ヒト乳ガン・胃ガン細胞特異的ヒトモノクローナル 抗体の作製

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

ヒト乳ガン・胃ガン細胞特異的ヒトモノクローナル 抗体の作製

秋山, 浩一

https://doi.org/10.11501/3098986

出版情報：Kyushu University, 1994, 博士（農学）, 論文博士 バージョン：

権利関係：

第 9 章

^ヌ

^ー

^{ド マ ウ ス 移 植 ヒ ト 胃 ガ ン 細 胞 株} に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体

⁶

^-

^{3 C 8}

の 反 応 性 の 検 討

第 1 節 緒 日

ヌ ^一 ド マ ウ ス は 体 毛 が 欠 如

し て

的 に 胸 線

を 欠 損 し

^、 機 能 的

に 純 粋 み を 有

^{す る}

動 物

^{で あ る 。}

従

^つ

て

^、 組 織 移 植 が 可 能 で あ る

^{t � ー}

^ー

と か ら

^、

お り 先 天

な ^B

細 胞 の

異 種 動 物

^の

ヒ ト ガ ン 細

胞 を 移 植

し

^{、 ガ ン} の 形 態 学 的 観 察 や ^、 ガ ン の

生 体

内 で の 成 長 や 分 化

と

の

関 連 な ど

^つ い

て

の 生 物 学 的 特 性

関

す る

研 究 用

^い

ら れ て

^い る 。

ヌ ^一 ド マ ウ ス で ^つ く

ら れ

た 腫 留 は 組 織 切 片

に す る

^{t } 、}

^.づ'

と よ り

^、 免 疫 組 織 化 学 的 手 法

を 用

い る

^t

^て�ー

と よ

^つ

て ^M

^a

^b と

の 反 応 性

を

検 討 す る

し^‘?

と

^カ三 で き る

。

^{し‘ヲ' ー}

れ よ り

^、

よ り

生 体 内 の 環

境に 近

い 条 件 で 増 殖

し

た ガ、 ン 細 胞

と

の 反 応 性 が 明

ら か な

る ^。

112

し- ヲー'

の 草コ土t

^{で は 1 n v}

^{i t}

^{r 0 で}

培 養

^{し た}

細 胞 株

^と

の 試 験

^{で E同自 ガ ン}

細 胞 株

^と

特 異 的 反 応 す る

^{し- ヲー'}

と

が 明 ら か lこ な

^{つ た}

^M

^a

^{b 6}

^-

^{3 C}

^8を

用

^{い て 、 ヌ}

一 ド ^マ ウ ス

移 植

^し

I首 殖

^{し た E同E ガ ン}

細 胞 株

^と

の 反 応 性

^を

検 討

^{し た 。}

第 2 節 実 験 材 料 お よ び 方 法

第 1 項 試 薬 の 調 製

以 下

の 試 薬

^を

染 色

^{ノミ ツ ト}

縦 ^{4 6}

^{m m 横}

9 4

_{m m} 田E コ

1 さ

9 6

m m そ

れ ぞ れ ¹⁴⁰

^m

1ず

^つ

入 れ る

^。

キ ^{〉ノ レ ン}

³

イ固

コ二 タ ノ ^一 jレ

2 {固

7 5完

8 5% 9

5先 ..::r:.. タ ノ ^{一 jレ}

各 ² {固

o

.

6

話

H 2 ⁰ 2 を

^/同&、 む メ タ ノ ^{一 jレ}

¹⁴⁰

^m

1 の

^メ

タ ノ ^一 jレ

2

.

8

m

1の 市 販 の ^{H 2 0}

²

(約

^{3 1完 を}

no

^え

る

^。

使 用 直

^目リ

i周 製

^。

{国

P B S 使 用 f表

^{f佼 を 耳文 り}

換

^え

る

^。

113

V E C T A S T A 1 N A B C K 1 T S

(Hu m a n 1 g G

，

1 g M k i t 、 V e

_c

t

₀

r _L a b . 1 n

_c

フ ロ ツ キ ン

グ 用 正 常 血

2 0添 力日

1完B

S

_A

/

_{P B}

Sで _10%

ビ オ チ ン

イヒ 抗 抗 体 、

^ーノフ

ン は 完B

S

A

/

P B

Sで 希 �R し

基質

J谷 1佼

o . 01% H

2 0 ²

を

清

lま

希

ビ _ユノ

た

。

ノ己弘、 む

、 o . _{0 5}

釈

^。

ン お よ

o . 0 5完

先

T

_w

e e n

び ビ オ チ

3 - 3 d i -

amin obe n zi d in e t e t r

_a

h y d

_{r 0 c}

h 1

₀

r i d e ( _{D A B} ) �

5 0

_m

M T r i

_s

- _{H C 1} ( p H

Y谷 f佼 ^。 L・ョー^，

れ lま 次

の

よ _つ

し て 5周 製 し た

。

M T r i

_s

- H C 1 ( p H

m 1と

H

2

0 133 m

1 を ビ ^一 カ ^一

中 で

こ(比^目 メ口入 ^{。 して，ー} の

溶液

^を

試 ，験 官 適

^{主主三E主}

分 取 す る

。

試 験

会呂主 の _{Y谷 f佼}

中

lご

市 販

^の

^H

²

0

²

約 31%

を

4 7μ 1

ビ ^一

カ ^一 の _{J谷 f佼}

中

は

7 0 m g

の

D A B

を _{合

解 す る

。

(更 用 直

目IJ に

両 者

^を

y昆

^メ_口弘、

す る

^。

ヘ マ ト キ _ユ/ ン Y谷 f佼 カ ウ ン タ ^一

染 色 用

Maye r '

_s

M H S - _{1 6} ( Sigm a)

包 埋

_{J谷 1佼}

H S _R

_{s 0}

1

_u

t i

_{0 n} 、、^{‘、、、‘.・}

ド 十

_子

114

第 2 項 ヌ ー ド マ ウ ス へ の ガ ン 細 胞 株 の 移 植

実 験 動 物

^{は 、}

B A L B /

_c - n

u / _n

u雄

マ ウ ス の ⁶

^{，剛、ー〆}

週 ^メT〉7、

を 日 本

^{ク レ ーJでF}

(槻 よ り 購 入 し 使 用 し た

^。

滅菌 し た 試 料 お よ び 水 を 与

^{え 、}

^{S p e}

^c

^{i f i}

^{c -}

pathoge n f

r

e e の

^オタ乙ミ

件 下

^{で 自司 コ同�}

し た

^。

移 植

^{は 、 ヒ ト E円百}

ガ ン 細 胞 株 T ^{M K}

^-

¹ を 用

^し\

た

T ^{M K}

^-

¹

^lま

5先F ^{C S} 添 加 E R D F 培 地

^で

培 養 し

^、

ヌ ^一 ド

マ ウ ス

^匹

当 り

^×

¹⁰⁶

^c

^{e 1 1}

^s

^{/20 0}

μ 1 (ERDF)

^{の A 口 で}

ヌ

^一

ド マ ウ ス の 背 側 皮

下 に

2 2

_{Gの J王}

射

^主十

を 用

^い

移 植 し た

^。

腫 蕩 の 生 着 が 確 認

^さ

れ

^、

腫 留 が 十 分 形 成

さ

れ た 後

^、

マ ウ ス を 屠 殺 し

^、

腫 場 部

^、

肝 臓

^、

腎臓 を t商 出 し

^、

そ れ ぞ れ

^{直 ち}

^{1 0} 完中 性 緩 衝

ホ jレ

マ ン ( ^{p H 7}

^.

⁶ )に

^{て 固 疋}

し た

^{。 脱 水 、 ノミ}

フ

フ イ ン

^{包 埋 に}

よ り

^{ノ、: フ}

フ イ ン フ

^{ロ ツ ク}

を 作

つ

た 後

^{、、、、、、、、 ク ロ ト 一 ム}

よ り 5 μ

^m

厚 の 連 続

切片 を そ れ ぞ れ 作 製 し た

^。

115

第 3 項 免 疫 組 織 化 学 染 色

M

_a

b 6

_-

3 C 8

と

組 織 切 片

_と

の 反 応 性 の 検 討 を

次 の 手}I国 で 行

_な つ

た

。

ス _フ イ ド グ ^{フ ス}

固

^疋 _{さ れ}

た 組 織 切 片 を

キ ^{シ レ ン}

中 で 5 分 間 J受-

_し

た

。

2 月!J の

_キ ^{シ レ ン}

で ¹

_0回

す す

^い _だ 。

3

^コニ タ ノ ^{一 jレ}

で ¹

_0回

す す ぎ 分 間

^コ二 _タ ノ ^一

ル 中 放 置

^。

4

メ タ ノ ^{一 jレ 一}

^H 202 中

_に

₂ 5分 放 置

5 95%

コ二 タ ノ ^{一 jレ}

中 で ¹

_0回

す す ぎ そ の 中

で

分 開 放 置

^。

6 8 5完

コニ タ ノ ^一

ル 中 で ¹

_0回

す す ぎ

、

そ の 中

で

分 間 放 置

^。

7 7 5先

コニ タ ノ ^{一 jレ}

中 で ¹

_0回

す す ぎ

、

そ の 中

で

分 間 放 置

^。

8 ^{P B S} で ¹

_0回

す す ぎ そ の 中 で 5 分 間 放 置

9 月IJ の ^{P B S} で ¹

_0回

す す ぎ

、

そ の 中 で 5 分 間

放置

。 月Ij

_の

_{P B S}

_で

¹

_{0回 す す ぎ 、 そ の}

中

_で

⁵

_分

間放 置 ^。

組 織 ^{に I閉5} を

付 しす な よ

つ 注 意 し ^{つ つ}

フ レ ノて ^{フ 一} ト を

よ

_{く ふ い て 水 滴 を と}

り ¹ 0 ^%

正 常 血 清

_{を 組 織 を}

覆

^つ

よ

つ に 上 の せ た ^{。 ，ニコ-士aミ-二・}

温 で 時 開 放 置

2 血 清

_{を フ レ} ノて ^{フ 一} ト か ら 落 と し

ま わ り

を よ

_{く 品、 い た f麦} 、 ヒ ト

^M

^a

^{b μ g} /

^m 1を 組 織 を

覆

^つ

よ

つ の せ た ^。

¹

時 間 反 応 さ せ た ^。

対 照 区

_{と し て 同 濃 度 の} ヒ ト

血 清 ^{1 g M}

_{を 用 い た} 。

3

子佼 を 捨 て て ^、

P B S

で

¹

^0回 す す い だ ^。

4 別

_の

_{P B S} 中

_{で 分 間 放 置} ^{。 仁、?一} の

操 作

_を

回

?ラ な

つ た

後 月iJ

_の

_{P B S} 中

_で

¹

0回 す す い だ ^。

5

フ レ ノて ^{フ 一} ト の

ま わ り

_を

よ

_{く ふ い て}

ビ オ チ ^ン

化 抗 抗 体

_{で 組 織 を 覆} ^つ

よ

つ し た ^。

時 間 ^{宮ニ士二 沼tιμ} で 反 応 さ せ た ^。

抗 抗 体

_{を の せ て}

^{4 5} 分後

_に ^ーノーァ _{ビ ジ} ^{ン 一} ビ オ チ ン ^コ ン フ レ ^、y ク ス を

作 製 し て ^お い た ^。

6

ビ オ チ ^ン

化 抗 抗 体

_{を 捨 て} ^、

P B S

で

¹

^0回

す す い だ ^。

117

7 月iJ

_の

^{P B S}

_{中 で}

⁵ 分 間 放 置

^{し、 ョー，} _{の 操 作 を}

あ と

²

回 行 な ^つ た

後

、

月iJ

_の

P B S

中 で

¹

0回 す す

い だ ^。

8

フ レ ノて ^{フ 一} ト の ま わ り を よ く ふ し\ て

'ノ^フ ビ ジ ン ^一 ビ オ チ ン ^コ ン フ レ ^ツ ク ス を 組 織 を

覆 ^つ よ ^つ し た ^。

時 間 室 温

_{で 反 応 さ せ た} 。

9

^甲ノーァ ビ ジ ン ^一 ビ オ チ ン ^コ ン フ レ ^ツ ク ス を

捨 て て ^、

^{P B S}

で

¹

0回 す す ^い だ ^。

2 。 月IJ

_の

_{P B S} 中

_で

⁵ 分 間 放 置

。 しー ョー^， の 操 作 を

あ と

²

回 ?子 な ^つ た

f麦

、

月IJ

_の

^{P B S}

_{中 で}

¹

_{0回 す す}

い だ ^。

2 ^l

基

質 溶 液

_{に 中 に 入 れ} ^、

³

^〆圏、-'

⁵ 分 間

_{反 応}

さ せ た ^。

2 2

フド で

⁵ 分 間

_{す す ぎ} ^、 _{水 滴 を 除} ^い _た 。

2 3

^{^' マ} ト キ ^ン ン で

分 間 染 色

_{し た} 。

2 4 紫 色

_{の フ レ} ノて ^{フ 一} ト

が 青 色

_{に な る ま で}

1 0分 程 度

_{水 で す す} ^い _だ 。

2 5

^{7 5 完 コ二} タ ノ ^{一 jレ} で

¹

0回 す す ^い だ ^。

2 6

^{8 5 完 二L} タ ノ ^{一 jレ} で

¹

0回 す す ^い だ ^。

2 7

^{9 5 完 コ二} タ ノ ^{一 jレ} 中 で

² 分 問 放 置

。

118

2 8

コニ タ ノ ^一

ル 中

^で

5 分 間 放 置

。

2 9 月IJ の

コ二 タ ノ ^一

ル 中

^で

分 間 放 置

3 。

キ _ン レ ン

中

^で

分 間 放 置

3 1 別 の キ

_ン レ ン

中

^で

分 間 放 置

3 2

包 埋 _。

3 3 光 学 顕 微 鏡

^lこ

よ

^る

観 察 を 行

^な つ

た

。

第 4 項 組 織 切 片 の 過 ヨ ウ 素 酸 処 理 お よ び 各 種 酵 素 処 理

組 織 切 片 を

^キ ユ/ レ ン lこ

よ

り 目見 ^ノて フ フ _イ ン

第 ³

^頂

¹

^{〆岡、_，}

^。

^し

た 後 以 下 の 処 理

を そ れ ぞ れ 行

^な つ

た

。

先

N

_a

1 0

₄

/5 0

_m

^{M A}

c

e t

_a

t e b

_u

f f e r ( p H 5

.

2 )

で 室 ^佃〉目

6 0保

iミE目E

し た f麦

^、

5 0

_m

M N

_a

B H

4

/ P B S

で _宝=士二

温 3 0 分 {呆

^{こE日E 。

U /

m

1ノ

イ フ ^{句、、、.、. 一} ダ ^一 ゼ

/ 5 0

m

M A

_{c e}

t

_a

t e

、、 一

buffe r (pH

^で

3 7 oc 晩 f呆

^(l日ミm 。

o

.

2 %

べ フ ン ン

/ 0 . 01 ^{N H C 1} ( p H

で

3 ⁷

C 3 0分 イ呆

^{ιE日ミ R} 。

o

. 1完ト リ プ シ ン / 0 . 05

M

T r i s -

H C 1 ( ^{p H 7} . 6 )

で 、 3

7

oc 、 15分 保 温

以 上 の 処 理 の 後 、 第 3 項 の 1 0 ) � 3 2 )

を 行 な っ た

第 5 項 テ ィ ッ シ ュ 培 養 し た T

M K -

1 細 胞 の

免 疫 染 色

M

^a

b 6 - 3 C 8 に よ る デ ィ ッ シ ュ 培 養 し た T M K -

l 細 胞 の 免 疫 染 色 は 第 7 章 、 第 2 節 、 第 2 項

に 準 じ て 行 な っ た

第 3 節

結 果

第 1 頂 ヌ ー ド マ ウ ス へ の ガ ン 細 胞 株 の 移 植

ヌ ー ド マ ウ ス に 移 植 し た 胃 ガ ン 細 胞 株

T M K

-

1 は 、 Fig .

9- 1に 示 し た よ う に マ ウ ス 皮

下 に 生 着 し た 。 作 製 し た ガ ン 組 織 切 片 の 検 鏡

像か ら は 、 核 が 大 き く 、 細 胞 の 大 き さ も 均

120

で は

な い

^{に‘ 竺ー，} と が 観 察 さ れ た

( F i ^{g . 9}

^-

² )

悪 性 1重蕩 細 胞

お い て

^{は 細 胞 世 代 の}

時 間

^{が 短}

い

」-テ と

か ら

^{、 核 分 裂 像 が 観 察} さ れ る

。 作 製 し

^た

ガ ン 組 織 切 片

お い て も 同

^{様 の 核 分 裂 像 が}

し ば し

^{ば 観 察} さ れ た

。

以 上 の ^{し、つー，} と

か ら

^{ヌ 一 ド}

マ ウ ス ^{^'} の ガ ン 細 胞 株 の 移 植 は 成 功

し

^{た しτー，} と

が 不 さ れ た

。

第 2 項

^{ガ ン 組 織 切 片 に 対 す る M a}

^{b 6}

^-

^{3 C}

^{8 の}

反 応 性

免 疫 組 織 化 学 的 方 法

を 用 い て

^{ガ ン 組 織 切 片}

と 反 応 性

を 検 討 し

^{た 結 果}

^M

^a

^{b 6}

^-

^{3 C 8}

^{は ガ ン}

組 織 と

5虫

^{く 反 応}

し

^た

( F i ^{g . 9}

^-

² )。

細 胞 質 全 体

に 反 応 が 観 察 さ れ ^、

特

^{に 核 の 周}

囲 お い て 5虫

反 応

し て い

^{る し、ヲー'} と が 観 察 さ れ た

。

ガ ン 組 織

周 辺

^{存 在 す る 結 合 組 織 と}

^M

^a

^{b 6}

^-

^{3 C 8}

^{と は 全}

反 応

し な か

^{つ た}

^。

第 3 項

_{過 ヨ ウ 素 酸 処 理 お よ び 各 極 酵 素 処 理}

ガ ン 組 織 切 片 を 過 ヨ ウ 素 酸 処 理 す る ^し-;;ー， と で

M

_a

b 6

^-

^{3 C} 8

の 反 応 性 ほ と ん ど 影 響 は な か ^つ

( F i g . 9 - ³ )。

ガ、 ン 組 織 切 片 を ノ イ ^{フ 、、、、、、 一一} タ ゼ で 処 理 し た 結 果

、 M

^a

b 6

^-

^{3 C} 8

と の 反 応 性

影 響

lま ほ と

ん ど な か ^つ た

( F i g . 9

^-

⁴ )。

ぺ フ _三ノ ン

処 理 ( F i g . 9

^-

⁵ )に

よ ^つ て

jf

ン 組 織

切片 と

^M

^a

b 6 - ^{3 C} 8

の 反 応 性 は

あ ま り 変 化 カ三 見

ら れ な か ^つ た カ三 ト フ シ ン 処 理

( F i g . 9

^-

6 )に

よ ^つ て 反 応 性 は 明 ら か

減 退

^.

消 失

し た

。

第 4 頂

_{ヌ ー ド マ} ウ ス の 臓 器 に 対 す る 反 応 性

ヌ 」 ド マ ウ ス の 腎 臓 お よ び 肝 臓 を 組 織 切 片

と し 、 M a

b 6

^-

^{3 C} 8 と 反 応 性 を 検 討 し た 。 そ の

結果 い ず れ の 臓 器 と も 反 応 性 は 観 察 さ れ な か っ た (Fig. 9

-

7， 9-8)

。

122

第 5 項 テ ィ ッ シ ュ 培 養 し た T ^{M K -} 1 細 胞 の 免 疫 染 色

F i g

.

9 - 9

に _{ア イ ツ ン 二L +片立口}

養 し た T ^{M K}

^-

¹ 細

を M _a

_{b 6 - 3 C} 8

で

免 疫 染 色 し た 結 果

^{を 刀ミ}

し た

M

_a

b

と 反 応

し た 部 分

^は

赤 茶 色

^に

染 色 さ れ て

る の が 分

^{か る 。}

組 織 切

^{片 で は ほ と ん ど す べ} の ガ ン

細 日包

^{カヌ 5虫 く}

染 色 さ れ た の 女子 し

^{、 ア}

ツ シ コー

培 養 で l土 染 色 さ れ な

^い

細 胞 が 観 察 さ

た 染 色 さ れ た 細 日包 お て も そ の

^{反 応 性}

��か _つ

た

^。

胞

。

て

イ

れ

は

.で凶刷，F同

ホωE- --8』

ωωロ偲ω

回目ω何回出。志向》mwwロsa∞ロ肩口でおロ。gω吉岡Z回目。・MWE

62 。 gさロロロ明白陰。bJ，凶EHJ-ωω』ωωロgzω符gsm

M。 ロ

2ぢω∞ω52判mw窓口明mwmwmw∞ハ》的E沼恒。&τ沼

ωgMNEふ. 9 同

ちゃ申告冨

2 3 SEasgD国

Without periodate treatment Periodate treatment

Fig.9・3 Reactivity of 6・3C8 against a tissue section of stomach cancer cell， TMK・1， grown in nude mouse.

One of the tissue sections was treated with periodate，

the other was not treated.

Without neuraminidase treatment Neuraminidase treatment

Fig. 9-4 Reactivity of 6・3C8 against a tissue section of stomach cancer cell， TMK-l， grown in nude mouse.

One of the tissue sections was treated with neuraminidase，

the other was not treated.

Without pepsin tratment Pepsin treatment

Fig.9・5 Reactivity of 6・3C8 against a tissue section of stomach cancer cell， TMK・1， grown in nude mouse.

One of the tissue sections was treated with pepsin，

the other was not treated.

Without trypsin treatment Trypsin treatment

Fig.9・6 Reactivity of 6・3C8 against a tissue section of stomach cancer cell， TMK・1， grown in nude mouse.

One of the tissue sections was treated with trypsin，

the other was not treated.

.で凶

E HJ-ωω

』ωωロ勾 ω

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A。』22 M。ロ

￡ぢω∞ω52-何窓口-mwMW偲 ∞ハ》的自由刷 。 hwτ3 ωgMト&.SF向

∞ハ》的d AC則的 E 25525SE国

130

Human serum IgM Mab6圃3C8

Fig.9・8 Reactivity of 6・3C8 against a tissue section of kidny obtained from nude mouse transplanted

stomach cancer cell， TMK・1.

司司町

Fig.9圃9 Reactivity of Mab 6-3C8 against stomach cancer cell line， TMK・1 cultured on dish.

132

司司r

第 4 節

^{考 察}

ヌ ー ド マ ウ ス 内 で 増 殖 し た 胃 ガ ン 細 胞 株

T M K

-

1 の 組 織 切 片 と 免 疫 組 織 化 学 染 色 を し た

結 果 、 M a b 6 - 3 C 8 は T M _K

-

1 と 反 応 す る こ と が

明 ら か と な っ た 。 ま た 、 組 織 切 片 の ト リ プ シ

ン 処 理 後 に 反 応 性 が 変 化 し た ご と は 、 M a

b 6-

3 C 8 の 認 識 す る 抗 原 の エ ピ ト ー プ が ペ プ チ ド

鎖 で は な い か と い う 第 8 章 で の 結 果 を 支 持 す

る も の で あ っ た 。 ご れ ら の ご と か ら 細 胞 株

T M K

-

1 は 、 デ ィ ッ シ ュ 培 養 で 表 現 さ れ て い た

5 0 k D aの 抗 原 を ヌ ー ド マ ウ ス 内 で も 表 現 す る

と 考 え ら れ る

デ ィ ッ シ ュ 由 来 の 細 胞 と ヌ ー ド マ ウ ス 由 来

の 組 織 と で は 反 応 性 に 違 い が 見 ら れ た 。 組 織

切 片 で は 細 胞 質 に お い て 強 い 反 応 が 観 察 さ れ

た が 、 デ ィ ッ シ ュ 由 来 の 細 胞 で の 反 応 性 は 弱

か っ た 。 ご れ は 、 グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド 固 定 は

細 胞 表 層 を よ く 保 持 す る の で 、 細 胞 内 の 抗 原

を 検 出 す る ご と が 困 難 な た め と 考 え ら れ る

133

腎 臓 や 肝 臓 に は 様 々 な 物 質 が 存 在 す る た め

M

a b が 非 特 異 的 に 吸 着 す る ご と が し ば し ば 観

察 さ れ る 。 M a

b 6

-

3 C

8 は ヌ ー ド マ ウ ス の 腎

臓 や 肝 臓 と 反 応 し な か っ た 。 ご の ご と か ら

ヌ ー ド マ ウ ス を 用 い た R 1イ メ ー ジ ン グ な ど の

in

viv o 試 験 を 行 な う 際 、 M a b 6 -

3 C

8 は 、 腎

臓 や 肝 臓 へ の 非 特 異 的 吸 着 を 気 に せ ず に 行 な

え る 点 で 有 用 で あ る と 考 え ら れ る

H

_{a s}

h i

z u m

e ち は

ヌ ー ド マ ウ ス に 肺 肩 平 上

皮 ガ ン 細 胞 株 L

C

- 6を 移 植 し ¹ 2 51で ラ ベ ル し

た ヒ ト M a b

H B 4 C

5 を 用 い て R 1イ メ ー ジ ン グ を

行 な っ て い る ( 6 6 )

。

ご の 結 果

M

a

b H B 4 C 5

lま

ガ ン 細 胞 に 集 積 し 、 o .

2

g の 腫 留 を 検 出 で き

た 。 M a b

H B 4 C

5 は 、 組 織 化 学 的 検 討 が 詳 し く

行 な わ れ 、 肺 大 細 胞 ガ ン 、 肺 腺 ガ ン お よ び 肺

扇 平 上 皮 ガ ン と 高 率 に 反 応 す る ご と か ら 、 今

後 、 R 1イ メ ー ジ ン グ や 治 療 へ の 応 用 が 期 待 さ

れ て る 。 M a b 6 -

3 C

8 が 胃 ガ ン の 診 断 や 治 療 に

応 用 さ れ る た め に は 、 さ ら に 詳 し い 組 織 化 学

的 な 検 討 が 必 要 で あ る と 考 え ら れ る

134

第 5 節 小 括

M a ^{b 6}

^-

^{3 C 8}

_Lま ^ヌ

ガ ^ン 細

胞 株 T ^{M K}

^-

¹

お よ び ガ ^ン 細

胞 の

な い ^L、ョ，. と

が 明

ら

か

胞 お い て 表 現 さ

抗 原 Lま ^{1 n} V 1 V 0

さ れ る と 考 ^え ら れ

一

ド

^マ ウ ス 内

で 増 殖

と

反 応

し ^、 肝 細 胞 ^、 回 り

の 結 合 組 織

_{と Lま}

と な ^つ た ^。

従

^つ て ^、

れ て い た

分 子 量 約 ^{5 0}

に お い て も 力、 ^ン 細 胞 た ^。

組 織 切 片 の 化 学 処 理

^、

酵 素 処 理 後 の

し た ^E円百 腎 細 胞

反 応

し 培 養 細

k D aの

表 現

反 応 性 の 変 化 か

ら 抗 原

の

^二L ピ ト ^{一 フ} は ^ぺ

プ チ ド 鎖

と 推 定 さ れ た ^。

M a ^{b 6}

^-

^{3 C 8}

_を

診 断 や 治 療 応 用 す

る Lま ^、

ヒ ト ガ ^ン

組 織

と

の 反 応 特 異 性

を 三平 し く

検 討 す

る

必 要 が

あ る と 考 ^え ら れ た ^。

135

第 1 ^{0 立} ヒ ト

ー

ヒ ト ハ イ ブ リ ド

ー

マ の 無 血 清 培 養

第 1 節 緒 日

従 来 ^、 細 胞 の 培 養 ^{しま 、} ち ^{ーノて芦 、、、、、、.‘} ノ 酸 無 機 塩 類

血 清 添 加 培 地 す な ^わ

ビ タ ^{、、ー、、、�} ン な ^{ど か ら}

な る 基 本 合 成 培 地 に 血 清 を

^{5 '"'-' 2 0}

%程 度 添

し た 培 地 で 行 な ^{わ れ て き た 。 し か し} な が ^ら

細 胞 に ^{よ る} 物 質 の 生 産 を ^(ヲー

^'

の 培 I也 で 行 な ^{つ しーョ一，} と Lま 、 培 地 中 の ^{タ ン ノて ク} 質 の 濃 度 が 高 ^{く 、} 未

知 成 分 が 多 ^{く メ同弘、 ま れ て い る} た ^{め 、 目} 的 物 質 の 分 離 精 製 に 非 常 に 不 利 で ^{あ つ} た ^。

無 血 清 培 地 は 基 本 合 成 培 地 に 数 種 の 成 長 因 子 を 添 加 ^{し た も} の で ^{、 仁て，一 れ ら} 成 長 因 子 は 微 で 活 性 を 不 す ^も の が 多 い の で 培 地 中 の ^{タ ン ノて} ク 質 濃 度 は 低 ^く 抑 ^{え ら れ る 。 も し 、} 細 胞 を 無 血 清 培 地 で 培 養 す ^{る Lーョー， と} が で ^{き れ ば} 培 地 中 か ら の 物 質 の 精 製 を 著 ^{し く} 軽 減 す ^{る L‘・τ'" と} が で

き る 。

そ ご で 後 に M ^a b を 精 製 す る た め 作 製 し

た ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド ー マ の 無 血 清 培 養 を 試 み た

第 2 節 実 験 材 料 お よ び 方 法

第 1 項 試 薬 の 調 製

ス ピ ン ナ ^一 フ ^フ ス ^コ ア ク ノ 社 製

^o

^.

⁵

立 ^、

3 Q

容

2

鑑 血 清 培 I也

1 T E S

^-

Y L P / E R D F

:H口� I也

イ ン ス ン 終 濃 度

⁵ μ g /

_m

1

T

ト ^フ ン ス フ ^コ二 ン 終 ^{こ辰曲 度

^{3 5} μ g /

_m

₁

E

^J二 タ ノ ^一 _jレ ^{ーノ勺ア 、司、、、、、.} ン 終 ^{4こ辰l1Jヨ} 度

^{2 0} μ g /

_m

1

S

亜 ^ーノ'フ セ レ ン 酸 ナ ト ウ _ム

終 ^プイ辰幽 度 ^×

^{10 -}

⁹

M

一 ワ ト

G�

黄 ポ

�

_包 白

( Y L P )

Lま 次 の よ つ

一

し て 調 製 し た 。 ^{一一 ワ} ト の

。H

の

G�

黄 の み を 取

り 出 し さ ら ^、

G�

黄 膜 を 耳ヌ り 除 く ^。

P B S

で

₃

希 釈 し た 後 ^、

^{100 . 000}

^×

g

^、 日寺 間 遠 心

137

し た ^{。 しー ョー，}

の 上 清

^を

^{P B S} で 希 釈

し て 粘 度 を 低 下

さ せ た f麦 ^{フ イ jレ} タ ^一 滅 菌 し た ^。 タ ン ノて ク

質

濃 度

^{lま 、 ノミ イ オ フ ツ ド 社}

の

^{フ ロ} ア イ ン ^ーJてF ツ セ イ キ ツ ト を 用 ^い て

mlJ

_疋 し た ^{。 し- ョー，}

の

よ ^つ し て

調 製 し た

Y L P

を 、

終 濃 度 ^{3 0 μ g} /

^m

1で 使

用 し た 。

第 2 項 実 験 方 法

)\

イ フ ド ^一 マ

の 静 置 培 養 で の

_{増 殖} ^{しま 、 次}

の よ ^つ し て 行 な ^つ た ^。

^{1 0}

^{完F C}

S

添 加

E R D F 培-

地 中 で 対 数 I普 殖 期 ま で

増 殖 し た

^)\

イ フ ド

一 マ を

^{5 0}

_m

1 容 の 遠

^{Jじ 管}

集 め ^{1 000 r p}

m 、

分 間

^{ユ、ニ墨ヒ Jし、} し た f麦 ^、 細 胞 塊 を

E R D F i音

^I也

再 懸

濁 し ^、

^{1 000 r p}

m

5 分 間 1夏ー争�

Jし、、 し た ^。

再 度 ^{E R D F}

培 地

^{に 県ILこ系，、} 濁 し 、 同 様

の 1芝→�

Jし、、 よ り 細 日包 を

集 め

た

^{。 しー、ヲ'}

の

細 胞 を

²

×

105 (回 /

^m

1

と な る よ ^つ

E R D F t音 地

^{d県t二系，、}

濁

し ^、 そ

の 懸 濁

^{子佼 を}

² 倍 濃 度 の

ITES-YLPを ^ノ凸b.、 む

E R D F ig. 地

^m

1が 入

^つ た

²

m

1の

ア イ ツ 三ノ コー lこ _m

1ず

^つ _添 力口 し た ^。

^{3 7 oc}

^、

⁵

^完

138

『司町

c 0

² で 培

養

し

、

日 ^{し-:;ー，、}

と 細 日包 数

を セ ノレ カ ウ

ン タ ^一 で

視リ

_疋 し た

。 o

^.

1 %

ト ^{ノヌ ン} フ jレ ^一 に

よ り 生 細 胞 率

を

iffリ

_定 し た

。

ス ピ ^ン ナ ^{一 フ} フ ス ^コ よ る 十ル立^口

養 は 次

の よ _つ

し て

行 な

_つ た

。 1 0

先F

C S 添 力日 E _{R D}

F 培 I也 で

対

数 増

殖 期

に ま で 培

養

し た

}\

イ フ ド ^一 マ を 、

終 濃 度 1

×

1 05 {固 / m 1

で

500

m 1の

1 T E S - Y L P

添 加 E _{R D} F i音

_{地 に}

d 県Lニ系，、

濁

し た

。 o

^.

5 Q 容

_{ス ピ} ン ナ

一 フ _フ ス ^コ

入 れ 3 7 。C

3 5

_r

p

m で 撹 祥 培

養

し た

。 手担 日包 密 度

_が

6

×

105 (固 / m 1

を 越 ^え た

時 点

で

3 Q 容

の ス ビ ^ン ナ ^{一 フ} フ ス ^コ に ス ケ

一 ノレ

ー7

^ツ フ し た

。

日 ^に}ずー

と 細

胞 数 を セ jレ カ

ウ ^ン タ ^一 で 演IJ _疋 し た

。 o

^.

1

完 ト ^{ノミ ン} フ ノレ ^一

iご よ

り 生 細 日包

^{三ァヰ+ミ→} を 担IJ 定 し た

。

第 3 節 結 果

ハ イ ブ リ ド ー マ H

1 5

F 2 お よ び F

M K

^- H 3の 1

T E _S

- Y L P添 加 E R D

F培 地 中 で の 増 殖 を F

i g

.

1 0- 1 、 1 0

- 2に 示 し た 。 ど ち ら の ハ イ ブ リ ド ー マ も F

C S

139

司司町

添 加 E

_{R D}

F培 地 と ほ ぼ 同 様 に 増 殖 し た 。 2 つ の

培 地 の 聞 に 増 殖 速 度 、 最 高 到 達 密 度 と も ほ と

ん ど 差 は な か っ た 。 生 細 胞 率 も 90 % 以 上 と 良

好 で あ っ た 。 図 に 示 し て い な が 、 親 細 胞 を H

₀

- 3 2 3と す る 他 の ハ イ ブ リ ド ー マ も す べ て 1

_T

E S

- Y L

Pを 添 加 し た E

_{R D}

F培 地 中 で 増 殖 し た

F _{i g}

_.

₁ 0

- 3に ハ イ フ リ ド ー マ

E _{M K}

_-

F

7 を ス ピ

ン ナ ー フ ラ ス コ を 用 い て 撹 梓 培 養 し た 結 果 を

不 し た 。 ハ イ フ リ ド ー マ E

_{M K}

_- F 7は 静 置 培 養

だ け で な く 撹 祥 培 養 に お い て も 良 好 に 増 殖 し

た

ハ イ ブ リ ド ー マ 6 - 3 C 8 の 1

_T

E S _-

_{Y L}

P添 加 E

_{R D}

F

培 地 で の 増 殖 を F

_{i g}

_.

₁

0 - 4に 示 し た 。 ハ イ ブ リ

ド ー マ 6 - 3 C 8 も ま た F C S ?恭 力日 E

_{R D}

F J音I也 と ほ ぼ

同 様 に 増 殖 し た 。 生 細 胞 率 も 90% 以 上 と 良 好

で あ っ た 。 ハ イ ブ リ ド ー マ 6 - 3 C 8 の 親 細 胞 は

A 4 H ₁ 2 で

ご の A 4 H

₁

2 は 無 血 清 培 養 で き な か

っ た も の を 無 血 清 培 養 で き る よ う に 改 良 し た

。

方 改 良 前 の A 4

_{H 1}

2 を 親

も の で あ る ^{( 7 1}

細 胞 と す る そ の 他 の ハ イ ブ リ ド ー マ ( A A 3 ，

5C10 ， 1B10 ， 4D11 ， CH11 ， 5Hll)は い ず れ も 1 _T E ^S

- Y L

P添 加 E

^R

D F培 地 で 増 殖 で き な か っ た ( デ ー

タ ー は 示 し て い な い 。

141

ITES-YLP(・) FCS(.)

(-E\的コωυ)kC一切口ω。

rhv

nり咽aA

ロωυ 戸、JAり'ai

3 4

Days

Fig. 10-1 Growth of human-human hybridoma，H15F2，

2 5 6 7

in serum free medium.

142

司司町

3 4

Days

Fig. 10-2 Growth of human-human hybridoma，FMK-H3，

in serum free medium.

� ₁₀₆

的

υ

ω

、ー〆 古J〉、

m z ω

凸

υ

ω

停、JAυ 噌・1

ITES-YLP(・) FCS(必

5 6 7

2

143

『司司

3 1

^{一一一事』}

(【戸口\的{ちυ)kC山町ロω凸

ro

nり'EA

ロωυ 戸、J00 唱・A

5 10 Days

Fig. 10・3 Growth of human.human hybridoma，EMK圃F7，

using serum free medium in suspension culture.

144

� _圃

田呂

ω

にJ

申 許d^可

-m ----

ロω

。

'園町圃

-ω -‘

υ

107 ITES- YLP( e )

FCS(企)

106

1 O�

2 _{3 4} 5 6

Days

Fig.l0-4 Growth of human-human hybrydoma，6・3C8，

in serum free medium

145

第 4 節 考 察

ハ イ ブ リ ド

ー

マ の 親 細 胞 株 が 無 血 清 培 養 で き る 場 ^A 口 、 そ の ハ イ ブ リ ド ー マ も 同 じ 無 血 清 培 地 で 培 養 可 能 で あ る 場 合 が 多 い (6 71 0 無 血 清 培 地 で 増 殖 可 能 な H

⁰ -

3 2 3を 親 細 胞 と し た 場 合 、 ほ と ん ど の ハ イ ブ リ ド ー マ は 1 T E S -

^{Y L}

P添

加 E

^{R D}

F培 地 で 増 殖 可 能 で あ っ た

親 細 胞 株 A 4 H 1 2 は 樹 立 当 初 無 血 清 培 養 で き な か っ た が 、 そ の 後 の 改 良 に よ り 1 T E S ^-

^{Y L}

P添 加 培 地 で 約 2 3時 間 の 倍 化 時 間 で 増 殖 可 能 と な

っ た ^{( 7 )}

。

改 良 さ れ た 親 細 胞 株 A 4 H

¹

2 を 用 い

て 作 製 さ れ た ハ イ ブ リ ド ー マ 6 - 3 C 8 は 無 血 清 培 養 可 能 で あ っ た 。 ハ イ ブ リ ド ー マ A A 3

5 C 1 0 、 1 ^B 1 0 、 4 ^D 1 1 、 C H 1 1お よ び 5 H 1 1が 1 T E S -

Y L

P 添 加 培 地 で 増 殖 で き な か っ た の は 、 無 血

清 培 養 で き な い 親 細 胞 A 4 H 1 2 を 用 い た た め と 考 え ら れ た 。 ご の よ う に 親 細 胞 株 の 増 殖 特 性 は そ の ハ イ ブ リ ド ー マ の 増 殖 特 性 に 影 響 す る

と 思 わ れ る

146

句司町

第 5 節 小 括

親 細 日包 を ^{H 0} - 3 ² 3と

1 T E S - Y L Pを 添 加

し た

E R D F培 地

と

ほ ぼ 同 様

無 血 清 培 養 可 能

な

す る

^ノ\ イ ^フ ド ^{一 マ} は ^、

E ^{R D} F 培 地 中 で

^、

F ^C S 添 加

増 殖

し た ^。

親 細 胞 株 A 4 H 1 2 で 作 製

し

た

^)\

イ ブ ド ^{一 マ}

⁶

^-

3 ^{C 8}

Lま

1 T E S - Y L P iIß 力日 E ^{R D} F

培 地 で F ^C S 添 加 培 地

^と

同 様

lこ

増 殖

し た カ三 ^鉦

血 清 培 養 で き な い 親 細 胞 株 で 作 製

し た

^)\

イ ^フ

ド ^{一 マ}

の 場 合

は

す

^ペi て

1 T E S - Y L P添 加 E ^{R D} F

培 地 で 増 殖

し な か ^つ た ^{。 L、ョ�}

の 結 果

は ^、

親 細 胞

株 の 増 殖 特 性 が

そ

の

^ノ\ イ ^フ ド ^{一 マ}

の 増 殖 特 '性 5皇 く 影 響 を 与

^え

る

と ^つ

考

^え

を 支 持 す る

も の で

あ ^つ た ^。

147

第 1 1 章 ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 分 離 精 製

第 1 節 緒 口

近 年 ^、 種 ^々 換 ^、 陽 イ オ ン 疎 水 ク ロ ^マ ト

フ フ イ ^一 の 発

容 易 な ^つ た が 応 用 さ れ 成 色 ^フ ド ウ E求 ^国 ン ド と し た ^ーJてF

の ク ト

交 換 ^、 担 体 な

達 よ

。 抗 体

果 を あ の 産 生

フ イ ^一一 マ

ヒ ど

り の しず す

ア

一 は

I ^{g G}

の 精 製 に 非 常

'"?

れ ら の 方 法 を ヒ ト

しー

ト 用 担 体

ド ロ キ ^{ン ーノーァ} を 用 ^い た タ ン ノて ク 5周 製 も ^{し‘ヲー，}

て る ( 6 8 )

る ^フ ロ ア イ

イ ^一 ク ロ ^マ

有 効 で あ

M

_a

b

の 精 製

よ り 簡 便 で 迅 速 な 実 験 室 ^レ

^.1'\.

jレ で 製 法 を 確 立 し よ ^つ と 試 み た ^。

148

陰 イ オ ン 3と

ノて タ イ ト ^、

ク ロ ^マ ト グ 質 の 精 製 が れ ら の 方 法

。 ま た ^、 昔

ン

A

を

j}

ト グ ^{フ フ イ}

る ^。

に 応 用 し の 抗 体 の 調

第 2 節 実 験 材 料 お よ び 方 法

第 l 項 器 具 お よ び 試 薬

実 験

^{ニ伊3士ム=ζ二ー・}

用

^{ク ロ マ 卜 カ フ ム m 1容 、 ー-;子} 、、

コ

ン

^社

2

^{ヒ ド ロ キ ユノ ーJて子 ノて}

タ イ ト ^{B i}

⁰

^{R a d}

^{社 、 ノミ}

イ オ ゲ ノレ

H T

3

ゲ jレ

j慮 過 用 体

^、

^S

^e

^{p h a}

^{c r y}

^{1 S}

^-

^{3 0 0}

( ^{P h a}

^{r m}

^a

^c

^{i a社}

4

フ ^ロ ア

イ ン A

^{カ フ ム}

^{P h a}

^{r m}

^a

^c

^{i a}

^社

5

ヒ ド ^ロ キ ン ^ーノ勺〉

}、

タ

イ ト 用 緩 衝 f佼

A f佼 o

^.

^{0 5 M K C 1} 添 力日 ^{1 0}

^{m Mリ}

ン 酸

^{カ ウ ム}

緩 律? f佼 ^{p H}

B f佼 o

^.

^{3 M K C 1} 添 力日 ⁵⁰⁰

^m

^M ン 酸

^{カ ウ}

ム

緩 律1 f佼 ( ^{p H}

6

フ ^ロ ア

イ ン A カ

^{フ ム ク ロ マ}

ト 用 緩 種? J佼

、小士口 A 口

用 緩 街 f佼 ^{M N a C 1} ?� 力日 ¹

^.

^{5 M} グ

シ ン Y谷 f佼 ^{p H}

溶 出 用 緩 律i f佼 o

^.

¹

^{Mク コニ}

ン 酸 緩 衝 f佼 ^{( p H}

149

『司

中 和 用 緩 衝 液 : 1 M T

r

i

s -

H C 1 ( ^{p H} 8 . 0 )

カ ラ ム 再 生 用 緩 衝 液 : O . 1 M ク エ ン 酸 緩 衝 液

( ^{p H} 3)

第 2 項 実 験 方 法

1 g M

_型

の 抗 体

_Lま

次 の よ

つ

し て 精 製 し た

。

培 養 上 清 3 12

を ポ ^ーノフ サ イ ズ

o

^.

8 _μ m の

フ イ jレ

タ ^一 で

i慮 過

_し

た 後 _A

_f佼

で 平 衡 化

_し

た

^ヒ _ド ^ロ キ シ ^{ーーァノ ノて} タ イ ト カ ^フ

ム 吸 着 さ せ た f麦

、

B

f佼 の

濃 度

^を

1 8 % 6 0 %と

ス ア ツ フ ワ イ ズ に

上 昇 さ せ る

^し-ヲー'

と よ り

Y谷

出 し た

。 J谷

出

f佼 Lま

10m

_1ず

つ

分 取

_{し た} 。

抗 体 量 の

^コノケノ

い 画 分

^を _ゲ

ル ;慮 過

か

け た

。 Y谷

出

_{f佼 は} ^m _{1ず つ}

分 取 し た

。 ゲ

ル 鴻 過 後 の 画 分

_は 、

日及 光 度 280

n

m の 演IJ

疋

お よ び 抗 体 量 の 測 定

^を

行 な

^つ _た 。

1 g G

型

の 抗 体 の 精 製

_は 、

千 葉 の 方 法

^{( 6 8 ) を}

参 考 し 次 の よ

つ し

て ?ラ な

^つ

た

。

培 養 上 清

12

を

A

f佼 に

対 し て 透 析 し

、 ポ

7

サ イ ズ o ^.

8

μ m の

フ イ jレ タ ^一

で i慮 過 し た 後 _A

_子佼

で 平 衡

150

『司

化 し た ヒ ド ロ キ ^ユノ

^-;

^{て? ノて} タ イ ト カ ^フ ム 吸 着 さ

せ た ^。 次 lこ ^、

^B

液 の 濃 度 を

^{5 0}

%に 上 昇 さ せ る

Lテ と よ り ^{谷 出 し た ^{。 Y谷} 出 ^f佼 Lま ^m 1ず つ 分 取

し た ^。 得 ら れ た 抗 体 画 分 を ^、 結 合 用 緩 衝 液 に

対 し て 一 晩 透 析 し 結 合 用 緩 衝 液 で 平 衡 化 し た フ ロ ア イ ^ン

^A

カ ^フ ム 吸 着 さ せ た ^。 溶 出 用 緩 衝 液 で 抗 体 を 溶 出

4

^m 1ず つ 分 取 し た 後 直 ち に 中 和 用 緩 衝 液 を

1/4

量 添 加 す る ^{にーτ一，} と

よ り 中 和 し た ^。

主E旦¹ を 測 定 し た ^。

緩 衝 液 で 洗 浄 し 抗 体 量 の 測 定 し ^、 抗 体 の 純 度

つ た ^。

第 3 節 結 果

P B S

対 し て 晩 透 析 し 抗 体

フ ロ ア イ ^ン

^A

カ ^フ ム は 再 生 用 再 び 使 用 し た ^。

は す ^べ て

E L 1 S A

よ ^つ て 測 定

を

S D S - P A G E

^{( 5 5} ) に よ ^つ て 行 な

ハ イ ブ リ ド ー マ

^H

1

^{5 F}

2が 生 産 す る 抗 体 (

^{1 g M}

芥リ lま ヒ ド ロ キ シ ア パ タ イ ト カ ラ ム (

F i g .

1 1 - 1 ) お よ び ゲ ル 滅 過 カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ