IRUCAA@TDC : Ionotropic P２X ATP Receptor Channels Mediate Purinergic Signaling in Mouse Odontoblasts

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Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

Ionotropic P２X ATP Receptor Channels Mediate

Purinergic Signaling in Mouse Odontoblasts

Author(s)

塩崎, 雄大

Journal

歯科学報, 118(6): 566-567

URL

http://hdl.handle.net/10130/4773

Right

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５６６歯科学報 Vol．１１８，No．６（２０１８）しおざきゆうた氏名（本籍）

塩

崎

雄

大

（群馬県）学位の種類博士（歯学）学位記番号第２１６４号（甲第１３６５号）学位授与の日付平成２９年３月３１日学位授与の要件学位規則第４条第１項該当

学位論文題目 Ionotropic P２X ATP Receptor Channels Mediate Purinergic Signaling in Mouse Odontoblasts

掲載雑誌名 FrontiersinPhysiology ２０１７ DOI：１０ .３３８９ /fphys.２０１７ .００００３論文審査委員（主査）古澤成博教授（副査）佐藤亨教授村松敬教授田﨑雅和教授山本仁教授論文内容の要旨１．研究目的歯髄の象牙質界面に存在する象牙芽細胞は，旧来，象牙質形成のみに関わるものと考えられてきた。しかし近年，象牙芽細胞自体による外来性刺激の受容と三叉神経との連絡機構が報告されている。この際の伝達物質として ATP が挙げられており，三叉神経側では P２X 受容体による受容が生じる。象牙芽細胞にも P２X 受容体の機能的発現が想定されるが，その発現パターンは明らかではない。本研究では電気生理学的方法を用い，象牙芽細胞に機能的に発現する P２X 受容体の各サブタイプについて，各サブタイプに選択的な条件の変化を利用して，網羅的な検索を行った。２．研究方法マウス象牙芽細胞様細胞（OLC）を使用し，P２X 受容体の選択的・非選択的作動薬，及び選択的拮抗薬によるイオンの細胞膜通過をホールセルパッチクランプ法により細胞膜の電気的変化として記録した。また，細胞外のイオン除去による挙動変化と，連続的な脱分極刺激による膜透過性の変化を計測した。それぞれの実験によって得られた膜電流値の変化に統計学的に解析を行い象牙芽細胞上に機能的に発現する P２X 受容体サブタイプを検討した。３．研究成績および考察非選択的 P２X 作動薬 K＋ -ATP は，OLC に内向き電流を活性化した。この際の応答性を EC５０により評価すると，５２．８μM となった。また，選択的 P２X７作動薬である BzATP は内向き電流を濃度依存的に活性化したが，選択的 P２X１，２／３，３の作動薬である αβMeATP は OLC に対して内向き電流を活性化させなかった。連続的電位変化による膜透過性亢進の確認では，内向き電流を活性化させた作動薬はいずれも，膜の陽イオン透過性を増大させていることが確認された。また P２X 受容体の選択的拮抗薬のうち P２X７および P２X４の阻害薬は有意に非選択的作動薬により活性化した内向き電流を抑制し，P２X１，P２X３の阻害薬は有意な抑制を生じなかった。細胞外 Ca２＋の除去は内向き電流を増大させ，Na＋除去は減少させた。細胞外 Ca２＋は P２X７受容体を経由した陽イオン流入を抑制するとの報告が複数なされている。また，P２X４は Ca２＋に対して特に高い透過性を示すとの報告があり，Na＋_{除去時の内向き電流の主体となるイオンは Ca}２＋_{であると考えられる。すなわちこ} れら応答量の変化はいずれも，象牙芽細胞における P２X４ならびに P２X７の機能的発現と整合する。 ― ７０ ―

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５６７歯科学報 Vol．１１８，No．６（２０１８）しかし応答性の観点では，本研究で得られた EC５０の値は生理的条件での細胞間の連絡で生じる濃度と比較して明らかに過大である。他方，細胞の直接傷害により流出する ATP の濃度は，本研究において示された応答性を充足させうる。すなわち象牙芽細胞に発現する P２X 受容体は，生理的な細胞間の連絡ではなく，周囲の組織障害により直接流出した細胞内 ATP の検知について機能することが示唆される。４．結論象牙芽細胞上には P２X 受容体サブタイプのうち P２X４と P２X７が機能的に発現している。これらの感度は平時の ATP を介した細胞間連絡に十分なものではなく，むしろ，細胞傷害の検知について主体的な役割を果たしていることが示唆される。論文審査の要旨象牙芽細胞は近年まで，象牙質の形成のみに寄与するものとして考えられてきた。しかしここ数年で象牙芽細胞そのものが，感覚受容細胞としての機能を備えることが明らかとなった。本論文は象牙芽細胞の受容体としての機能のうち，化学的伝達物質である ATP への，特定の受容体を経由した感受性について検討を行った結果についての報告である。本審査委員会では，以下のような質疑応答がなされた。まず使用した細胞について，その由来と培養の期間について，現在の記載で妥当なものであるかとの質問があった。細胞は市販されているものではないが鹿児島大より供与を受けた継代培養細胞株であり，凍結保存した細胞を解凍後ディッシュに定着するまで培養，実験での使用は一回ごとに一日で消費しきっているという点で規格化されているために，問題はないものと回答された。応答性確認のために用いられた K＋ -ATP の濃度について妥当性を問う質問については，P２X 受容体各サブタイプの５０％効果濃度が本研究において用いられた各段階の濃度と対応しており，応答特性の確認と特に高濃度の作動薬に対して特異的に応答する事実の描出のために選ばれたものとしては妥当性があるものと回答がなされた。当初記載のあった PCR のデータについて，論文内容との関連性が乏しいとの指導があり，論文上から P２X 受容体の mRNA に対する RT-PCR の記述を全て削除することで対応することとした。また審査直近で JDR 誌上に近接するテーマの論文が掲載されているが，その内容と比較して新規性があるかとの質問があった。掲載論文と本研究を比較した場合，掲載論文で選択されたのは蛍光免疫染色と Ca２＋_イメージングを用いた手法であり直接 P２X 受容体の応答を観察してはいない点，応答の作動薬濃度依存性に対し検討を欠くことから生体内での機能の推測を行えていない点があり，総合して本研究の新規性は認められると判断された。以上より，本研究で得られた結果は，今後の歯学の進歩，発展に寄与するところ大であり，学位授与に値するものであると判定した ― ７１ ―