エンバク冠さび菌感染葉におけるリボ核酸分解酵素の変化-香川大学学術情報リポジトリ

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105 エンバク冠さび菌感染菓におけるリボ核酸分解酵素の変化

山 本 弘 宰,宝 金 広 行

植物組織中ではリボ核酸分解酵素(RNase)の活性が傷啓(4),老化(4・5)をどのほか,さび菌の感染によっても増高す る.すをわち,Ro=欄∬NGERら(9)によると,コムギ赤さび菌(P㍑CCよ−戒αreC0花成ね)に感染したコムギ菓では,雁病性, 抵抗性両品種とも本酵素の活性が感染初期と後期の2回増高するu・またFRI占および FucHS(5),SACHSEおよび WoLF(10)によると,コムギ果さび菌(動cc去花立’αgγα∽よ−戒■s)感染のコムギ菓では梶病性,抵抗性とも接種後徐々に増高 し,増高程度は催病性で著しい小 さらにまた,CHAKRAVORTYら(1〉およびScRUBBら(11)によると,同薗に感染したコ ムギならびにアマさび菌(肋〝ゆSOrαん一房)に感染したアマ薬において,抵抗性品種は感染初期に−・時的を増高を示 すだけであるに対し,催病性では同後期にも顕著に増高する.HARVEYら(6)もスグリさび菌(αp乃αr・f去㍑∽γせろまcoね) に感染した一隈病性のスグリ英で同様の現象を認めている. 従来,さび病におけるこのようなRNase活性の変化は生化学的病徴(Biochemicalsymptom)の一つとしてとらえ られていたようであるが,最近,CfrAKRAVORTYら(8,11)は,曜病性アマ菓で増高した感染後期のRNaseのうちには ぁ柁0ひ0合成のものがあり,それはさび菌と宿主の両者から蛋白質のサブユニットを−・部とり入れていると考え, RNase合成における宿主と病原菌の緊密な関係を諭t:lている. 本実験では,冠さび菌(Pucciniacoronataf‖SpL.aVenae)に感染したェンバク英のRNase活性の変動を定盈的な らびに定性的に調べ,既報の結果と比較した. 本実験の遂行およびまとめにあたっては,本学内藤中人名背教授ならびに同谷 利一・助教授の御指導と御校閲を 賜ったl.心より感謝の意を表する. 実験材料および方法 1.供託材料および方法 既報(8)のとおりエンバク(ビクトリア226−S(15),勝冠1号)の種子をバ・−ミキエライトに播種し,・一偏魔の春日井 氏水耕液を毎日施し凌がら250C,螢光幻連続照射(6,000∼8,000ルノクス)下で育苗する.播種7日後の子蘭第1 菜に九ccよわ∠αCOγ0乃αfαf.・Spいαひβ乃αeレース226あるいは203を塞がわ全面に濃馴こ筆で塗布し,上記条件下で20時間 湿室に保つ. 2.酵素活性測定 酵素活性はUDVARDYら(18)の方法を−・部修正して測定した.すなわち,エンバク薬1gを20mlの緩衝液(50mM トリス一塩敢,pH7・5)中で3分間磨砕後(日本精機ホモジナ・イザーHB,20,000Ⅰ・pm),ニ慮ガ・−ゼでろ過し,20,000 ×gで30分遠心分画する.反応はイオン交換水で3小5倍に希釈した上記の上澄液0、5mlと市販の精製酵母RNA液 (RNAlい5mg/100mM酢酸緩衝液1ml)0.5mlを混合し,370C,30分行なう。反応後0.3%La(NO8)8添加2.5%トリ クロル酢酸1mlを加え,1、嘩間以上水冷下に静直してから遠心分画(1,500×g,15分)し,上軽部をイオン交換水で 10倍に希釈し,260nm波長下で吸光度を測定する“対照区には,粗酵素液に基質を混合後直ちに停止液を加えた. 冠さび菌夏胞子からの粗酵素液は,同夏胞子(800mg)をイオン交換水上で3時間(250C)発芽させた後ろ紙上に回 収し,エンバク英と同様に処理した. 3.ディスク電気泳動 エンバク薬1gを50∽Mトリスー塩酸緩衝液(pH7.5)1ml中で磨砕して得た液100直をWILSON(14)を一・部修正し た方法で電気泳動した.すなわち,7.5%ゲルで2時間泳動後,とり出したゲルを水冷の100〝ZM酢酸緩衝液(pH4.5 および5∩7,あるいは515)6mlに15分間浸活するハ つぎに酵母RNA(4mg/ml)を含む同夜衝液で水洗し,0.2%アズ ルB(亜0〝瓜Ⅰ酢酸緩衝液pH4・7)溶液中で30秒間染色する.15分水道水で水洗後,0い5%酢酸溶液を30分ごとに交換 しながら脱色を行なう.バンドが明確になると,東洋科学デンシトロ・−ルDMU−2型(621nm波長)で吸光度を計測

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する. 4ひ 空白質測定

LoRWYら(7)の方法に準じた.標準物質にほ牛血晒アルブミンを用い,750nm波長下で測定した

実 験 結 果 1.エンバク菓および夏胞子のRNase活性とp‡lの関係 RNase浦性とpHの関係を明らかにするにあたり,まずビクト))ア226LS健全菜を用いてpH5“5における酵素濃 度および反応時間について調べたところ,蛋白質汲皮60−160帽および反応時間20′叫・■60分の条件下でいずれも比例 関係が成立した.したがって以後の反応は蛋白質■80iLg,反応時間30分の条件で行なったい各pH域におけるRNase 活性を第1図に示す。エンバクビクトリア226.S健全葉ではRNaseの最適pHは5・7付近だけであるが,L/・−ス226 接種4∼10日後の感染葉では新たにpH4.5付近にも活性の極大が出現した。.勝冠】号の健全葉およびレース203接種 5日後の感染共ではRNase活性の最適pHはともに5.5付近であった.また,夏胞子におけるRNase活性の段 通pHも5り5付近であった. 4 5 6 7 8 4 反応液のpH 5 6 第1図 エンバク葉および夏胞子のRNase活性とpHの関係 感染薬の測定はビクトリア226−S(226)は接種4日後,勝冠1号(203)は 同5日後,同(226)は同28時間後に,夏胞子の測定は発芽3時間後にそれぞ れ行なった.pH37∼7,0(○,⑳,×)は酢酸緩衝液,pH70∼8い3(△,▲)は トリス一塩酸緩衝液,()中の数字はレー・ス番号 2”感染にともなうエンバク葉のRNase活牲の経時的変化 (1)雁病性 前述のとおりビクトリア226−Sの感染葉ではpH57のほか4.5にもRNase活性の極大が認められた ので,両pH値における活性の変化を経時的に調べた… その結果,第2図のとおり健全葉のRNase活性はpH4‖5 (2−a)および5い7(2−b)とも測定期間中ほほ一億であったが,感染兼(2−a,b)では両pHとも接種4日後の生殖生長 期噴から急速に活性が増高し始め,接種6日後には健全菓の約2∼2..5倍に達した. 勝冠1号では健全,感染葉ともRNase活性の最適pHは55付近にあったので,同pH備における活性の変化を 調べた.結果は第2−C図のとおり,ビクトリア226−Sと同じく健全薬では測定中ほぼ一億であ・つたが,感染葉では 生殖生長期嘆から増高し始め,接種6日後には健全葉の約2い5倍に達した. (2)抵抗性 勝冠1号にレース226を接種すると接種40時間以後ほ感染菌糸の伸長が完全に停止する(8)から,本品 種のRNase活性は接種48時間までを経時的に調べた。その結果,第2−d図のとおり健全薬のRNase活性はほほ一・ 定であったが感染静では接種20時間頃から増高し始め,同35時間後に最高となった… 3.エンバク菓および夏胞子のRNase活性のディスク電気泳動 第2図に示したとおり,エンバク感染葉のRNase活性は生殖生長期以後著しく増高したが,何種類の酵素による か,また宿主と菌のいずれに由来するかをディスク電気泳動法で調べてみた一・その結果,RNase活性を有するバン ドはビクトリア226−S,勝冠1号とも健全集では4本(3−a,C,e),感染葉では5本(3−b,d,f)現われた.そのうち バンド1,2,5,および6が健病共通であり,バンド3が感染菓と夏胞子(3−h)に共通であった・夏胞子にはこ のほかバンド4が認められた.抵抗性品種(3−g)では健全秦と同数のバンドであった.

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第27巻第59号(1976) 107 01 0 2 4 6 (口) 萱占慧云○ 0 2 4 (日) 01 0 12 20 28 35 48 (時間) 0 2 4 (日) 第2図 感染にともなうRNase惰性の経時変化 a;ビクトリア226−S(pH4い5),b;ビクトリア226−S(pH5.7),C,d;勝 冠1号(pH55),()中の数字はレース番号 ↓∈ulN∞〇 〇 ◎ →泳動踊雅 ◎ 第3図 エンバク薫および夏胞子に含まれるRNaseのディスク電気泳動 a;pH45健全(ビクトリア226−S),b;pH4.5接種4日後(レー・ス226接種,ビクトリア 226−S),C;pH5,.7健全(ビクトリア226−S),d;pH5.7接種4日後(L/1−ス226接種,ビク トリア226−S),e;pH55健全(勝冠1号),f;pH5”5接種5日後(レース203接種,勝冠 1号),g;pH5、5接種28時間後(レース226接種,勝冠1号),h;pH5,5発芽3時間後の夏 胞子(レー・ス226),図申の数字はバンドの番号 をお,第3図に示したバンド1,2はpH5小7あるいは5い5で同5,6はpH4、5でそれぞれバンドの出現が早かっ た..また,健全菓ではバンド5よりも6の活性が強かったが,感染菓でほいずれもバンド5の活性が強まり,6とほ ぼ同一・か,それ以上に高まる傾向であった. 考 察 UDVARDYら(13)はエンバクのRNaseを精製し,最適pHは5.5付近にあると報告した.本実験でも第1図に示すと

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おり,ビクトリア226−Sの健全葉ではpH5..7付近に,勝冠1号の健全,感染葉では55付近に最適pH域があり,既 報の結果とほほ−・致した.しかし,ビクトリア226−Sの感染糞では,健全某に認められたpH5..7のほか新たにpH 4.5付近にも最適pH値が現われた1.この現象は他のさび病では認められないようである.ただし,アマさび病(2)で は,健全菓の最適pHは5.5であるが,感染葉では6い0になるとの報告がある.. つぎに菌のRNaseの活性最適pHはアマさび菌夏胞子で6り5(11),同培養菌糸で7.5(2),eXtramyCeliaで5.2および 7.5∼8.0(2),コムギ黒さび菌夏胞子では610∼65(5)とされているが,エンバク冠さび菌夏胞子ではpH5.5付近であ った.このように最適pHは菌の種類により,また同一・菌でも培養条件によりかなり異なっている.. Ro王‡RINGERら(9)はコムギ題さび菌に感染した催病性コムギ薬のRNase活性増高はこ頂曲線を示し,接種3日後ま でと同4日以後に増高すると報告した.・また,ScRUBBら(11)ばアマさび病で,C王iAKRAVORTYら(1)ほはコムギ果さび病 で,HARVEYら(6)はスグリさび病でRNase活性の増高がこ頂曲線になると述べている..−・方,FRI占およびFucHS(5) と,SACHSEおよびWoLF(10)によると,コムギ果さび菌感染薬のRNase活性は接種後徐々に増高し,シグモイド曲 線を示す.ビクトリア226−S,勝冠1号のRNase活性はいずれも接種4∼5日後のいわゆる菌の生殖生長期頃(8)か らだけ著しく増高した(第2図)1.以上のように梶病性ではRNase活性の増高は2つの型があるといえようが,い ずれも菌の生殖生長期頃から活性が著しく増高する点では共通している. RNase活性の増高の原因としてRoHRTNGERら(9)はコムギ赤さび菌夏胞子の活性が低いことから,同菌の侵入によ り宿主細胞顆粒からRNaseが離脱して活性化したか,あるいは宿主中の阻害物質が離れたためと推定している.し かし,ScRUBBら(11),CHAl(RAVORIYら(8)ぽアマさび菌感染其の活性増高は,既存のRNaseの活性化よりも,あらた に酵素蛋白が合成されるためと報告している.その際,同酵素は健全植物およびさび菌の蛋白サブ・ユ‥ニットをとり入 れるものと考えている.本実験では第3図のとおり,高いRNase活性を示す4本のバンドほ,健全,感染葉間で泳 動距離が−・致している… また,感染葉にみられる夏胞子中のバンドと同一・のものは,活性が低いから,菌の生殖生長 期以後のRNase活性の増高は,宿主中の既存酵素の活性化によるもので,菌由来あるいはde花0ぴβ合成によると考 えないほうが適当であろう. なお第3図に示したバンド1,2はpH5∩7で,同5,6はpH4.5でそれぞれバンドの出現が早いため,前者が5.7, 後者が4,5に最適pHをもつRNaseと推定される… 抵抗性品種におけるRNaseについて,ScRUBBら(11)ぉよびCHAKRAVORTYら(1・3)はさび菌侵入初期に非特異的な増 高が一・時的に起きていると報告している..FRI伝およびFucHSら(5),SACHSEおよびWoLp(10)によると,抵抗性品種 におけるRNase活性も感染後期には増高するが,梶病性品種の場合ほどではないという.本実験では第2図のとお り,勝冠1号の感染薬、では接種20時間後から徐々に増高し,同35時間後に最高とをった..なお,感染薬中のRNase は健全発と同数であった(第3−g)u 既報および本結果からはさび菌の催病性品種の寄生性に対する RNase の役割はなお不明である,しかし,(1) RNaseが老化により増高する(4・5),(2)親和性菌接種後のエンバク英にアブサイシン酸を茎部から吸収させると夏胞 子堆分化が早まる(未発表),(3)サイトカイエン類の処理では夏胞子堆分化が遅れる(12),(4)夏胞子堆分化開始か らクロロフィル含史が減少する(未発表)などを考えあわせると,本結果は宿主の老化を表現したものであると思わ れる. 摘 要 冠さび菌(PぴCCま一花∠■α COrO柁α£α f.sp小αむe乃αe)に感染した梶病性および抵抗性エンバク薬のリボ核酸分解酵素 (RNase)の活性とディスク電気泳動像の変化を調べた. (1)ビクトリア226−Sおよび勝冠1号の第1菓には4種のRNase蛋白が存在し,そのうち2種はpH5い5∼57 に,他の2種はpH4。5にそれぞれ活性最適pHがあった.発芽夏胞子(レ・−ス226)には2種のRNase蛋白があり, 活性最適pHは5.5であった. (2)レース226および203にそれぞれ雁病性のビクトリア226−Sおよび勝冠1号ではRNaseの活性が,接種4∼ 5日彼の菌の生殖生長期から急速に増高したい 同時期の感染薬には,宿主由来の4種と菌由来の1種のRNase蛋白 が検出されるが,新しいRNaseはみられなかった. (3)不親和性レ・−ス226を接種した勝冠1号ではRNase活性は,接種20時間後から増高し,同35時間後に最高

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第27巻第59号(1976) となった.RNase蛋白ほ宿主由来の4種類だけであった. 109 引 用 文 献 (1)CHAKRAVORTY,A.KりSHAW,M。,ScRUBB,LAu:

Ribonucleaseactivity ofwheatleavesandrust

infection,肋tuYe,247,577−580(1974). (2)CHAKRAVORTY,A”Kり,SHAW,M。,ScRUl∋B,L.A∴

Changesin ribonucleaseactivity duIing rust

infectionI.Characterization of multiple mo−

1ecular forms of ribonuclease from点ax rust

grownin host−free media,mySi’ol”mani劫一

方加J。.,4,313−・334(1974)

(3)CHAKRAVORTY,A、KりSHAW,M。,ScRUBB,LA∴

Changesin ribonucleaseactivity during rust

infectionII.Puri丘cation and properties of ribonuclease from healthy andinfected 負ax

cotyledons,Physiol.mant hthol.,4,335−358 (1974)

(4)DovE,L.D∴ Ribonucleasesinvascular plant:

Cellulardistributionandchangesduringdevel

Opment,PhγtOChemi二呵γ,12,256ト2570(1973).

(5)FRIa,F.,FucITS,W‖H.:Ver去nderungen der

AktivitHt einigeI Enzyme im Weizenblatt in

Abh去ngigkeit vonder temperatur1abilen Ver− traglichkeit fdr Puccinia gramini!tritici,

勒y哩αfゐoJ.Z,67,161一・174(1970)

(6)HAREY,A。E、CHAKRAVORrY A,KりSHAW,Ml, ScRUBB,LA∴ Changesin ribonuclease ac−

tivityin Ribes1eaves and pine tissue cultuIe

infectedwithblisterrust,αonartium ribicola,

且らッs去■oJ.飽乃f飽娩oJ,4,359−371(1974)

(7)LowRY,H‖0.,,RosEBROUGH,N.JりFARR,A小L, RANDALL,R”J。:Protein measurement with

Folinphenolreagent,JBiol..Cnem,193,265−

275(1951).

(8)NAITO,N”,TANI,T。,ARAKI,T:Relationship

between parasite development andinfection

typeinoat,Wheatand barleyinoculatedwith

乃‘CC査戒αCOγ0乃αfα,乃α乃S‖几勿cOJ.5bc‖頻α乃, 11,16−22(1970) (9)RoHRINGER,R,SAMBORSKI,D小J。,PERSON,C.0.:

RibonucleaseactivityinIuSted wheatleaves,

肋乃、Jβof,39,775−784(1961). (10)SACHSE,B.,WoLF,G。:Untersuchungeniiber Nukleins益ure abbauende Enzymein Blattern VOn 77・iti−cum aestivum nach Infektion mit

Puccini’a grtmini:s tri’tici’Ⅰ.Ve蕗nderungen

der Enzymaktivit益ten wahIend der Rostent−

Wicklung,印γ土砂αfゐoJいZ,68,276−279(1970)

(11)ScRUBB,L,CHAKRAVORrY,A.K,SHAW,M.:

ChangeSin the ribonuclease activity offlax

COtyledonsfo1lowinginoculationwith鮎ⅩruSt,

飽乃£♪昂γゞよoJ.,50,73−79(1972)

(12)TANI,T。,IRIKURA,H…,NAITO,N∴Inhibition

ofuredosorus formation of nLCCinia coronata

byplantgrowthregulatorsandantimetabolites,

了セcゐ.β〟JJぬc.4㌢.風喝αぴαこ玩i肌,23,42−50 (1971) (13)UDVARDY,JりFARKAS,G.LりMARRE,E”:On

RNaseandotherhydrolyticenzymeSinexcised

Avenaleaf tissues,mant&CellPhγSiol。,10, 375−386(1969) (14)WIISON,C.M”:Plant nucleaseIII、Poly−

acIylamidegelelectrophoresis ofcornribonu−

Cleaseisoenzymes,mant PhγSiol.,48,64−68 (1971) (15)山本弘幸,内藤中人,谷 利一・,竹内慧次:香 川のP㍑CCよ■戒αCOγ0乃αfαf.sp.αひβ乃αβ生態型226 に対するエンバクおよびイネ科牧草の感受性, 香川大農学乳 24,171−176(1973)

CHANGISS IN RIBONUCLEASE ACTIVITY IN OAT LEAVES

INFECTED WITH PUCCINIA CORONATA AVENAE

HiroyukiYAMAMOTOandHiroyukiHoKIN

SⅦmmary

Changesintheactivityanddiscelectrophoretic patterns ofribonucleases(RNase)fbllow−

1nginfらctionwithPucciniacoronataauenaewereinvestlgatedusingSuSCePtibleandresistant oat

cultivar・S.

(6)

containedfour・RNase proteins.The actlVlty Of two enzymes appeared to be maximalat

PH5・5−5・7)andthatoftheothertwoenzymeswasatpH4”5・・Thesoluble丘actionofgerminated

uredospores ofrace226contained two RNase proteins exhibiting・the maximum actlVlty at

pH5・5・

(2)InleavesofVictoria226−SandShokanlinoculatedwithcompatibleraces226and203,

respectively〉anObviousincreaseintotalRNaseactlVltyWaSfound丘om4to5daysafterinocu−

1ation,Whenthereproductivedi銑rentiationofthefungusOCCurred・Thisincrease appeared

tobeattributablemainlytotheincreasedactlVltyOfthefour・hostenzymesandpartiallytoone

fungalenzyme・PresenceofRNaseotherthanhostandfungalorlglnS COuld notbe deteacted

atanystageOfthesusceptibleinfections

(3)InleavesofShokanlinoculatedwithincompatiblerace226,tOtalactivity ofRNase

increasedfi・Om20hrafter・inoculationandreachedmaximumat35hr・,thendecreased.Neither

fungralenzymenordbnovosynthesizedenzymewasdetected・

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参照

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