博 士 （ 農 学 ）
チ ャ リ ン タ ー ウ ォ ン ク ノ ー
学 位 論 文 題 名
A Study of Equol Producing
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（新属腸内細菌Asaccharobacter celatus AHU1763による エクオール生成のメカニズムの研究）
学位論文内容の要旨
Asaccharobacter celatus AHU1763 is a Gram‑posrtive, obligate anaerobic, non‑spore forming, rod‑shaped bacteria. It was successfully isolated from rat cecal content. By this bacterium, 1t can convert daizein(DAI) to equol(EQL), which later compound has been reported to lower the risk of breast and prostate cancer in human. In present, current evident for the biotransformation of DAI to EQL in bacteria is unavailable. The aims of our studies are to determine enzymatic reaction involved in the conversion reaction of DAI to EQL and identify the enzyme that responsible for these reactions.
Conventional methods for cultivating the anaerobic bacteria are standing the culture medium under the ambient anaerobic conditions, which resulting in the slow growth of the anaerobic bacteria. Previous data from Minamida et al., 2006 shows DAI was metabolized to EQL completely after 4 d of cultivation. We develop a new method for cultivation of this bacterium by stirring the culture medium under strictly anaerobic conditions. Cells entered stationary‑phase of growth after 9 and 84 h when it was cultured by stirring and static method, respectively. DAI was completely metabolized to EQL faster when this bacterium was cultured under stirring condition.
The location of enzymes responsible for changing DAI to EQL was investigated. It was found that, Change of DAI to dihydrodaidzein(DHD) was detected mainly when the culture supernatant was used as a crude enzyme, and some change was also detected in cell extract and cell debris. Change of DHD to EQL was detected mainly when cell debris was used as a crude enzyme, and some change was also detected from the cell extract. Both crude enzymes require NADPH for its reactions. Then, we investigate certain parameters that might affect the efficiency of the enzymes, such as assayed and storage conditions, including temperature and pH values. It was found that, crude enzymes which responsible for changing DAI to DHD and DHD to EQL, could assayed only ‑ 252 ‑
under strictly anaerobic conditions. In addition, efficiency of the enzyme responsible for changing DAI to DHD dropped after the culture supematant was exposed to a normal atmospheric environment for even 5 min. The efficiency in changing DAI to DHD form the culture supematant increased from pH 4.0 and reached a maximum at pH 6.0, while the efficiency in changing DHD to EQL from cells debris increased from pH 4.0 and reached a maximum at pH 7.0. The highest enzyme efficiency from both DAI to DHD and DHD to EQL was obtained from incubating the culture supernatant and cell debris at 300C. .
Si hod was used to clone tI ne encode But after : Shotgun cloning metho : the gene ded enzymes. Bu :r analyzed 5,000 colonies, no recombinant E. coli clone that could metabolize DHD or EQL form DAI was obtained. Perhaps, number of recombinant colony selection is not enough, or the insertion fragment is not long enough, or enzymes responsible for metabolite DAI are not work in E. coli Toplo host system.
To further identify, the protein sequences of these enzymes which can be degenerated to the DNA sequences were investigated. Before identification, reduction the protein from crude enzyme that does not involve for the enzymatic reaction must be done. Reduction the other proteins, purification using chromatography columns was performed. In this study, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography was used to purify this enzyme.
Crude enzyme from the culture supematant was partialpurified using QXL followed by Butyl‑S FF column. SDS‑PAGE was performed to visualize the protein bands in the purified protein fraction. 4 protein bands which related to the fraction with the enzymatic efficiency were obtained. From 4 interested protein bands, 3 0f them could sequences. For the first band that has a molecular weight around 80 kDa, N‑terminal amino acid sequences are MKKNQHFPQLFE. After this sequenced was blasted with NCBI database, it similar to hypothetical protein from Flavobacteriales bacterium with 80%, 80%, and 10% of identity, positive and gap, respectively. For the second band that has a molecular weight around 54 kDa, N‑terminal amino acid sequence is MQQVNVKSEIGNLKK. It is similar to arginine deiminase from Lactococcus lactis with 75%, 83%, and 0% of identity, positive and gap, respectively. The third band hat has a molecular weight around 50 kDa, N‑terminal amino acid sequences are DQAAENQAEANAALE. This protein is also similar to hypothetical protein from Chlamydomonas reinhardtii with 100%, 100%, and 0% of identity, positive and gap, respectively. For the forth protein band, N‑terminal amino acid sequences could not sequences.
However, the result from N‑terminal sequencing is not enough for identification of this enzyme. 2‑
D gel SDS‑PAGE and identification of the protein spot were performed. 5 candidate protein spots, which presence in the purified fraction with the efficiency for changing DAI to DHD but do not
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presence in the fraction without the efficiency for changing DAI to DHD, were obtained. Peptide mass fingerprinting was generated from each spot and they were not matched to any protein sequences in the mascot search database. To further identification of each spot with N‑terminal sequencing will be performed.
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学位 論文審査の要旨 主 査 教 授 浅 野 行 蔵 副 査 教 授 横 田 篤 副査 准教授 曾根輝雄
学位論文題名
A Study of Equol Producing /Iechanism ofaNew Genus of Intestinal Bacteria Asacc カarobacter celatus AHU1763
（ 新 属 腸 内 細 菌
Asaccharobacter celatus AHU1763
に よ るエ ク オ ー ル 生 成 の メ カ ニ ズ ム の 研 究 ）
本 論 文 は 英 文
120
頁 、 図26
、 表15
、8
章 か ら な り 、 参 考 論 文1
編 が 付 さ れ て い る 。Asaccharobacter celatus AHU1763
は 、 北 海 道 大 学 で 発 見 さ れ た 新 属 新 種 の 腸 内 細 菌 で あ る 。AsaccharobacteT
は 、 グ ラ ム 陽 性 菌 で 、 偏 性 嫌 気 性 、 無 胞 子 、 桿 菌 、 高GC
含 量 の 細 菌 で あ る 。 ラ ッ ト の 盲 腸 内 容 物 か ら 分 離 さ れ た 。 こ の 細 菌 は 、 イ ソ フ ラ ポ ン の ダ イ ゼ イ ン(Daizein
， 以 下DAI
と 称 す ） を ェ ク オ ー ル(Equol
， 以 下EQL
と 称 す ） に 単 独 の 菌 で 変 換 す る こ と の 出 来 る 分 類 学 的に 最初 に確 定さ れ た微 生物 であ る。DAI
か らEQL
へ の 想 定 さ れ る 反 応 物 を 図 に 示 し た 。 イ ソ フ ラ ポ ン 類 は 、 弱 い が エ ス ト 口 ジ ェ ン 活 性 が あ る の で 、 骨 粗 鬆 症 や 乳 が ん な ど 女 性 ホ ル モ ン が 関 係 す る 病 気 の 予 防 作 用 が あ る こ と が 有 名 で あ る 。 イ ソ フ ラ ポ ン 類 の 中 で もEQL
が も っ と も 機 能 性 が 高 い こ と も 知 ら れ て い る 。 と こ ろ が 、 大 豆 な ど イ ソ フ ラ ポ ン を 食 べ て も 血 中 のEQL
濃 度 が 上 が る ひ と は 、30
％ か ら50
％ で あ り 、 こ れ ら の 人 は 、DAI
か らEQL
へ 変 換 で き る 腸 内 細 菌 （ 群 ） を 持 っ て い る と 言 わ れ て い た 。 本 研 究 で 使 用 し た の は 、 単 独 の 微 生 物 でDAI
→ →EQL
へ の 変 換 が で き る 株 で あ り 、 こ れ ら の 変 換 に 寄 与 す る 酵 素 の 情 報はなかった。本 論 文 で は 、 本 株 独 特 の
EQL
へ の 変 換 に つ い て 、 活 性 な ど 種 々 の 性 質 を調 べた 。本 菌 の 培 養 条 件 を 種 々 検 討 し た 結 果 、 高 い 変 換 速 度を 達成 する 事 が 出 来 た 。 即 ち 、GAM
に1
％Arg
を 加 え た 培 地 で 、200
Daidzein
+ (̲
嵒み9
Dihydrodaidzein
.̲rC60
Fnii,il O‑Desmethylangolensin (O‑DMA)
ル
M
のDAI
を3
時 間 以 内 にEQL
へ と 変 換 す る 条 件 を 見 い だ し た 。 厳 密 な 嫌 気 性 条 件（ 窒素85
％ 、二 酸化 炭素10
％ 、水 素5％）において、攪拌しながらの培養で最高速 度 と な っ た 。ま た、EQL
への 変換 酵素 群は、 誘導 的酵 素群 であ った 。酵 素誘 導は 、 菌の 生育 が定 常期 にな った 後で も数 時間で十分量が誘導された。変換された後、EQL 濃 度 は 下 が ら ず 、 菌 に と っ て 栄 養 素 に な っ て い な い よ う に 観 察 さ れ た 。DAI
から の変 換を 行う 酵素に つい て、それらの補酵素と存在の場所を調べた。変換 の酵素の局在位置を調べるのに、培養液上清、菌体表層・細胞膜など厳密に分画した。種 々の 補酵 素を 添加 して 転換 反応 を調べた結果、DAIからの変換は、まず、ジヒド口 ダ イ ゼ イ ン
(Dihydrodaidzein
， 以下DHD
と称す ）を 生成 し、 これ に関 わる 酵素 は、菌 体 外 酵 素 と し て 分 泌 さ れ る 、 補 酵 素 は
NADPH
で あ っ た 。 こ の 酵 素 の 至 適温 度は30
℃ 、 至 適pH
は6.0で あっ た。DHD
か ら続 しゝ て生 成さ れる 物質 は、EQL
で あっ た。この段階の酵素は、細胞膜に存在してしゝると予想され、補酵素は、NADPHであった。
至 適 温 度 は
