 の 移 動 な どは 一 方 向性 で 可 能 で あ る. 最 初 にGFP融 合 型 ラ イ ブ ラ リー の 作 製 を 行 な っ た が, こ れ は, 増 幅 断 片 の ク ロー ン化 が 計 画 通 り末 端 を エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ な ど の活 性 に よ り消 化 され な い で, in frame で融 合 さ れ た こ と の確 認 と, 融 合 タ ンパ ク質 に よ る 目的 タ ンパ ク質 の 細 胞 内局 在 性 解 析 を 行 な う こ と を 目 的 と した た め で あ る. His タ グ は遺 伝 子 産 物 の精 製 が 目 的 で あ る. 目的 遺 伝 子 の コ ピー 数 が増 え, 遺 伝 子 産 物 が 増 産 さ れ る こ と で, 宿 主 細 胞 の 生 育 に 重 大 な影 響 を 及 ぼ す 遺 伝 子 群 が 存 在 す る. 可 能 な 限 り多 く の遺 伝 子 を ク ロ ー ン化 で き る よ うに す る た め に, 非 誘 導 時 はlacIq遺 伝 子 に よ り発 現 を抑 制 し, 必 要 な とき にIPTGに よ る発 現 誘 導 が 可 能 で あ る. こ の 工 夫 に よ り, こ れ ま で 多 コ ピー プ ラ ス ミ ドで は ク ロ ー ン化 が 難 しか っ た遺 伝 子 も ク ロー ン化 で きて い るが, そ れ で も変 異 が 入 る こ とが 避 け られ な い 遺 伝 子 も存 在 す る. ORF領 域 を 挟 む 形 で 卵1 制 限 酵 素 サ イ トが再 生 す るた め, そ れ を 利 用 し, 簡 便 に 他 の ベ ク タ ー へ の移 し換 え も可 能 で あ る. 現 在 で は, こ の性 質 を 利 用 した ベ ク タ ー と して, (1)発 現 調 節 を さ ら に 厳 密 に行 な い, 安 定 に保 持 され る低 コ ピー プ ラ ス ミ ド, (2)温度 制 御 に よ りプ ラ ス ミ ドの 複 製 を 停止 させ, プ ラ ス ミ ドを脱 落 可 能 に した もの, そ して(3)部位 特 異 的 な 組 換 え を 利 用 し た簡 便 な ク ロ ー ニ ング シ ス テ ム の Gateway system を 活 用 した もの, の3種 類 を 開 発 し, 研 究 に 供 して い る. 図4 ■配 列 修 正 に よ るORFの 変 化 配 列 の修 正 に よ るORFの 変 化. 1塩 基 の 食 い違 い で, これ まで 2つ で あ ったORFが 融 合 す る場 合 もあ り, ま た逆 に 分 断 さ れ る こ と もあ る. 極 端 な例 で は, rpiBの よ うに1塩 基 の 挿 入 に よ り

ORFが ま った く逆 鎖 に予 測 され 直 す ケ ー ス も存 在 した. 図5 ■ASKA clone library 作 製 用 ベ ク ターpCA24Nの 構 pUC系 統 の 複 製 起 点 を も ち, コ ピ ー数 は 多 い. IPTGに よ り制 御 を 受 け る プ ロ モ ー タ ーPT5-lacを も ち, IPTG非 存 在 下 で は cis 位 に存 在 す るlacIqに よ る発 現 が抑 え られ る.

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4. 遺 伝 子 欠 失 株 (Keio collection)

遺 伝 子 の細 胞 内 機 能 の解 析 に お い て 遺 伝 子 欠 失 株 は 重 要 で あ る. こ れ ま で, 大 腸 菌 は酵 母 や 枯 草 菌 と比 較 して 相 同 組換 え に よ る ゲ ノ ム上 か らの遺 伝 子 欠 失 は 困 難 で あ

る と さ れ た が(8), Purdue 大 学 の Wanner ら は λフ ァ ー ジ 由 来 のRED組 換 え 酵 素 (λRED recombinase) を 利 用 す る こ と に よ り数 十 塩 基 の 相 同 領 域 で も効 率 的 な 相 同 組 換 え を 可 能 に す る 方 法 を 開 発 し た(9). Wanner 法 の 概 図6 ■ORFク ロ ー ン化 の 方 法 予 測 さ れ たORFの2番 目の ア ミノ 酸 か ら最 後 の ア ミノ酸 を コー ドす る 領 域 を, N末 端 側 の プ ラ イ マ ー に はGCCを, C末 端 側 の 合 成 プ ラ イ マ ー に はCCを 結 合 した もの を 利 用 して, ゲ ノムDNAか ら対 象 の 遺 伝 子 の増 幅 を行 な う. そ の 断 片 を ベ ク タ ー のStuIサ イ トに平 滑 末 端 の状 態 で ク ロ ー ン化 す る. ORFの 方 向 が プ ロ モ ー タ ー か らの方 向 に一 致 し て いれ ば, SfiI制 限酵 素 サ イ トが再 生 し, GFPが in frame で 融合 す る. ま た, GFP領 域 はNotIを 利 用 して 除 くこ とが で き る.

図7 ■Keio collection (Knockout mutants of E. coli ORFs) 作 製 の 方 法

FRT (FLP (flippase) recombinase target) と kan 遺 伝 子 を もつ テ ン プ レー トを 対 象 の 遺 伝 子 の 上 流 が50 nt, 下 流 側50ntの 配 列 を 付 加 した 合 成 プ ラ イ マ ー に よ り増 幅 を行 な う. 上 流 側 プ ラ イマ ー は対 象 遺 伝 子 の 開 始 コ ドンを 含 め た 上 流 側50nt で あ る. 下 流 側 は終 止 コ ドンを含 め た21ntお よ び そ の下 流 側29ntの 合 計50ntを 設 計 す る. 増 幅 断 片 を Wanner ら に よ り開 発 され た BW 25113 (ア ラ ビ ノ ー ス に よ る効 率 的 な λRED組 換 え 酵 素 の 誘 導) に 導 入 す る. カ ナ マ イ シ ン耐 性 の 大 腸 菌 を 取得 し, 遺 伝 子 欠 失 の 候 補 株 とす る. 最 終 的 に, 置換 され た 薬 剤 耐 性 遺 伝子 は部 位 特 異 的 な 組換 え 酵素 で あ るFLPを 導 入 す る こ と で, FRT 間 の領 域 が抜 け る. 現 在, 薬 剤耐 性 遺 伝 子 を も った 置換 変 異株 の状 態 で 保 管, 分 譲 を行 な って い る. 化 学 と生 物 Vol. 44, No. 10, 2006 703

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略 を 図7に 示 す. マ ー カ ー 遺 伝 子 (た と え ば カ ナ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子; kan) をPCRで 増 幅 し, PCRプ ラ イ マ ー の5'側 に タ ー ゲ ッ ト遺 伝 子 と設 計 した 相 同 組 換 え 領 域 を 付 加 さ せ る. 次 い で, こ のPCR産 物 を λRED recombinase を発 現 して い る大 腸 菌 細 胞 に形 質 転 換 す る こ とで ゲ ノム 上 のター ゲ ッ ト遺 伝 子 と相 同組 換 え が 起 こ り, マ ー カ ー遺 伝 子 (kan) に よ る形 質 転 換 体 を 選 択 す る. 我 々 は大 腸 菌K-12株 ゲ ノ ム 上 の4,288遺 伝 子 に つ い て遺 伝 子 欠 失 株 の 作 製 を 試 み た(9). そ の 結 果, 3,985遺 伝 子 に つ い て は2株 以 上 の 遺 伝 子 欠 失 の 候 補 株 が 得 られ, 非 必 須 遺 伝 子 と して欠 失 株 ラ イ ブ ラ リー を 構 築 した. 残 る303の 遺 伝 子 に つ い て は, 欠 失 が1株 しか 取 れ な い secMを 含 め て 必 須 遺 伝 子 の 候 補 遺 伝 子 群 と し た (図 8). 次 回 は, 上 記 の よ う に し て 構 築 さ れ た リ ソ ー ス

ASKA clone library と Keio collection か ら ど の よ う

な こ とが わ か る か につ い て 紹 介 す る予 定 で あ る. (つ づ く) 図8 ■取 得 欠 失 株 の 分 類 全 対 象 遺 伝 子 群4,288の う ち, 303遺 伝 子 が必 須 遺 伝 子 の候 補 と して, Keio collection と して確 立 で き て い な い. 遺 伝 子 欠 失 を と る こ と が で き た も の に 関 し て の 機 能 既 知 ・未 知 の 分 類 を 行 な っ た. C: デ ー タ ベ ー ス か ら判 定, E: 実 験 的 事 実 に基 づ く. 文献 1) R. Dulbecco: Science, 231, 1055 (1986).

2) H. Kitano:“Foundations of Systems Biology”, MIT

Press, Cambridge, Mass., London, 2001.

3) Y. Kohara, K. Akiyama & K. Isono: Cell, 50, 495 (1987). 4) T. Yura, H. Mori, H. Nagai, T. Nagata, A. Ishihama, N. Fujita, K. Isono, K. Mizobuchi & A. Nakata: Nucleic Acids Res., 20, 3305 (1992).

5) R. L. Tatusov, M. Y. Galperin, D. A. Natale & E. V. Koo-nin: Nucleic Acids Res., 28, 33 (2000).

6) M. Kanehisa, S. Goto, S. Kawashima & A. Nakaya: Nucleic Acids Res., 30, 42 (2002).

7) K. Hayashi, N. Morooka, Y. Yamamoto, K. Fujita, K. Isono, S. Choi, E. Ohtsubo, T. Baba, B. L. Wanner, H. Mori & T. Horiuchi: Mol. Syst. Biol., 2, 20060007 (2006). 8) M. G. Lorenz & W. Wackernagel: Microbiol. Rev., 58,

563 (1994).

9) T. Baba, T. Ara, M. Hasegawa, Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K. A. Datsenko, M. Tomita, B. L. Wanner & H. Mori: Mol. Syst. Biol., 2, 20060008 (2006).

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