Exploration of covariates predicting pharmacokinetic variability of imatinib mesylate for personalized treatment of chronic myeloid leukemia patients

熊本大学学位論文

慢性骨髄性白血病における個別化投与設計を目的とした 分子標的薬イマチニブの体内動態変動要因の探索

2011 山川 裕司

Exploration of covariates predicting pharmacokinetic variability of imatinib mesylate for personalized treatment of chronic myeloid leukemia patients

Yuji Yamakawa

Exploration of covariates predicting pharmacokinetic variability of imatinib mesylate for personalized treatment of chronic myeloid leukemia patients

Yuji Yamakawa

Imatinib mesylate has been approved as a molecularly targeted drug that selectively inhibits Bcr-Abl tyrosine kinase (which causes Philadelphia-positive chronic myeloid leukemia (CML)) and KIT tyrosine kinase (which causes KIT-positive gastrointestinal stromal tumors). Considerable interindividual differences have been observed in imatinib pharmacokinetics. It is therefore important to identify covariates that could provide predictive markers for imatinib exposure in order to maintain trough plasma levels at an effective concentration.

Therefore, this study demonstrated the covariates on the pharmacokinetic variability of imatinib for the purpose of personalized administration. The results obtained in this study are summarized as follows:

1. Pharmacokinetic parameters of imatinib were estimated by a population pharmacokinetic (PPK) analysis based on 622 plasma samples from 34 Japanese CML patients. Approximately 4.6-fold variability in individual clearance was observed (range, 3.4-15.5 L/hr). It has been assumed that imatinib clearance of Japanese people is relatively low compared with that of Caucasians.

2. Imatinib transport characteristics in human embryonic kidney (HEK) 293 cells transfected with OCTN2, OATP1A2, OCT1, OATP1B1, OATP1B3 or OATP3A1, the human intestinal cell line Caco-2, and the CML cell line K562 cells were evaluated. Imatinib uptake was significantly enhanced in OCTN2, OATP1A2, OCT1 or OATP1B3-transfected HEK293 cells. Inhibitory effect of inhibitors on imatinib uptake in Caco-2 cells suggested that OATP1A2, OATP2B1 and OCTN2 could be involved in intestinal absorption process of imatinib. Inhibitory effect of the inhibitors on imatinib uptake in Caco-2 cells suggested that OATP1A2, OATP2B1, OCTN2 and OCT1 may play a certain role in intracellular accumulation of imatinib in target tumor cells. I characterized the contribution of solute carriers to imatinib transport.

3. I evaluated the influence of factors including 14 single-nucleotide polymorphisms

(SNPs) in 3 genes coding for influx transporters ( SLC22A1 , SLCO1B1 , and SLCO1B3 ),

2 genes coding for efflux transporters ( ABCB1 and ABCG2 ), and 4 genes coding for

enzymes ( CYP2C9 , CYP2C19 , CYP2D6 , and CYP3A5 ) on the pharmacokinetics of imatinib at steady-state to identify covariates predicting variability in imatinib pharmacokinetics in Japanese patients with CML. The individual estimated clearance was significantly increased in patients with SLCO1B3 334GG genotype (median value

 SD, 9.5  3.1 L/hr; n = 19) compared with SLCO1B3 334TT and TG genotypes (7.0  3.1 L/hr; n = 15) ( P = 0.019). Patients with ABCB1 3435CC genotype had significantly higher imatinib clearance (12.7  3.0 L/hr; n = 7) compared with patients with ABCB1 3435CT and TT genotypes (7.9  2.7 L/hr; n = 27) ( P = 0.035). The present study suggests that SNPs of the influx transporter SLCO1B3 and the efflux transporter ABCB1 were functionally associated with individual variability of imatinib pharmacokinetics in Japanese patients with CML.

4. I explored the role of OATP1A2 that is encoded by SLCO1A2 , in the cellular uptake of the imatinib, and the relationship between SLCO1A2 polymorphisms and the pharmacokinetics of imatinib in CML patients. Imatinib uptake was significantly enhanced in OATP1A2-transfected HEK293 cells ( P = 0.002). Naringin, an OATP1A2 inhibitor, decreased the transport of imatinib in OATP1A2-transfected HEK293, Caco-2, and K562 cells. Imatinib clearance of CML patients was influenced by the SLCO1A2 -1105G>A/-1032G>A genotype ( P = 0.075) and the SLCO1A2 -361GG genotype ( P = 0.005).

These findings suggest that imatinib is transported into cells by OATP1A2, and that SLCO1A2 polymorphisms significantly affect imatinib pharmacokinetics.

5. Effect of renal failure on imatinib pharmacokinetics was evaluated in 5/6 nephrectomized (5/6Nx) rats. In addition, protein expression levels and functional activities for transporters in 5/6Nx rats were also determined. Elevation of blood concentration of imatinib was observed in 5/6Nx rats. 5/6Nx had no influence on expression level of efflux transporters including P-gp, Bcrp and Mrp2 in the mucosa of small intestine and oatp4 in liver. Uptake rate of imatinib with everted sacs of intestine and liver slices were determined, but no significant differences were observed between 5/6Nx and sham rats. 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furan-propanoic acid (CMPF), a uremic toxin, decreased the transport of imatinib in OATP1B3-transfected HEK293 cells. It was suggested that CMPF inhibits the hepatic uptake of imatinib, resulting in elevation of imatinib plasma concentration associated with renal failure.

In conclusion, pharmacokinetic parameters of imatinib were estimated, and I

characterized the contribution of solute carriers to imatinib transport. Individual clearance of imatinib appeared to be associated with genetic polymorphisms in the influx transporter SLCO1B3 334T>G and efflux transporter ABCB1 3435C>T. In addition, OATP1A2 appeared to be involved in imatinib transport in intestinal cells and in target CML cells, and SLCO1A2 polymorphisms correlated with imatinib pharmacokinetics. These results raise the possibility that SLCO1B3 , ABCB1 and SLCO1A2 may be covariates for the administration of imatinib. As the individual variability of imatinib pharmacokinetics was affected by the transporter SNPs, genotypic characterization may be a useful tool for imatinib therapy in CML. Studies of imatinib pharmacokinetics in 5/6Nx rats suggested that renal failure increased blood concentration of imatinib, and inhibition of the hepatic uptake of imatinib with CMPF was assumed to cause elevation of imatinib concentration.

This study explored factors affecting the pharmacokinetic variability of imatinib.

Identification of covariates predicting variability in imatinib pharmacokinetics

could provide a basic strategy for personalized imatinib therapy.

本論文で使用した略号一覧表

ABC ATP-binding cassette ATP 結合カセット

AGP alpha-1-acid glycoprotein α1 酸性糖タンパク

ALT alanine aminotransferase アラニンアミノトランスフェラーゼ

AST aspartate aminotransferase アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ

AUC area under the plasma concentration-time curve 血中濃度－時間曲線下面積

B.A. bioavailability 生物学的利用能

BUN blood urea nitrogen 血液尿素窒素

C.I. confidence interval 信頼区間

CCR complete cytogenetic response 細胞遺伝学的完全寛解

CL clearance クリアランス

CML chronic myeloid leukemia 慢性骨髄性白血病

CMPF 3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furan-propanoic acid

CYP cytochrome P450 シトクロム P450

F bioavailability 生物学的利用能

FOCE the first order conditional estimation method 条件付一次近似法

GIST gastrointestinal stromal tumor 消化管間質腫瘍

HEK human embryonic kidney ヒト胎児由来腎臓

Het heterozygous variant ヘテロ変異型

HPLC high performance liquid chromatography 高速液体クロマトグラフィー IRIS International Randomized Study of Interferon and STI571

IS indoxyl sulfate

KA absorption rate constant 吸収速度定数

Km Michaelis constant Michaelis-Menten 定数

MMR major molecular response 分子遺伝学的寛解

NONMEM non linear mixed effect model 非線形混合効果モデル

5/6Nx 5/6 nephrectomized 5/6 腎臓摘出

OAT organic-anion transporter 有機アニオントランスポータ

OATP organic-anion transporting polypeptides 有機アニオントランスポーターポリペプチド

OCT organic-cation transporter 有機カチオントランスポータ

PBS phosphate buffered saline 等張リン酸緩衝液

PCS p-cresol sulfate

PPK population pharmacokinetics 母集団薬物動態

ROC receiver Operating Characteristic curve 受信者動作特性曲線

SLC solute carrier 溶質輸送担体

SNP single nucleotide polymorphism 一塩基多型

STS soft tissue sarcoma 軟部肉腫

Var homozygous variant ホモ変異型

Vd central volume of distribution 分布容積

Vmax maximum reaction velocity 最大輸送速度

WT homozygous reference sequence 野生型

本論文は、学術雑誌に掲載された次の論文を基礎とするものである。

1. Association of genetic polymorphisms in the influx transporter SLCO1B3 and the efflux transporter ABCB1 with imatinib pharmacokinetics in patients with chronic myeloid leukemia.

Therapeutic Drug Monitoring 33, 244-50(2011)

Yamakawa Y, Hamada A, Nakashima R, Yuki M, Hirayama C, Kawaguchi T, Saito H.

2. Pharmacokinetic impact of SLCO1A2 polymorphisms on imatinib disposition in patients with chronic myeloid leukemia.

Clinical Pharmacology and Therapeutics 90, 157-63(2011)

Yamakawa Y, Hamada A, Shuto T, Yuki M, Uchida T, Kai H, Kawaguchi T, Saito H.

目次

緒言 ... - 1 -

第 1 章 慢性骨髄性白血病患者におけるイマチニブの母集団薬物動態解析 ... - 5 -

第 1 節 序 ... - 5 -

第 2 節 結果 ... - 6 -

2-1 患者背景 ... - 6 -

2-2 薬物動態解析 ... - 6 -

第 3 節 考察 ... - 8 -

第 2 章 イマチニブ細胞膜輸送を媒介する薬物トランスポータの同定 ... - 9 -

第 1 節 序 ... - 9 -

第 2 節 結果 ... - 10 -

2-1 各種トランスポータ発現 HEK 細胞におけるイマチニブ取り込み ... - 10 -

2-2 Caco-2 細胞におけるイマチニブ細胞内輸送 ... - 10 -

2-3 K562 細胞におけるイマチニブ細胞内輸送 ... - 11 -

第 3 節 考察 ... - 13 -

第 3 章 イマチニブ体内動態に及ぼす種々トランスポータおよび薬物代謝酵素の遺伝子多 型の影響 ... - 15 -

第 1 節 序 ... - 15 -

第 2 節 結果 ... - 16 -

2-1 遺伝子解析 ... - 16 -

2-2 遺伝子多型とイマチニブクリアランスの関連性 ... 19

第 3 節 考察 ... 20

第 4 章 イマチニブ体内動態に及ぼす OATP1A2 および SLCO1A2 SNPs の影響 ... 22

第 1 節 序 ... 22

第 2 節 結果 ... 24

2-1 OATP1A2 発現 HEK293 細胞におけるイマチニブ取り込み ... 24

2-2 Caco-2 細胞における OATP1A2 を介したイマチニブ経上皮輸送 ... 25

2-3 K562 細胞における OATP1A2 を介したイマチニブ取り込み ... 25

2-4 SLCO1A2 遺伝子解析 ... 26

2-5 SLCO1A2 遺伝子多型がイマチニブクリアランスに及ぼす影響 ... 27

第 3 節 考察 ... 29

第 5 章 腎機能低下に伴うイマチニブ体内動態変動と影響因子 ... 33

第 1 節 序 ... 33

第 2 節 結果 ... 34

2-1 慢性腎不全モデルラットにおけるイマチニブ体内動態変動 ... 34

2-2 慢性腎不全モデルラットにおける小腸トランスポータ発現量変動および反転 腸管におけるイマチニブ輸送実験 ... 35

2-3 慢性腎不全モデルラットにおける肝トランスポータ発現量変動および肝スラ イスにおけるイマチニブ輸送実験 ... 36

2-4 尿毒症物質によるトランスポータ機能変動 ... 37

第 3 節 考察 ... 38

第 6 章 総括 ... 40

実験の部 ... 43

第 1 章 ... 43

第 2 章 ... 45

第 3 章 ... 47

第 4 章 ... 49

第 5 章 ... 52

謝辞 ... 54

引用文献 ... 55

- 1 -

緒言

イマチニブ(販売名グリベック)は、慢性骨髄性白血病(chronic myeloid leukemia; CML) の原因となるフィラデルフィア染色体の異常遺伝子 Bcr-Abl のチロシンキナーゼ活性を選 択的に阻害する分子標的薬である

。IRIS(International Randomized Study of Interferon and STI571)試験では、イマチニブ導入前の標準治療であるインターフェロン α とシタラ ビン併用療法に比べて高い効果が得られ、CML 治癒率の著明な向上を実現している

。

薬物血中濃度が治療効果と密接に関連する場合、薬物動態インフォメーションは投与設 計の指標となりうるが、イマチニブに関しても血中トラフ濃度が臨床効果と相関すること が Picard らにより報告された

。すなわち、イマチニブを投与した CML 患者における血中 濃度を測定した結果、分子遺伝学的寛解(major molecular response; MMR)を認めた群は MMR 未到達群に比較して有意に高値を示し、ROC(Receiver Operating Characteristic curve) 解析による概算では、血中トラフ濃度 1002 ng/mL 以上で MMR が期待されることがはじめて 提示され(Figure 1)、イマチニブ治療において最適な臨床効果を確保する上で、血中濃度 測定の意義が示された。Larson らもイマチニブ血中トラフ濃度と臨床効果との相関を解析 している

。細胞遺伝学的完全寛解(complete cytogenetic response; CCR)に到達した CML 患者は未到達 CML 患者に比較して血中トラフ濃度が有意に高く(1009  544 vs 812  409 ng/mL, respectively; P  0.004, Wilcoxon test)、提示された有効血中濃度 1000 ng/mL は Picard らの ROC 解析結果と概ね一致した。

Figure 1. Trough plasma imatinib threshold for MMR.

The line across each box is the median; the bottom edge is the first quartile and the top edge is the third quartile;

the error bars represent minimal and maximal values.

Without MMR With MMR 0

1000 2000 3000

Plasma concentration (ng/mL)

1002ng/mL

- 2 -

このような背景を踏まえ、熊本大学医学部附属病院では 8 年に渡り CML 患者の治療モニ タリングを推進しており、CML 患者のイマチニブ血中濃度や投与量、臨床効果等の情報を蓄 積および解析している

。その結果、イマチニブの標準投与量である 400 mg/day よりも少 ない 300 mg/day でも臨床効果を得られる症例が存在すること、これら患者群は体表面積が 小さくかつ高齢であり、女性の割合が多いことを報告した。一方、イマチニブ体内動態の 個体間変動は大きく、体表面積や年齢、性別だけでは説明できない変動要因の可能性が想 定された。CML 患者の治療モニタリングを通して、副作用により減量せざるを得ない症例、

もしくは効果不十分な症例が顕在化しつつあるため、個別投与設定の必要性が示唆された。

近年、イマチニブ体内動態の個体間変動の要因を明らかにするための研究が注目されて いる。投与されたイマチニブは主に肝代謝及び胆汁排泄により消失する

。また、

ATP-binding cassette(ABC)トランスポータ ABCB1(P-glycoprotein)、ABCG2(breast cancer resistance protein)、有機カチオントランスポータ OCT1、OCTN2、有機アニオントランス ポータ OATP1B3、OATP1A2 がイマチニブの細胞膜輸送に関与すること

、更に cytochrome P450 (CYP)2C9、2C19、2D6、3A4、3A5 がイマチニブの代謝に関与することが報告された

6

(Figure 2)。これら薬物動態特性を基にした薬理遺伝学的研究によると、ABCB1

、ABCG2

、 CYP2D6

の遺伝子多型がイマチニブ体内動態の個体間変動に少なくとも一部関与すること が示唆されている。

Figure 2. Scheme for the involvement of drug transporters and drug-metabolizing enzymes in imatinib pharmacokinetics.

IM

OCT1 OCTN2 OATP1B3

IM IM

IM

IM

IM

IM

Intestinal lumen Blood vessel Hepatocyte

OCTN2 OATP1A2

ABCB1 ABCG2

ABCB1 ABCG2 IM

IM

IM IM

IM

IM IM

Gut wall

Bile duct

CYP2C9

CYP2C19

CYP2D6

CYP3A4

CYP3A5

- 3 -

母集団薬物動態(PPK)解析によりイマチニブ PPK パラメータを算出するとともに、変動要 因を明らかにするためのモデリングも種々行われている

。

Judson ら は 、 軟 部 肉 腫 (soft tissue sarcoma; STS) 患 者 お よ び 消 化 管 間 質 腫 瘍 (gastrointestinal stromal tumor; GIST)患者を対象としてイマチニブ PPK 解析を行って いる

。イマチニブ投与開始日(day1)における患者 42 人の血中濃度 319 点、day29 におけ る患者 33 人の血中濃度 124 点、約 12 か月投与時(extension phase)における患者 24 人の 血中濃度 74 点を基にして計 3 回の PPK 解析を行い、各 phase における母集団平均クリアラ ンスを比較し、更に day1 におけるクリアランス変動要因として体重と白血球数を挙げてい る。しかしながら day1 では血中濃度が定常状態に到達しておらず、正確なクリアランスが 算出できていない可能性も想定される。定常状態に到達したと考えられる extension phase では、クリアランスは 14.74 L/hr となることが提示されている。

Menon-Andersen らは、小児におけるイマチニブ投与量設定を行うことを目的として、7

～24 歳の小児～若年成人の CML 並びに GIST 患者 26 人を対象とした PPK 解析を行った

。 イマチニブ投与開始 day1 および day8 において、投与後 0.5、1、1.5、2、4、8、24 時間に 経時的に得られたイマチニブ血中濃度を詳細に解析しているものの、投与開始直後の定常 状態に到達していない血中濃度データのバラツキが大きく、最終モデルの血中濃度予測精 度に問題がある。母集団平均クリアランスは 6.81 L/hr と小さく、小児～若年層を対象と していることが影響を及ぼしている可能性がある。また、クリアランスと分布容積の両方 に体重が有意に影響することを示している。

Schmidli らは、慢性期 CML 患者 371 人(18～70 歳)から得られたイマチニブ治療開始 day1 および day29 における血中濃度を基にした PPK 解析を行っている

。Day1 における母集団 平均クリアランスは 14 L/hr であり、day29 ではクリアランスが約 25%低下したと報告して いるが、投与開始直後 day1 における母集団平均クリアランスは予測精度が低い可能性が推 察される。クリアランス変動要因および分布容積変動要因として体重、白血球数に加え、

ヘモグロビン濃度を挙げているものの、白血球数やヘモグロビン濃度がイマチニブクリア ランスに影響を及ぼす要因については不明である。

Widmer らは 59 人の CML 及び GIST 患者から得られた 321 点の血中濃度を基にした PPK 解 析を報告している

。イマチニブ投与開始から 1 か月以上経過した患者を対象としており、

定常状態に到達した血中濃度データのみを解析している点が前述の報告と異なる。母集団 平均クリアランスは 14.3 L/hr であり、体重、年齢、性別に加えてα

酸性糖タンパク(AGP) 値が血中濃度に影響を与えることを初めて示している。イマチニブは血中で主に AGP に結 合するため、AGP 濃度がイマチニブ血中濃度に影響する可能性があることが報告されており

6,22

、AGP がクリアランス変動要因であることは従来の報告と一致する。

Delbaldo らは 35 人の GIST 患者におけるイマチニブ投与開始 day1、day30 及び day60 に

おける血中濃度を基にした PPK 解析を報告している

。年齢、体重を含めた 17 の変動要因

を検討した結果、AGP 濃度のみがクリアランス変動要因であることを示しており、イマチニ

- 4 -

ブ体内動態の個体間変動に AGP が重要な役割を担っていると指摘している。母集団平均ク リアランスは 8.13 L/hr と他の論文に比較して著しく低く、原因は不明である。

Petain らも同様に、クリアランス変動要因として AGP 値を挙げている

。33 人の小児固 形悪性腫瘍患者及び 34 人の成人 GIST 患者を対象としてイマチニブ投与開始 day1 及び定常 状態における血中濃度を基にした PPK 解析を行っており、母集団平均クリアランスは 7.29 L/hr と低く、小児を含んだ母集団を対象としていることが一部影響している可能性がある。

AGP 値に加えて、体重、アルブミン値もクリアランスに有意な影響を与え、これら 3 つの変 動要因により、個体間変動の 28%を説明できたことを報告している。

しかしながら主に白人を対象とした報告しか無く、日本人の PPK 解析は未だ行われてい

ない。日本人のイマチニブ薬物動態パラメータは不明であり、現在用いられている標準投

与量である 400 mg/day は、海外での臨床研究結果を踏襲したものである。本投与量は、日

本人の薬物動態学的特性に適した投与量であるか不明瞭であるため、日本人 CML 患者を対

象とした薬物動態学的検討が必要と考えられる。また Judoson らは、イマチニブクリアラ

ンスには約 73%の大きな個体間変動があることを見出していることから

、未報告の薬物動

態変動要因を探索することにより個体間変動因子を明らかにできる可能性がある。そこで

本研究ではイマチニブ個別投与設計を目的として、熊本大学医学部附属病院にてイマチニ

ブ薬物療法を行った日本人 CML 患者を対象とした PPK 解析を行い日本人のイマチニブ薬物

動態パラメータを明らかにするとともに、薬物動態変動要因探索を行った。

- 5 -

第 1 章 慢性骨髄性白血病患者におけるイマチニブの母集団薬物動態解析

第 1 節 序

イマチニブ臨床試験の結果、イマチニブの標準投与量は世界的に 400 mg/day とされてい る

。しかしながら、イマチニブ体内動態には大きな個体間変動があることが報告されてい る。たとえば、Judoson らは 42 人の GIST 患者においてイマチニブクリアランスは約 73%の 個体間変動があることを示している

。イマチニブ体内動態の個体間変動は、CML 患者にお いて臨床効果を低下させることがある

。PPK 解析により PPK パラメータを算出するととも に、薬物動態変動要因を明らかにするためのモデリングが多数行われている

。しかしな がら白人を対象とした報告しか無く、日本人の PPK は未だ行われておらず、日本人のイマ チニブ薬物動態パラメータは不明である。

熊本大学医学部附属病院では 8 年以上に渡り CML 患者の治療モニタリングを推進してお

り、体表面積や年齢、性別が薬物動態変動要因である可能性を報告しているが

、体内動態

の個体間変動は大きく、副作用により減量せざるを得ない症例、もしくは効果不十分な症

例が顕在化しつつあり、個別投与設定の必要性が示唆されている。そこで本研究では、熊

本大学医学部附属病院にてイマチニブ治療を行った日本人 CML 患者を対象とした PPK 解析

を行い、イマチニブ体内動態パラメータを算出・評価した。

- 6 - 第 2 節 結果

2-1 患者背景

対象とした日本人 CML 患者のイマチニブ治療開始時の年齢中央値は 51 歳(範囲 21-80 歳) であった。また、その他の患者背景や臨床検査値は、Table 1 に示した。

Table 1. Patient characteristics

Characteristic Median (Range) Gender (n)

Male 20 Female 14

Age (years) 51 (21-80) Height (cm) 163 (147-188) Weight (kg) 62 (40-83) Body surface area (m

) 1.7 (1.3-2.0) Ideal body weight (kg) 60 (45-82) Aspartate aminotransferase (IU/L) 22 (9-61) Alanine aminotransferase (IU/L) 18 (7-220) Blood urea nitrogen (mg/dL) 13 (8-24) Serum creatinine (mg/dL) 0.8 (0.5-1.5) Creatinine clearance (mL/min) 83 (24-133)

2-2 薬物動態解析

イマチニブ投与からの採血時刻および血中濃度は、Figure 3 に示した。

Figure 3. Distribution of plasma concentrations of imatinib.

0 2000 4000 6000

0 8 16 24 32

Time after dose (hr)

Pl asma co nce n tr a tio n (n g/ mL )

- 7 -

イマチニブ投与からの採血時刻は主に 24 時間に集中していた。対象患者において観測さ れた臨床効果や副作用の詳細は、過去の報告に記述した

。イマチニブ薬物動態は 1-コンパ ートメントモデルにより記述することができた。母集団平均パラメータ、個体間変動(  )、

個体内残差変動(  )などのパラメータは Table 2 に示した。

TABLE 2. Summary of imatinib pharmacokinetic parameters in CML patients Pharmacokinetic parameters Estimate (S.E.) Bootstrap 95% C.I.

CL (L/hr) 8.7 (5.3) (8.6, 8.7) Vd (L) 430 (9.9) (428, 439)

KA 2.06 (3.0) (2.05, 2.14)



0.363 (24.2) (0.360, 0.366)



0.457 (29.6) (0.415, 0.463)



0.747 (119.2) (0.681, 0.832)

 0.400 (14.8) (0.399, 0.403)

S.E., standard error of the estimates; C.I., confidence interval;

obtained from successful NONMEM runs using 879 bootstrap data sets.

定常状態におけるクリアランス(CL)、分布容積(Vd)、吸収速度定数(KA)はそれぞれ 8.7 L/hr、430 L、2.06 であった。

ブートストラップ法により、各パラメータの頑健性を示した。クリアランスの個人差は

約 4.6 倍(範囲 3.4-15.5 L/hr)であった。

- 8 - 第 3 節 考察

本研究により、日本人 CML 患者におけるイマチニブ母集団平均クリアランスが 8.7 L/hr であることが示された。

一方、NONMEM を用いて白人における母集団平均クリアランスを算出した報告はいくつか

ある

。Judson ら、Schmidli ら、Widmer らによると、母集団平均クリアランスはそれぞ

れ 14.74 L/hr(extension phase)

、14 L/hr

、14.3 L/hr

であると報告された。Menon ら、

Petain らは子供や若年層を含めた母集団を対象として算出したため、それぞれ 6.81 L/hr、

7.29 L/hr という低い母集団平均クリアランスを報告している

。しかしながら、Delbaldo らの研究により 8.13 L/hr という低い母集団平均クリアランスが算出された原因は不明で ある

。

以上のことから、日本人におけるイマチニブ母集団平均クリアランスは白人に比較して 低い可能性が示唆された。Kanda らは日本人の体格の小ささがイマチニブの血中濃度を上昇 させて副作用を生じやすくする可能性を示唆している

。イマチニブ薬物動態パラメータ、

あるいは効果、副作用の人種差に関しては更なる検討が必要と考えられる。

- 9 -

第 2 章 イマチニブ細胞膜輸送を媒介する薬物トランスポータの同定

第 1 節 序

イマチニブ細胞膜輸送に寄与する薬物トランスポータとして、排出型トランスポータ ABCB1、ABCG2、及び取り込み型トランスポータ OCT1、OCTN2、OATP1B3、OATP1A2 が報告さ れている

(Figure 2)。薬理遺伝学的研究によると、排出型トランスポータ ABCB1

、 ABCG2

の遺伝子多型がイマチニブ体内動態の個体間変動に一部関与することが既に報告さ れている。イマチニブ体内動態の個体間変動の要因を明らかにするためには、細胞膜輸送 に介在するトランスポータを同定し、薬理遺伝学的研究を行う必要がある。

イマチニブを経口投与した際の吸収率はほぼ 100%とされている。トランスポータを過剰 発現させた細胞における輸送実験により、OCTN2 や OATP1A2 が消化管吸収に関与すると予測 されている

(Figure 2)が、詳細は不明である。消化管吸収に関与する薬物トランスポータ は遺伝子多型により基質輸送活性が変化することが想定されるため、消化管細胞を用いた 検討により消化管吸収メカニズムを明らかにすることは重要である。

また、OCT1 は標的腫瘍細胞である CML 細胞へのイマチニブ取り込みに重要な役割を担っ ていることが報告されているおり

、OCT1 の発現量がイマチニブの治療効果に相関する ことが示されている

。CML 細胞においてイマチニブ細胞内輸送メカニズムを解明すること により、治療効果に影響を与える因子を特定できる可能性が示唆される。

以上の観点から、各種トランスポータを過剰発現させたヒト胎児腎細胞 HEK293 における

イマチニブ輸送活性、並びにヒト結腸癌細胞 Caco-2 及びヒト CML 細胞 K562 におけるイマ

チニブ細胞内蓄積に及ぼすトランスポータ阻害剤の影響について比較精査した。

- 10 - 第 2 節 結果

2-1 各種トランスポータ発現 HEK 細胞におけるイマチニブ取り込み

イマチニブ細胞膜輸送に寄与することが既に報告されているトランスポータ OCTN2、

OATP1A2、OCT1、OATP1B3 に加えて、OATP1B1 及び OATP3A1 を発現させた HEK293 細胞を作製 した。イマチニブ取り込み量は、control である空ベクターpCMV6XL5 または pCMV6XL4 遺伝 子導入 HEK293 細胞に比較して OCTN2、OATP1A2、OCT1、OATP1B3 発現 HEK293 細胞において 有意に増加した(Figure 4)。

Figure 4. Uptake of imatinib (2 μM) into HEK293 cells transfected with OCTN2, OATP1A2, OCT1, OATP1B1, OATP1B3 or OATP3A1. Transfected cells were incubated at 37℃ for 1 min.

*, P < 0.05 versus control pCMV6XL5 or pCMV6XL4 vector. Data are expressed as mean values  SD ( n = 3).

2-2 Caco-2 細胞におけるイマチニブ細胞内輸送

Transwell 上に播種した Caco-2 細胞において、イマチニブを apical 側に添加した場合の 細胞内蓄積量を 120 分まで評価した(Figure 5(a))。Incubation 30 分で細胞内蓄積量が飽 和することが分かった。Caco-2 細胞におけるイマチニブ細胞内蓄積量は、基質濃度依存的 に増加した(Figure 5(b))。Caco-2 細胞におけるイマチニブ細胞内輸送の Km および Vmax は、

それぞれ 2,428 μM および 65.2 nmol/cm

/mg protein であった。

- 11 -

Figure 5. Uptake of imatinib into Caco-2 cells. (a) Uptake of imatinib (50 μM) over time. Samples were taken over 10-120 min. (b) Eadie-Hofstee plot analysis of imatinib uptake. Imatinib (100-5,000 μM) was added, and the cells were incubated for 10 min.

以上の結果より、Caco-2 細胞において apical 側に 2400 μM イマチニブを添加し 10 分イ ンキュベーションした場合の細胞内蓄積量に対する各種トランスポータ阻害剤の影響を評 価した(Figure 6)。Estrone-3-sulfate、naringin、L-carnitine、p-amino hippurate によ り細胞内イマチニブ蓄積量が有意に阻害された。

Figure 6. Inhibitory effect of inhibitors on imatinib uptake. Imatinib (2,400 μM) with or without each inhibitors (100 or 1,000 μM) was added, and the cells were incubated for 10 min.

*, P < 0.05 versus control. **, P < 0.01 versus control. E3S, estrone-3-sulfate. NAR, naringin. L-CA, L-carnitine. PAH, p-amino hippurate. TEA, tetraethylammonium. Data are expressed as mean values  SD ( n = 3).

2-3 K562 細胞におけるイマチニブ細胞内輸送

K562 細胞にイマチニブを添加した場合の細胞内蓄積量を 30 分まで評価した(Figure

7(a))。Incubation 5 分で細胞内蓄積量が飽和することが分かった。K562 細胞におけるイ

- 12 -

マチニブ蓄積量は、基質濃度依存的に増加した(Figure 7(b))。K562 細胞におけるイマチニ ブ輸送の Km および Vmax は、それぞれ 56.6 μM および 83.3 nmol/mg protein であった。

Figure 7. Uptake of imatinib into K562 cells. (a) Uptake of imatinib (2 μM) over time. Samples were taken over 0.5-30 min. (b) Eadie-Hofstee plot analysis of imatinib uptake. Imatinib (2.5-100 μM) was added, and the cells were incubated for 3 min.

Data are expressed as mean values  SD ( n = 3).

以上の結果を踏まえ、K562 細胞において 50 μM イマチニブを添加し 3 分インキュベーショ ンした場合の細胞内蓄積量に対する各種トランスポータ阻害剤の影響を評価した(Figure 8)。Estrone-3-sulfate、naringin、L-carnitine、p-amino hippurate、tetraethylammonium の共存により細胞内イマチニブ蓄積量が有意に阻害された。

Figure 8. Inhibitory effect of inhibitors on imatinib uptake. Imatinib (50 μM) with or without each inhibitors (100 or 1,000 μM) was added, and the cells were incubated for 3 min.

**, P < 0.01 versus control. E3S, estrone-3-sulfate. NAR, naringin. L-CA, L-carnitine.

PAH, p-amino hippurate. TEA, tetraethylammonium. Data are expressed as mean values

 SD ( n = 3).

- 13 - 第 3 節 考察

本研究では、各種トランスポータ発現 HEK 細胞を用いたイマチニブ輸送実験により、細 胞膜輸送に寄与するトランスポータの一部を同定した。また、消化管上皮および CML 細胞 においてイマチニブ輸送を阻害する薬物が判明し、消化管吸収や標的腫瘍細胞内イマチニ ブ取り込みのメカニズムを明らかにする上で有用と考えられる。

イマチニブ細胞膜輸送に寄与することが既に報告されているトランスポータ OCTN2、

OATP1A2、OCT1、OATP1B3 に加えて、新たに OATP1B1 及び OATP3A1 を発現させた HEK293 細胞 を作製し評価した。その結果、OCTN2、OATP1A2、OCT1、OATP1B3 発現 HEK293 細胞において 有意にイマチニブ輸送量が増加し既報と一致した(Figure 4)。各トランスポータのヒト組 織での局在に着目すると、OCTN2 は腎臓、肝臓、小腸、心臓を含め様々な組織に存在するこ とが報告されている

。OATP1A2 は小腸、肝臓、腎臓の上皮細胞に主に存在している

。 OCT1 は主に肝臓に局在することが報告されている

。OATP1B3 は主に肝臓に局在することが 報告されている

。これらの報告を考慮すると、 イマチニブ消化管吸収には OCTN2 や OATP1A2 が寄与し、イマチニブ肝臓内取り込みには OCTN2、OATP1A2、OCT1、OATP1B3 が寄与してい ると推察される。

一方、OATP1B1 及び OATP3A1 を発現させた HEK293 細胞では有意な輸送量の変化は観測さ れなかった。OATP1B1 は主にヒト肝臓のシヌソイド側に発現しており、HMG-GoA を含め種々 の薬物の肝臓内移行に関与することが報告されている

。イマチニブは主に肝代謝及び胆 汁排泄により消失する

ものの、OATP1B1 はイマチニブ細胞膜輸送に寄与しない可能性が 示唆された。OATP3A1 は腎臓や精巣に加え、白血球にも多く発現していることが報告されて いるが

、こちらもイマチニブ細胞膜輸送に寄与しない可能性が示唆された。

Transwell 上に播種した Caco-2 細胞におけるイマチニブ細胞内輸送実験では、消化管吸 収メカニズムを解明することを目的として apical 側にイマチニブを添加し、細胞内イマチ ニブ蓄積量を評価した。阻害実験には estrone-3-sulfate、naringin、L-carnitine、p-amino hippurate、tetraethylammonium の 5 種類の阻害剤を用いた。 Estrone-3-sulfate は OATP1A2

、 OATP1B1

を含めた OATP super family の代表的な阻害剤である。Naringin は OATP1A2

、 OATP2B1

、ABCB1

の阻害剤である。L-carnitine は OCTN2 の代表的基質であり阻害剤で

ある

。p-amino hippurate は有機アニオントランスポータ OAT1

、OAT3

、及び OATP3A1

の阻害剤である。Tetraethylammonium は OCT1

、OCT2

、OCT3

、OCTN2

の阻害剤である。

このうち、estrone-3-sulfate、naringin、L-carnitine、p-amino hippurate により Caco-2 細胞内イマチニブ蓄積量が有意に阻害されたことから、Caco-2 細胞膜輸送に OATP1A2、

OATP1B1、OATP2B1、OCTN2、OAT1、OAT3、OATP3A1 が寄与している可能性が示唆される。し かしながら OATP1B1 及び OATP3A1 を発現させた HEK293 細胞においてイマチニブ輸送が観測 されなかった点、Hu ら

の検討により OAT1 や OAT3 がイマチニブ細胞膜輸送に関与しない ことが報告されている点の 2 点を加味すると、 Caco-2 細胞内イマチニブ輸送には OATP1A2、

OATP2B1、OCTN2 が関与している可能性があり、消化管におけるイマチニブ細胞膜輸送に OATP

- 14 -

super family 及び OCTN2 が重要な役割を担っていると考えられる。

一 方 K562 細 胞 に お い て は 、 estrone-3-sulfate 、 naringin 、 L-carnitine 、 p-amino hippurate、tetraethylammonium の全ての阻害剤により細胞内イマチニブ蓄積量が有意に阻 害された。よって、標的腫瘍細胞内へのイマチニブ輸送には、OATP1A2、OATP2B1、OCTN2、

OCT1-3 の寄与が考えられる。Hu ら

の検討により OCT2,3 によるイマチニブ細胞膜輸送へ の寄与は否定されているため、OATP1A2、OATP2B1、OCTN2、OCT1 が関与している可能性が示 唆された。

以上の結果から、OCTN2、OATP1A2、OCT1、OATP1B3 発現 HEK293 細胞において有意にイマ チニブ輸送量が増加し、 Caco-2 細胞内イマチニブ輸送実験により消化管吸収には OATP1A2、

OATP2B1、OCTN2 が寄与し、K562 細胞内イマチニブ輸送実験により標的腫瘍細胞内移行には

OATP1A2、OATP2B1、OCTN2、OCT1 が寄与している可能性が示唆された。細胞膜輸送に寄与す

るトランスポータの一部を同定したため、これらトランスポータの薬理遺伝学的研究を行

うことにより、イマチニブ体内動態の個体間変動の要因を明らかにする必要がある。

- 15 -

第 3 章 イマチニブ体内動態に及ぼす種々トランスポータおよび薬物代謝酵素 の遺伝子多型の影響

第 1 節 序

イマチニブは主に肝代謝及び胆汁中排泄により体外消失する薬物である

。イマチニブ の代謝は cytochrome P450 (CYP) CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP3A5 によって媒 介され、特に CYP3A4/5 がイマチニブ肝代謝に関与する主な代謝酵素とされている

。CYP の 酵素活性がイマチニブ代謝の制御に重要な役割を有する場合、これら代謝酵素の遺伝子多 型はイマチニブ体内動態に影響を与える可能性が想定される。

イ マ チ ニ ブ は 薬 物 排 出 ATP-binding cassette(ABC) transporter で あ る ABCB1(P-glycoprotein)や ABCG2(breast cancer resistance protein)によって認識される

9,52

。Organic cation transporter である OCT1(遺伝子名 SLC22A1 )や OCTN2 に加え、organic anion transporting polypeptides である OATP1A2 や OATP1B3 もイマチニブの細胞内輸送を 制御すると考えられている

。これまで、薬物排出型トランスポータに注目した薬理遺伝 学的な検討がいくつか報告されている

。Gurney らは ABCB1 1236C>T、2677G>T/A、

3435C>T がイマチニブクリアランスに影響を与えることを報告している

。近年、OATP1B3(遺 伝子名 SLCO1B3 )がイマチニブの肝組織移行に影響を及ぼす可能性が提示された

。 SLCO1B3 334T>G 遺伝子多型は内因性・外因性物質の輸送活性に影響を与えることが報告さ

れている

。しかしながら、 SLCO1B3 遺伝子多型がイマチニブ体内動態に影響を与える可

能性については不明である。

そこで我々は、イマチニブ体内動態の個体間変動要因を明らかにするため、3 種の薬物取

り込み型トランスポータ( SLC22A1 、 SLCO1B1 、 SLCO1B3 )、2 種の薬物排出型トランスポータ

( ABCB1 、 ABCG2 )、4 種の薬物代謝酵素( CYP2C9 、 CYP2C19 、 CYP2D6 、 CYP3A5 )に存在する 14 の

single-nucleotide polymorphisms(SNPs)とイマチニブ体内動態変動との関連について比較

精査した。

- 16 - 第 2 節 結果

2-1 遺伝子解析

第 1 章で用いた 34 人の日本人 CML 患者における 14SNPs の遺伝子型を Table 3 に要約し

た。これら 14 の SNPs は function の変動を起こすことが知られているもの、及びその可能

性があるものを基準として選定した。 ABCG2 421CA、 CYP2C9 1075AC、 CYP2C19 636GA に

ついては homozygous variants が観測されなかった。 CYP2C9 430CT、 CYP2D6 1846GA につ

いては heterozygous、homozygous variants が観測されなかった。すべての遺伝子多型は

Hardy-Weinberg equilibrium に到達していた。

17

TABLE 3. Individual clearance of imatinib as a function of variant genotypes

Allele Region Effect^a

Number of patients (n)

Allele frequency^b Clearance  SD (Lhr) P-value

WT Het Var p q WT Het Var WT vs Het vs Var WT+Het vs Var WT vs Het+Var

SLC22A1 1022CT Exon6 P341L 24 8 2 0.82 0.18 8.8  2.9 8.2  3.5 8.3  3.5 0.973 0.913 0.926

SLCO1B1 521TC Exon6 V174A 26 7 1 0.87 0.13 8.7  3.1 8.3  2.0 5.5 0.304 0.235 0.288

SLCO1B3 334TG Exon3 S112A 5 10 19 0.29 0.71 5.7  2.3 7.4  2.4 9.5  3.1 0.046 0.019 0.071

ABCB1 1236CT Exon12 G412G 5 19 10 0.43 0.57 11.7  3.1 8.1  2.7 8.2  3.2 0.277 0.642 0.196

ABCB1 2677GTA Exon21 A893ST 10 14 10 0.50 0.50 9.8  3.2 8.1  2.5 8.0  3.3 0.494 0.445 0.270

ABCB1 3435CT Exon26 I1145I 7 21 6 0.51 0.49 12.7  3.0 7.9  2.4 9.2  3.5 0.058 0.581 0.035

ABCG2 421CA Exon5 Q141K 21 13 0 0.81 0.19 7.9  3.1 9.5  2.8 NA 0.446 NA 0.462

CYP2C9 430CT Exon3 R144C 34 0 0 1.00 0.00 8.3  3.0 NA NA NA NA NA

CYP2C9 1075AC Exon7 I359L 33 1 0 0.99 0.01 8.6  3.0 10.0 NA 0.508 NA 0.647

CYP2C19 636GA Exon5 W212X 27 7 0 0.90 0.10 8.1  2.8 9.7  3.3 NA 0.242 NA 0.257

CYP2C19 681GA Exon4 Splice defect 16 13 5 0.66 0.34 8.6  3.6 9.5  2.6 7.0  1.1 0.473 0.252 0.852

CYP2D6 100CT Exon1 P34S 13 16 5 0.62 0.38 7.3  3.2 8.2  2.4 12.7  3.3 0.190 0.089 0.276

CYP2D6 1846GA Exon4 Splice defect 34 0 0 1.00 0.00 8.3  3.0 NA NA NA NA NA

CYP3A5 6986AG Intron3 Splice defect 2 12 20 0.24 0.76 6.3  1.0 7.9  3.4 9.4  2.8 0.285 0.323 0.175

WT, homozygous reference sequence; Het, heterozygous variant; Var, homozygous variant; p, frequency for reference allele; q, frequency for variant allele; NA, not available;

Number represents amino acid codon;

Hardy-Weinberg notation for allele frequencies.

P -values were obtained from a Kruskal-Wallis test or a Mann-Whitney U-test.

18

Figure 9. Association of individual clearance with targeted genotypes. Each symbol represents an individual patient, and horizontal lines represent median values.

WT Het Var ABCB1 1236C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var ABCB1 1236C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var ABCB1 2677G>T/A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var ABCB1 2677G>T/A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var ABCB1 3435C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var ABCB1 3435C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var ABCG2 421C>A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var ABCG2 421C>A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var SLC22A1 1022C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var SLC22A1 1022C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var SLCO1B1 521T>C

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var SLCO1B1 521T>C

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var SLCO1B3 334T>G

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var SLCO1B3 334T>G

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2C9 1075A>C

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2C9 1075A>C

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2C19 636G>A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2C19 636G>A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2C19 681G>A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2C19 681G>A

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2D6 100C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP2D6 100C>T

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP3A5 6986A>G

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

WT Het Var CYP3A5 6986A>G

0 5 10 15 20

Individual clearance (L/hr)

19 2-2 遺伝子多型とイマチニブクリアランスの関連性

対象とした遺伝子多型とイマチニブクリアランスの関連性は、Figure 9 と Table 3 に要 約した。このうち取り込み型トランスポータ SLCO1B3 334T>G 遺伝子型は、イマチニブクリ アランスと有意に関連した( P  0.046)。 SLCO1B3 334GG 遺伝子型を有する患者は、TT ある いは TG を有する患者よりも高いイマチニブクリアランスを持つことが分かり、(9.5  3.1 vs 7.0  3.1 L/hr, respectively; P  0.019)、 SLCO1B3 334GG 遺伝子型を有する患者は TT あるいは TG を有する患者と比較して、約 36%高いクリアランスを持つことが分かった。

一方、排出型トランスポータ ABCB1 3435CC 遺伝子型を有する患者は CT あるいは TT を有

する患者よりも高いイマチニブクリアランスを持つことが判明し(12.7  3.0 vs 7.9  2.7

L/hr, respectively; P  0.035)、 ABCB1 3435CC 遺伝子型を有する患者は CT あるいは CC

を有する患者と比較して、約 61%高いクリアランスを示すことが分かった。

20 第 3 節 考察

SLCO1B3 334T>G、 ABCB1 3435C>T 遺伝子多型がイマチニブクリアランスに影響を与える要 因であることが示唆された。これまで、イマチニブ動態に及ぼす SLCO1B3 遺伝多型の影響 に関する報告はなく、本研究で得られた結果が初めての知見となる。

取り込み型トランスポータ OATP1B3(遺伝子名 SLCO1B3 )は肝臓に多く分布しており、種々 の薬物の肝臓内取り込みを制御していると考えられている

。 SLCO1B3 334GG 遺伝子型はテ ストステロン取り込みを減少させ前立腺癌患者の生存期間を延長させることが知られてい る

。一方で、 SLCO1B3 334GG や TG 遺伝子型は TT 遺伝子型と比較してエリスロマイシン呼 気テストにおける 1T

を上昇させ、肝臓内取り込みを上昇させる可能性が示唆されている

54

。 同 様 に 、 SLCO1B3 334GG 遺 伝 子 型 は stably transfected MDCK II 細 胞 に お け る dehydroepiandrosterone-3-sulfate、cholyltaurine、cholecystokinin-8 の輸送活性を上 昇させることが報告されている

。今回の検討では SLCO1B3 334GG 遺伝子型を有する患者は TT や TG を有する患者と比較してイマチニブクリアランスが上昇することが明らかとなり、

SLCO1B3 334GG 遺伝子型を有する患者においてイマチニブの肝臓内取り込みが増加する可能 性が示唆された。

イマチニブクリアランスと ABCB1 3435C>T(排出型トランスポータ P-glycoprotein)に有 意な相関が観測された。排出型トランスポータがイマチニブの体内動態や効果に与える影 響について過去に報告がある

。Gardner らや Dulucq らはイマチニブ体内動態に ABCB1 3435C>T は影響を与えないと報告している

。一方で Gurney らは ABCB1 1236T-2677T-3435T diplotype がイマチニブクリアランスに影響を与えると報告している。今回の検討で ABCB1 1236C>T、2677G>T/A、3435C>T が TT である患者は 4 人であり、この diplotype によるイマ チニブクリアランスへの影響は有意ではなかった( P  0.699)。これら遺伝子多型とイマチ ニブ体内動態の相関を評価するためには、さらに多くの症例を評価する必要があるだろう。

ABCG2 421G>A 遺伝子多型については in vitro ではイマチニブ体内動態に影響を与えるもの の患者では影響を与えないとの報告もある

。同様に、今回の検討でも ABCG2 はイマチニブ 体内動態に影響を与えなかった。患者における検討ではイマチニブ体内動態に影響を与え る変動要因が同時に影響を与えるため、in vitro における検討と患者における検討では結 果に差異が生じる可能性が考えられる。

以 前 の 報 告 に よ る と 、 CYP2D6 1846G>A 遺 伝 子 多 型 の う ち heterozygous あ る い は homozygous variant の症例において wild type の症例よりもわずかにイマチニブクリアラ ンスが低下するものの、 CYP2C9 、 CYP2C19 、 CYP3A4 、 CYP3A5 を含めた薬物代謝酵素をコード する遺伝子上の SNPs はイマチニブクリアランスに有意な影響を与えないことが示されてい る

。同様に我々も代謝酵素の遺伝子多型の影響を解析したが、有意な影響は観測されなか った。CYP 活性はイマチニブ代謝を制御する重要な役割を持つものの

、CYP isoforms の遺 伝子多型がイマチニブクリアランスに影響を与えるとの報告は無い。

取り込み型トランスポータ OCT1(遺伝子名 SLC22A1 )および OATP1B1( SLCO1B1 )の遺伝子多

21

型についても評価したが、 SLC22A1 1022C>T や SLCO1B1 521T>C はイマチニブクリアランス に有意な影響を与えないことが明らかとなった。 SLC22A1 1022C>T はトランスポータ活性の 低下に関連することが報告されている

。OCT1 活性はイマチニブ治療の効果に重要な影響 を与えることが報告されているものの

、イマチニブ体内動態に影響与える SLC22A1 SNPs は未だに同定されていない

。OATP1B1 は肝臓に特異的に存在するトランスポータであり、

種々の物質を肝臓内に輸送することが報告されている

。 SLCO1B1 521T>C 遺伝子型は in vitro における OATP1B1 輸送活性の低下に関連することが示唆されている

。OATP1B1 は in vitro におけるイマチニブ輸送を媒介しないことが報告されており

、ヒト体内でもイ マチニブ輸送に関与しない可能性が推察される。

以上の結果から、イマチニブクリアランスは取り込み型トランスポータ SLCO1B3 334T>G および排出型トランスポータ ABCB1 3435C>T の遺伝子多型の影響を受けることが示された。

従って、 SLCO1B3 遺伝子型がイマチニブ投与の変動要因になりうる可能性がある。イマチニ

ブ体内動態は種々のトランスポータ SNPs の影響を受けるため、薬理遺伝学的な知見を基に

して CML 患者におけるイマチニブ個別投与設定を行う必要性が示唆された。

22

第 4 章 イマチニブ体内動態に及ぼす OATP1A2 および

SLCO1A2

第 1 節 序

Organic-anion transporting polypeptides(OATPs; 遺 伝 子 名 SLCO ) は solute carrier(SLC)の super family に属し、様々な臓器に発現しているため薬物動態に重大な影 響を与える。 OATPs は広大な範囲の生体内物質および薬物の細胞内取り込みを行っている

。 OATP 遺伝子多型は薬物動態に影響を与えるため、これらのトランスポータは種々の薬物の 薬効や副作用の個人差に影響を与える可能性が想定される。従って、種々の SLCO 遺伝子多 型が薬物動態に及ぼす影響について知見・情報が蓄積されつつある

。

OATP1A2(遺伝子名 SLCO1A2 )は OATP super family に属するトランスポータの 1 つである。

OATP1A2 は胆汁酸やステロイドホルモンを含めた様々な生体内物質あるいは薬物を輸送す ることが示されている

。OATP1A2 は小腸、肝臓、腎臓の上皮細胞に主に存在しているた

め

、薬物動態学的に重要な役割を担っている可能性が想定される(Figure 10)。

Figure 10. Localization of OATP1A2 transporter OATP1A2

Intestinal lumen

Blood vessel

Hepatocyte ^OATP1A2 Gut wall

Bile duct

OATP1A2

OATP1A2

Distal tubules of the nephrons

Leukemia cells

23

SLCO1A2 遺伝子多型に関しては、404A>T(rs45502302)、559G>A、833delA(rs11568555)が in vitro における基質輸送活性を低下させるとの報告がある

。しかしながら、 SLCO1A2 遺伝子多型が患者における PK/PD に影響を与えるかについての報告は乏しい

。近年、

SLCO1A2 遺伝子多型(rs10841795、 38T>C; rs11568563、 516T>G)とロピナビル血中濃度と の相関について検討されたが

、有意な相関性は観測されなかった。 SLCO1A2 SNPs が薬物 動態に及ぼす影響については、更なる検討が必要とされている。

OATP1A2 は基質認識性が比較的広いことが知られており、イマチニブも OATP1A2 の代表的

基質の 1 つであることが示されている

。今回の研究では、ヒト結腸癌細胞 Caco-2 にお

けるイマチニブ経上皮輸送、およびヒト CML 細胞 K562 におけるイマチニブ細胞内蓄積に及

ぼす OATP1A2 の影響を精査するとともに、 SLCO1A2 遺伝子多型と CML 患者におけるイマチニ

ブ体内動態との関連性について検討した。

24 第 2 節 結果

2-1 OATP1A2 発現 HEK293 細胞におけるイマチニブ取り込み

OATP1A2 発現 HEK293 細胞を作製し、western blotting にて OATP1A2 の発現を確認した (Figure 11)。イマチニブ取り込み量は、control である空ベクターpCMV6XL5 遺伝子導入 HEK293 細胞に比較して OATP1A2 発現 HEK293 細胞において有意に増加した( P = 0.002; Figure 12)。Control 細胞ではイマチニブ蓄積量が比較的多かった。この control 細胞にてイマチ ニブ蓄積量が大きい理由として、非特異的な細胞膜透過や単純拡散などが一部関与してい る可能性が挙げられる。OATP1A2 発現 HEK293 細胞において OATP1A2 阻害剤 naringin 存在下 ではイマチニブ蓄積が促進されないことが明らかとなった(Figure 12)。以上の結果から、

イマチニブは OATP1A2 を介して細胞内に輸送され、naringin により OATP1A2 輸送は阻害さ れることが示された。

Figure 11. Western blot analysis of OATP1A2 in transfected HEK293, Caco-2 and K562 cells. Western blot analysis of OATP1A2 in pCMV6XL5 vector-transfected HEK293 (lane 1), hOATP1A2-transfected HEK293 (lane 2), Caco-2 (lane 4), and K562 (lane 5) cells.

(a) OATP1A2 protein in total lysates. (b) The expression of OATP1A2 in a crude membrane fraction. (c) The expression of β-actin in total lysates, used as a loading control.

Figure 12. Uptake of imatinib (2 μM) into HEK293 cells transfected with OATP1A2 and the inhibitory effect of naringin. Transfected cells were treated with or without 1 mM of the OATP1A2 inhibitor naringin for 1 min.

*, P < 0.01 versus control pCMV6XL5 vector. Data are expressed as mean values  SD

( n = 3).

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2-2 Caco-2 細胞における OATP1A2 を介したイマチニブ経上皮輸送

Caco-2 細胞における apical-to-basal および basal-to-apical のイマチニブ経上皮輸送 に つ い て 、 180 分 ま で の 輸 送 量 を 評 価 し た (Figure 13(a)) 。 Caco-2 細 胞 に お け る apical-to-basal 方向のイマチニブ経上皮輸送量は、基質濃度依存的に増加した(Figure 13(b))。Caco-2 細胞におけるイマチニブ経上皮輸送の Km および Vmax は 3,556 μM および 44.1 nmol/cm

/30 min であった。Apical-to-basal 方向のイマチニブ経上皮輸送に及ぼす naringin の阻害効果を評価したところ、10 mM の naringin 存在下では輸送量が 57%減少し た(Figure 13(c))。

Figure 13. Transport of imatinib across Caco-2 cell monolayers and the inhibitory effect of naringin. (a) Transport of imatinib from the apical to the basal (○), and the basal to the apical (□), side of the cell over time. Imatinib (4 mM) was added to either the apical or basal side. Samples aliquots (200 μL) were taken over 10-180 min from the relevant side. (b) Eadie-Hofstee plot analysis of imatinib transport.

Imatinib (0.1-5 mM) was added to the apical side. Samples aliquots (200 μL) at the basal side were taken 30 min later. (c) Inhibitory effect of naringin on imatinib transport. Imatinib (3.5 mM) with or without the OATP1A2 inhibitor naringin (1-10 mM) was added to the apical side. Samples aliquots (200 μL) at the basal side were taken 30 min later. Data are expressed as mean values  SD ( n = 3).

2-3 K562 細胞における OATP1A2 を介したイマチニブ取り込み

K562 細胞におけるイマチニブ細胞内蓄積量は実験開始後 3 分まで直線的に増加した

(Figure 14(a))。K562 細胞におけるイマチニブ蓄積量は基質濃度依存的に増加した(Figure

14(b))。K562 細胞におけるイマチニブ取り込みの Km および Vmax は 57 μM および 79.1

nmol/3 min/mg protein であった。続いて naringin 存在下でのイマチニブ蓄積量を評価し

た。50 μM イマチニブを 2 mM naringin 存在下で K562 細胞に暴露したところ、イマチニブ

26 蓄積量は 43%減少した(Figure 14(c))。

Figure 14. Uptake of imatinib into K562 cells and the inhibitory effect of naringin.

(a) Uptake of imatinib (2 μM) over time. Samples were taken over 0.5-20 min. (b) Eadie-Hofstee plot analysis of imatinib uptake. Imatinib (10-100 μM) was added, and the cells were incubated for 3 min. (c) Inhibitory effect of naringin on imatinib uptake. Imatinib (50 μM) with or without the OATP1A2 inhibitor naringin (50-2,000 μM) was added, and the cells were incubated for 3 min. Data are expressed as mean values  SD ( n = 3).

2-4 SLCO1A2 遺伝子解析

34 人の CML 患者において、 SLCO1A2 の coding region に存在する 3 つの SNPs(404A>T、 559G>A、

833delA; Figure 15)および promoter region に存在する 5 つの SNPs(-1105G>A、-1032G>A、

-715T>C、-361G>A、-189_-188insA)の遺伝子解析を行った(Table 4)。

Figure 15. Secondary structure of OATP1A2 showing the locations of the 3 polymorphisms in OATP1A2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

404A>T (135N>I)

559G>A

(187A>Y) 833A>-

(278N>del)

[EXTRACELLULAR]

[CYTOPLASM]

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TABLE 4. Analysis of polymorphisms in the promoter region of SLCO1A2

Position Base pair

change dbSNP ID

CML patients ( n = 34)

Healthy volunteers ( n = 100) WT Het Var WT Het Var -1105 G>A rs4148977 18 12 4 47 43 10 -1032 G>A rs4148978 18 12 4 47 43 10 -715 T>C rs4148979 34 0 0 100 0 0 -361 G>A rs3764043 21 12 1 75 22 3 -189_-188 insA rs3834939 30 0 4 90 0 10

WT, homozygous reference sequence; Het, heterozygous variant; Var, homozygous variant

404A>T、559G>A、833delA、-715T>C に関しては heterozygous および homozygous variant の症例は無かった。Promoter region に存在する 5 つの SNPs については、100 人の健常人 においても遺伝子解析を行った(Table 4)。-715T>C に関しては heterozygous および homozygous variant の症例は無かった。これら健常人における SNPs allele 頻度は、34 人 の CML 患者のものとほぼ一致した。34 人の CML 患者と 100 人の健常人において、-1105G>A と-1032G>A は linkage disequilibrium であることが明らかとなった。つまり 34 人の CML 患者と 100 人の健常人において、-1105G>A の遺伝子型は-1032G>A の遺伝子型と完全に一致 することが分かった。さらに、全ての CML 患者および健常人において-1105AA/-1032AA 遺伝 子型を持つ症例は-189_-188insA 遺伝子型を持つことが明らかとなった。CML 患者および健 常人の両方において、-189_-188insA の heterozygous variant は観測されず、今回の母集 団では Hardy-Weinberg 平衡に到達していないことが分かった ( P < 0.01; the 2 test to compare the observed and expected genotype frequencies)。この不均衡の原因は不明で あり、sample size を増やし allele 頻度を再検討する必要がある。

2-5 SLCO1A2 遺伝子多型がイマチニブクリアランスに及ぼす影響

CML 患者 34 人のイマチニブクリアランスと SLCO1A2 遺伝子多型との相関を Figure 16 に 示した。 SLCO1A2 -1105GG/-1032GG 遺伝子型( n = 18)を有する症例は-1105GA/-1032GA( n = 12) あるいは-1105AA/-1032AA/-189_-188insA 遺伝子型を有する症例に比較してイマチニブク リアランスが高い傾向にあった(中央値SD、9.42.6 L/hr vs. 7.03.3 L/hr; P = 0.075)。

SLCO1A2 -361GG 遺伝子型( n = 21)を有する症例は GA( n = 12)あるいは AA( n = 1)遺伝子型 を有する症例に比較して有意にイマチニブクリアランスが低かった(7.22.8 L/hr vs.

10.02.5 L/hr; P = 0.005)。つまり、 SLCO1A2 -361GG 遺伝子型を有する症例は、GA ある

いは AA 遺伝子型を有する症例に比較してイマチニブクリアランスが 28%低かった。 SLCO1A2

-361AA 遺伝子型を有する症例のイマチニブクリアランスは 7.5 L/hr であり、-361GA ある

いは AA 遺伝子型を有する症例群のうち最も低いクリアランスであった。

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Figure 16. Association of SLCO1A2 (a) -1105G>A/-1032G>A and (b) -361G>A polymorphisms with imatinib clearance. Imatinib clearance in patients was estimated using PPK analysis. The line inside each box indicates the median; the bottom edge is the first quartile and the top edge is the third quartile; the error bars represent minimal and maximal values.

0 4 8 12 16

0 4 8 12 16

Clearan ce (L/h r)

(a)

-1105G>A -1032G>A -189_-188insA

p = 0.075 (b) p = 0.005

Cle arance (L /hr)

-361G>A GG

GG - (n=18)

GA / AA GA / AA - / insA (n=12 / 4)

GG (n=21)

GA / AA

(n=12 / 1)