序 文
エンテロウイルス（EV）感染症は小児期の重要 な疾患であり，その臨床症状および原因となるウ イルスの血清型は多種多様で，毎年さまざまなウ イルスの流行が認められている．EV 感染症の診 断は通常， ウイルスの分離・同定で行われている．
ウイルス分離は確実な診断方法であるが，判定ま でに時間を要すること，特定のウイルス検出には 動物を用いる必要があること，さらにはウイルス 変異等により中和で同定できない場合があるなど の問題点も保有している．また臨床サイドからは 迅速な情報の還元が望まれている状況である．
本研究においては，感染症サーベイランス事業
における通常のウイルス分離と同時に，viral pro- tein（VP）1 領域を増幅する RT-PCR を用いて患 者材料からの迅速な EV 遺伝子検出を行い，ウイ ルス分離成績と比較することにより，PCR 法の有 用性を検討することを目的として実験を行った．
材料と方法
披検検体として 2003 年 4 月から 2004 年 7 月の 間に大阪府下の感染症発生動向調査検査定点医療 機関で採取された無菌性髄膜炎，手足口病，ヘル パンギーナ，急性脳炎，上気道炎および感染性胃 腸炎患者 860 名（成人 23 名含む）からの糞便 114 検体，咽頭拭い液 410 検体および髄液 472 検体を 用いた．ウイルス分離は Vero および RD18s 細胞 を用いて通常の方法で行い，3 代まで継代して判 定を行った．分離ウイルスの型同定は中和試験で 行った．
大阪府におけるエンテロウイルス感染症
―ウイルス分離と viral protein 1 領域を用いた RT-PCR の比較検討―
大阪府立公衆衛生研究所
山 崎 謙 治 大 竹 徹
（平成 16 年 8 月 26 日受付）
（平成 16 年 11 月 29 日受理）
2003 年 4 月から 2004 年 7 月の間に大阪府下の医療機関で採取されたエンテロウイルス（EV）感染症 の可能性のある患者 860 名（996 検体）から，ウイルス分離および，viral protein 1 領域を増幅する RT- PCR によるウイルス遺伝子の検出を行った．両法を合わせた臨床材料別のウイルス陽性率は糞便 48.2％，咽頭拭い液 38.3％，髄液 18.0％ であった．診断名別の陽性率ではヘルパンギーナが 44.7％ と最 も高かったが，脳炎は 13.4％ と最も低い検出率であった．全検体からの分離によるウイルス陽性率は 15.6％，RT-PCR による陽性率は 22.3〜24.7％ であり，両法を合わせたウイルス陽性率は 29.8％ であっ た．viral protein 1 領域の RT-PCR 法による EV の検出は，分離法よりも迅速であり，さらにコクサッ キー A 群ウイルスの検出に優れていたことから，ヘルパンギーナの診断には非常に有用な方法であると 思われた．
〔感染症誌 79：117〜121，2005〕
要 旨
別刷請求先；（〒537―0025）大阪市東成区中道 1―3―
69
大阪府立公衆衛生研究所 山崎 謙治
enterovirus, virus isolation, RT-PCR, viral protein 1, herpangina Key words：
Table 2 Number and rate of viral detection by clinical diagnosis Total RT-PCR
Virus isolation Clinical diagnosis
134（27.6%）
107（22.0%） ＊ 77（15.8%）
Aseptic meningitis
126（44.7%）
101（35.8%） ＊＊
59（20.9%）
Herpangina
19（36.5%）
14（26.9%）
11（21.2%）
HFMD
11（13.4%）
9（11.0%）
5（ 6.1%）
Encephalitis
16（35.6%）
13（28.9%）
8（17.8%）
Pharyngitis
3（27.3%）
1（ 9.1%） ＊＊＊
2（18.2%）
Gastroenteritis
＊：p ＜ 0.025 ＊＊：p ＜ 0.005 ＊＊＊：Norovirus was detected by two patients Table 1 Number of patients and speci-
mens by clinical diagnosis
specimens patients
Clinical diagnosis
486 415
Aseptic meningitis
282 276
Herpangina
82 54
Encephalitis
52 33
HFMD ＊
45 45
Pharyngitis
20 11
Gastroenteritis
30 26
Others
＊：Hand, foot and mouth disease
RT-PCR による EV の検出および同定は既報の 方法
1）に準じた．すなわち 10％ 糞便乳剤，咽頭拭 い液および髄液 250
µl から ISOGEN-LS（和光純 薬） を用いて RNA を抽出し， RT-PCR を行った．
用 い た プ ラ イ マ ー は Oberste ら
2）の プ ラ イ マ ー sense 012，040 お よ び antisense 011（position；
2951―3389， 以下 Z プライマーと略す）を用いて viral protein （VP） 1 領域を増幅した．PCR は 94℃
30 秒，50℃ 1 分，72℃ 1 分を 40 サイクル行った．
ま た 一 部 の 検 体 に つ い て は 同 じ く プ ラ イ マ ー sense 187，188，189 お よ び antisense 222（posi- tion；2612―2951， 以下 X プライマーと略す）を用 いた PCR も行った．PCR 産物は 0.5
µg
!ml のエチ ジウムブロミドを含む 2％ アガロースゲルで電気 泳動をし，紫外線照射でバンドを確認した．PCR 陽 性 産 物 は Microcon 遠 心 フ ィ ル タ ー
（TaKaRa）でプライマーを除去した後，PCR プラ イマーを用い，ダイレクトシーケンスを行った．
塩基配列による型同定は，NCBI BLAST search で塩基配列アライメントの最も高いウイルスと 75％ 以上の相同性を保有するものを同じ血清型
であると同定した．
ウイルス分離および RT-PCR によるウイルス 検出感度の比較は，
χ2検定法または度数 5 以下に ついては Fisher の直接確率計算法により統計処 理し，危険率 5％ 以下（p＜0.05）のものを有意差 ありとした．
成 績
ウイルス分離を行った患者 860 名中，無菌性髄
膜 炎 患 者 が 全 体 の 48.4％ を 占 め て い た（Table
1） ．臨床材料 996 検体からの分離と PCR 法を合わ
せたウイルス陽性率は糞便 48.2％，咽頭拭い液
38.3％，髄液 18.0％ であった（データ示さず）．診
断名別にみたウイルス陽性率は，ヘルパンギーナ
が 44.7％ と最も高かったが，脳炎は 13.4％ と検出
率が最も低かった．また分離と PCR による検出感
度はヘルパンギーナ（p＜0.005）および無菌性髄膜
炎（p＜0.025）において有意差が認められた（Ta-
ble 2） ．Table 3 にウイルス分離と PCR によるそ
れぞれのウイルス検出数を示した．エコーウイル
ス（E）は 7 種のウイルスが検出されたが，分離と
PCR （Z） との比較では E18（p＜0.01）の陽性率に差
が認められた．ヘルパンギーナのおもな原因であ
るコクサッキー A 群ウイルス（CA）のうち CA10
は分離と PCR（Z）による検出感度に差はなかった
が，CA4（p＜0.005），CA6（p＜0.01）など他の A
群ウイルスは PCR のみで検出された．コクサッ
キー B 群ウイルス（CB）は CB4（p＜0.025）およ
び CB5（p＜0.025）が PCR（Z）よりも分離による
検出感度の方が高かった．しかし，PCR（X）を含
めると分離法との差はなかった．最終的に分離に
よるウイルス陽性率は 15.6％，PCR による陽性率
は 22.3〜24.7％ であり，PCR（p＜0.005）の検出感
Table 3 Viruses detected by virus Isolation and RT-PCR
Virus isolation and/or RT-PCR RT-PCR
Virus isolation
Virus Z ＊and/or
X ＊＊
Z
36 28
28 26
Echo 6
6 5
5 3
Echo 7
1 1
1 1
Echo 9
4 4
4 0
Echo 13
2 2
2 0
Echo 16
14 14
14 ＊＊＊＊
2 Echo 18
5 5
5 2
Echo 27
75 62
62 44
Echo 30
5 4
3 5
Coxsackie B1
1 1
1 1
Coxsackie B2
8 3
1 8 ＊＊＊
Coxsackie B4
15 6
3 13 ＊＊＊
Coxsackie B5
3 3
2 0
Coxsackie A2
44 44
40 ＊＊＊＊＊
0 Coxsackie A4
10 10
10 ＊＊＊＊
0 Coxsackie A6
3 3
2 0
Coxsackie A9
40 30
29 33
Coxsackie A10
5 5
3 1
Coxsackie A16
17 11
5 13
Enterovirus 71
3 3
2 2
Polio 2
1 1
0 1
Polio 3
297 246
222 ＊＊＊＊＊
155 Total
29.8 24.7
22.3 15.6
Positive rate（%）
＊：The primer pairs which amplify 3389 from 2951 of the genomic position
＊＊：The primer pairs which amplify 2951 from 2612 of the genomic position
＊＊＊：p ＜ 0.025 ＊＊＊＊：p ＜ 0.01 ＊＊＊＊＊：p ＜ 0.005
Table 4 Comparison of the sensisivity with virus isolation and RT-PCR
Virus isolation Total
−
＋
246 143 103
＋ RT-PCR ＊
750 698 52
−
996 841 155 Total
＊：p ＜ 0.005
度が高かった．両法を合わせたウイルス陽性率は 29.8％ であった（Table 4） ．
考 察
2003〜2004 年にかけて EV 感染の可能性のあ る患者の臨床検体を用いて，ウイルス分離と RT- PCR 法による EV 検出感度の比較を行った結果，
分離で検出されたウイルスは 155 株，また PCR
で検出されたのは 246 株であり，両法共にまたは いずれか一法で検出されたウイルスは 297 株で あった． 従って既報
1）と同様に両法を併用すること が最も効率的であると言えた．
患者材料別では糞便からのウイルス陽性率が最 も高かったことから，EV 検索において糞便を用 いることは確定診断に至らなくとも原因を推定す るのに有用であると思われた． 診断名別にみると，
ヘルパンギーナでは半数近くで原因ウイルスが特 定できたが，脳炎は大半で原因が不明であり，原 因ウイルスがさらに多様である，もしくは感染後 の二次的な発病機序が働いているなどの要因があ るのかも知れない．
PCR による臨床材料からの EV 検出は，5 non-
coding region（5 NCR）領域の増幅および nested
PCR によるものが多いが，single step PCR とウイ
ルス分離成績を比較した実験における EV 検出率 は，PCR が 21％，分離が 7％ であったと報告され ている
3）．患者材料を用いた VP1 領域のウイルス 検出感度の評価はなされていないが，EV 標準株 および分離株を用いた VP1（Z）の PCR は 5 NCR と同等に高い検出感度を示した
4）．また系統樹解 析から，5 NCR 領域では遺伝子型と血清型の不一 致がみられるが，VP1 領域では一致することが報 告された
5）．
今回，CA 中 CA10，16 以外はすべて分離法で は検出されなかったが，1〜24 型まである CA 群 ウイルスの中で，国内でしばしば流行するのは CA2〜6，8〜10，16 型である．このうち培養細胞 で比較的容易に分離されるのが CA9，16 で， 他は すべてヘルパンギーナの原因ウイルスであり，そ の大半が多くの培養細胞に対して低い感受性しか 示さず，ホ乳マウスを代用しなければ分離が不可 能であることが報告されている
6）〜8）．ホ乳マウス を用いることは設備，労力とも多大なものがある ので，CA 群ウイルスの検出には PCR 法が優位で あると言える．一方で CB4 および CB5 は Z プラ イマーによる検出率が低かったことから，VP1 領域増幅においては 1 種類のプライマーセットで は不充分であることが明らかになった．しかし VP1 と共に EV 型同定に適している VP4―2 領域 の PCR
9）は，われわれの方法による予備実験では 非特異的バンドが強く出現したために以後の実験 を行わなかった．
塩基配列で 75％ 以上の相同性を有するものは 同じ血清型であるとする Oberste ら
10）の定義によ る型同定では，3 例を除いて分離および PCR で検 出されたウイルスの血清型は一致した．一致しな かった 3 例は 2 種類のウイルスが重複感染したも のと考えられた．PCR で同定できなかった 11 株 は，非特異的バンドによるシーケンス反応阻害の ため解読不能であったもので，配列が読みとれた ものはすべて血清型の同定が可能であった．
結論として，ウイルス分離陽性であっても PCR 陰性の事例がみられたことから，さらに PCR の感 度を上げるために nested PCR を検討する余地も あると思われるが，本法のみにおいても全体的に
はウイルス分離法よりも高感度であり，特に CA が主な病因となるヘルパンギーナの診断には非常 に有用な方法であろうと思われた．
文 献
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