研究要旨：

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厚生労働科学研究費補助金（再生医療実用化研究事業）

（総括）総合研究報告書

I. 総括研究報告

ヒトES/iPS細胞の実用化における幹細胞バンクの基盤整備についての研究

研究代表者古江‑楠田美保

独立行政法人医薬基盤研究所難病・疾患資源研究部ヒト幹細胞応用開発室研究リーダー

研究要旨：

ヒト ES/iPS 細胞の実用化においては、プレマスターバンク、マスターバンク、ワーキングセルバンクを設置することが望ましい。実際に実用化を目指してバンク設置と運営を円滑に行うためには、作業工程などのフローを事前に構築しておく必要がある。一般細胞バンクにおける品質管理、ならびに臨床用細胞プロセシングにおける作業工程などについてはすでに策定されており、本研究では、これらに加えるべきヒト幹細胞バンクにおけるデータベースの基盤設計、幹細胞としての品質管理に必要な技術の策定など、ヒト幹細胞バンク運営の基盤システムの基礎設計について研究を行った。

研究協力者

菅−岸本三佳：独立行政法人医薬基盤研究所難病・疾患資源研究部ヒト幹細胞応用開発室特任研究員研究分担者

水口賢司：独立行政法人医薬基盤研究所バイオインフォマティクスプロジェクトプロジェクトリーダーー

川嵜敏祐：立命館大学総合理工学研究機構教授

大沼清：長岡技術科学大学生物機能工学専攻准教授

A. 研究目的

これまで培養細胞を産業利用する際においては、細菌などの微生物の利用と同様に、樹立機関から提供された資源をストックするプレマスターバンク、さらに種としてのマスターバンク、実際に使用するワーキングバンクを作成して使用することが望ましいとされ、培養細胞が資源化されてきた。しかし、ヒト胚性幹（ES）

細胞や人工多能性幹(iPS)細胞などの多能性幹細胞を実用化する上においては、従来の細胞とは異なり、培養過程において形質が変化しやすく、

実用化を目指してバンク設置と運営を円滑に行うためには、これら細胞

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の特性検査などを含めた作業工程などのフローを事前に構築しておく必要がある。そこで、実用に資するヒト幹細胞バンクに必要なデータベースの基盤設計、品質管理に必要な基盤技術の策定を行い、実用ヒト幹細胞バンクの基盤システムを設計について研究することを目的とする。

ヒトES/iPS細胞などヒト幹細胞を再生医療のソース、ワクチン作製や生物製剤原料、創薬研究ツールとして実用化するために、プレマスターバンク、統合的に管理するマスターバンク、実用のためのワーキングセルバンクの設置が望まれ、共用の基盤システムを構築しておく必要がある。一般細胞のバンクは独立行政法人医薬基盤研究所の生物資源としてJCRB細胞バンクが設置されており、微生物検査、ウィルス検査、細胞同定検査（CGHアレイ検査）など基本的な検査項目についての作業工程は策定されている。また、臨床用細胞プロセッシングの作業工程については、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則に準じた工程が臨床研究を行っている各機関にて策定されている。しかし、ヒト多能性幹細胞は従来の細胞とは異なる形質をもつため、ヒト幹細胞特有の品質管理が必要となる。また、一番の問題点は、ヒト多能性幹細胞はゲノムが不安定であり（文献1､2）、長期に継代を行う事よりゲノムが変異してしまう可能性があることが報告されている。そのため、ヒト多能性幹

細胞を治療に用いるためには、できるだけ短期間で資源化を行った細胞を使うべきであるとの見解がでている。海外では、国際幹細胞バンキングイニシャティブ(ISCBI)が臨床用ヒト幹細胞バンクのためのガイドラインを作成した（文献4､5）。国内事情を鑑みたヒト幹細胞バンクの基盤設計が急務である。

具体的には、下記の３つの観点から研究を推進する。

① 効率的な品質管理を行うための基盤技術の策定

② 細胞登録システムの基礎設計案の作成

③ 臨床応用などに資するヒト幹細胞の品質維持技術の策定

ヒト幹細胞バンク運営の基盤システムの設計により、再生医療など臨床に資するヒト幹細胞の資源化における品質管理の基盤が整備され、バンクの設置と運営を円滑に行うことが可能となり、ヒト幹細胞の再生医療などへの実用化が促進される。

B. 研究方法

ヒト ES細胞、iPS細胞は従来の細胞と同様の資源化工程を使うことができない。ヒト ES/iPS細胞は、その細胞増殖の速度が遅く、自発的な分化能も有することから分化細胞を取り除きながら細胞を増殖させ、また、幹細胞ならではの特性検査も必要とな

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る。一方、継代とともにゲノムが不安定なることが知られており、限られた継代数内に資源化することが望ましい。効率良く細胞を増殖させ、特性検査、品質検査を行って、保存を行うために、作業工程表を作成するとともに、

評価法についても効率的に行う必要がある。そこで次の項目について研究を行った。

１．未分化状態でのヒトiPS細胞の特性解析

(i) 遺伝子解析

未分化状態でのヒト iPS 細胞の特性を明らかにするため、遺伝子発現プロフィール解析を行った。

その検査方法については、平成 23 年度に策定を行った。国際ヒト幹細胞バンキングイニシャティブ(ISCBI)や海外におけるヒト幹細胞バンクでは、

品質評価法についてバンク間での連携が必要であることが提唱されており、その資料を調査した。それらの資料をもとに、国際幹細胞イニシャティブで使用された未分化ならびに早期分化マーカー遺伝子群のプライマーペアがすでに固定化されたマルチウェルプレートに cDNA を入れて解析を行うRT² Profiler PCR Array システムを用いて、遺伝子の発現プロフィールの解析を行った。検査方法策定のための解析対象は、正常染色体を有するES/iPS 細胞株群、染色体異常クローン群、胚性がん(EC)細胞株群とした

（図1）。解析結果は、分担研究者である水口賢治によりバイオインフォマティクスの手法を用いた解析を行った。

平成 24 年度には、厚生労働省研究資源バンク・細胞バンク（JCRB Cell Bank）に登録されたヒト iPS 細胞 JCRB1331 Tic、JCRB1327 Dotocom、 JCRB1437 iPS-TIG-114-4f1、コントロールとして京都大学 iPS 細胞研究所より供与されたヒト iPS 細胞 201B7、京都大学ヒト ES 細胞 KhES-1(京都大学より分与)、ウィスコンシン大学ヒト ES 細胞 H9(Wicell Bank より分譲)を検査対象としてきた。Pluripotency 遺伝子 PCR アレイ

（ Applied Biosystems TaqMan ^○^R Human Stem Cell Pluripotency

Array）を用いて解析し、データの蓄

積を行った。

平成 25 年度には、3 株のヒト iPS 細胞株；JCRB1341 iPS-TIG120-3f7、 JCRB1363 iPS-TIG120-4f1 及び NIHS0693 UTA-SF2-2（以上 JCRB Cell Bank）、2株のヒトES細胞株；

KhES-4 及び KhES-5 (京都大学より分与)を追加し、同様の手法で遺伝子発現プロフィール解析を行い、昨年度までに蓄積したデータと合わせて、

遺伝子発現プロフィールの細胞株間の相違や個々の細胞株の特性を示す遺伝子等について検討した。

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図1 遺伝子プロフィール解析遺伝子プロフィール解析遺伝子プロフィール解析

4

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図2 in vitro 分化能評価分化能評価

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図 3．異なる．異なる MEF によるヒト

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によるヒト ES/iPSES/iPS 細胞の品質変動細胞の品質変動細胞の品質変動

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図

図 4．イメージアナライザーによる細胞表面マーカー発現プロフィール解析．イメージアナライザーによる細胞表面マーカー発現プロフィール解析．イメージアナライザーによる細胞表面マーカー発現プロフィール解析

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．イメージアナライザーによる細胞表面マーカー発現プロフィール解析

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【遺伝子プロフィール解析を行った厚生労働省研究資源バンク・細胞バンク（

Bank）に登録されたヒト

http://cellbank.nibio.go.jp/~cellbank/cgi

）に登録されたヒト

）に登録されたヒトiPS

iPS細胞JCRB1331

http://cellbank.nibio.go.jp/~cellbank/cgi-bin/search_res_det.cgi?RNO=JCRB1331

8

JCRB1331 Tic の細胞情報】

bin/search_res_det.cgi?RNO=JCRB1331

の細胞情報】

【遺伝子プロフィール解析を行った厚生労働省研究資源バンク・細胞バンク（JCRB Cell

JCRB Cell

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iPS細胞JCRB1327 Dotocom

9

JCRB1327 Dotocom

JCRB1327 Dotocom の細胞情報】

の細胞情報】

【遺伝子プロフィール解析を行った厚生労働省研究資源バンク・細胞バンク（JCRB Cell

JCRB Cell

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iPS細胞JCRB1437

http://cellbank.nibio.go.jp/~cellbank/cgi-bin/search_res_det.cgi?R

10

JCRB1437 iPS-TIG

bin/search_res_det.cgi?R

TIG-114-4f1 の細胞情報】

の細胞情報】

NO=JCRB1437

【遺伝子プロフィール解析を行った厚生労働省研究資源バンク・細胞バンク（JCRB Cell の細胞情報】

NO=JCRB1437

JCRB Cell

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【遺伝子プロフィール解析を行った京都大学 201B7

http://www2.brc.riken.jp/lab/cell/detail.cgi?cell_no=HPS0063&type=1

【遺伝子プロフィール解析を行った京都大学

201B7の細胞情報】

【遺伝子プロフィール解析を行った京都大学の細胞情報】

【遺伝子プロフィール解析を行った京都大学

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【遺伝子プロフィール解析を行った京都大学 iPS 細胞研究所より供与されたヒト

細胞研究所より供与されたヒト

細胞研究所より供与されたヒト iPSiPS 細胞

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【遺伝子プロフィール解析を行ったをうけたヒト

http://www.wicell.org/home/stem

【遺伝子プロフィール解析を行ったをうけたヒトES

ttp://www.wicell.org/home/stem

【遺伝子プロフィール解析を行った ES細胞WA09 H9 ttp://www.wicell.org/home/stem

【遺伝子プロフィール解析を行ったWisconsin International Stem Cell (WISC) Bank WA09 H9の細胞情報

ttp://www.wicell.org/home/stem-cell-lines/order

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Wisconsin International Stem Cell (WISC) Bank の細胞情報 NIH registered line

lines/order-stem-cell

Wisconsin International Stem Cell (WISC) Bank NIH registered line

cell-lines/wa09

Wisconsin International Stem Cell (WISC) Bank NIH registered line】

lines/wa09-feeder-dependent.cmsx Wisconsin International Stem Cell (WISC) Bankより分譲

dependent.cmsx より分譲

dependent.cmsx

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http://cellbank.nibio.go.jp/cellinfo/ips/u

iPS細胞JCRB

http://cellbank.nibio.go.jp/cellinfo/ips/u-tokyo_ipslist/

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JCRB1493 (NIHS0693

tokyo_ipslist/

(NIHS0693) UTA

UTA-SF2-2 の細胞情報】

JCRB Cell

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iPS細胞JCRB1341 iPS

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JCRB1341 iPS-TIG120

TIG120-4f3 の細胞情報】

の細胞情報】

JCRB Cell

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iPS細胞JCRB1363 iPS

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JCRB1363 iPS-TIG120

TIG120-4f1 の細胞情報】

の細胞情報】

JCRB Cell

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アレイに含まれる遺伝子のリストは表１に示した。

アレイ名 Human Stem Cell Pluripotent PCR array (幹細胞の同定、分化、増殖に関与する 84 遺伝子の発現プロフィールを解析する)

アレイ遺伝子 BRIX, CD9, COMMD3, CRABP2, DNMT3B, EBAF, FGF5, FOXD3, GABRB3, GAL, GBX2, GDF3, GRB7, IFITM1, IFITM2, IL6ST, IMP2, KIT, LEFTB, LIFR, LIN28, Nanog, NODAL, NR5A2, NR6A1, PODXL, POU5F1, PTEN, REST, SEMA3A, SFRP2, SOX2, TDGF1, TERT, TFCP2L1, UTF1, Xist, ZFP42, FGF4, NOG, CDX2, CGB, EOMES, KRT1, GCM1, DDX4, SYCP3, COL1A1, COL2A1, RUNX2, HBB, HBZ, ACTC, NPPA, DES, MYF5, MYOD1, T, WT1, CD34, CDH5, FLT1, PECAM1, GCG, IAPP, INS, IPF1, PAX4, SST, TAT, AFP, FN1, FOXA2, GATA4, LAMA1, LAMB1, LAMC1, PTF1A, SERPINA1, SOX17, GFAP, HLXB9, ISL1, NES, NEUROD1, OLIG2, PAX6, SYP, TH

コントロール遺伝子

ACTB, RAF1, CTNNB1, GAPD, EEF1A1,18S

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(ii) 未分化マーカータンパクのプロ

フィール解析

従来使用されている糖鎖認識抗体 SSEA3、SSEA4、tra-1-60、 tra-1-81 は EC 細胞を免疫原として得られたものであり、必ずしも iPS 細胞/ES 細胞に特異的な成分を認識するものではない。分担研究者である川嵜敏祐とともに開発したECとES/iPS細胞を判別できる抗体なども含めて、評価方法を検討した。

近年、細胞表面マーカープロフィール解析については、免疫染色法よる解析が注目されていることから、

IN Cell Analyzer 2000（現有）によるイメージングサイトメトリー解析とフローサイトメトリー（FACS）解析を比較する。ヒト多能性幹細胞のマーカータンパクの発現について 2 つの手法を用いて解析を行い、

その結果を比較した。手法１として、

コーニング社製25cm²プラスチックフラスコを用いて培養後、細胞を分散し、Tra-1-60、SSEA-3、SSEA-4、

SSEA-1 などの抗体と反応させて免

疫染色を行い、フローサイトメトリーによる解析を行った。手法２として、同じロットの細胞をBD社製６ウェルプレートにて培養した細胞を４％パラフォルムアルデヒドにて室温で固定し、免疫染色を行ってイメージアナライザーにてプロフィール解析を行った。手法１、手法２による解析結果の比較を行った。

この比較解析は分担研究者である大沼清とともに行い、遠隔地の研究機関（長岡技術科学大：新潟県長岡市から医薬基盤研：大阪府茨木市）

における検査サンプル送付時の取扱い方法等についても検証した。

2．細胞登録システムの基礎設計案についての検討

研究目的にあった細胞を検索するためには、それに必要な細胞情報がデータベース化され、適切な検索システムが必要不可欠である。

しかし、現状では、細胞名のリストがあるだけである。そこで、研究用のヒト幹細胞を対象として、

細胞登録とデータ登録のための基盤設計を行うために、海外での実態について調査した。特に、海外のヒト幹細胞の分譲を行っている機関における細胞登録情報の収集を行った。また、細胞培養記録を継続して記載し、データ化について検討を行った。

3．臨床応用などに資するヒト幹細胞の品質維持技術の策定

ヒト ES/iPS 細胞の資源化工程において、適切なタイミングで検査を行い、凍結保存を行う必要が

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ある。また、株間の差も大きいため、様々な工程が予測され、細胞株によって臨機応変に対応できるよう工程を策定する必要がある。

海外の幹細胞バンクからヒト ES 細胞についての資源化工程表などが発表されており、これらの資料を集めて調査するとともに、実際に資源化を行い、株間の差を考えた工程表の作成を行った。

(i) フィーダーを用いたヒト ES/iPS 細胞の培養に関する作業工程表ならびに作業手順書の作成

平成 24 年度にフィーダーを用いたヒト ES/iPS 細胞の解凍・培地交換、継代、凍結について必要な準備、作業などのリストアップを行い、解凍・培地交換、継代、凍結について作業手順書を作成した。

データベースとして応用できるようにエクセルにて作成した。平成 25 年度は実際にこれらの手順書に従って細胞の解凍・培地交換、

継代、凍結を行い、改善するべき点について検討し、手順書の改定を行った。

(ii) フィーダーを用いないヒト ES/iPS 細胞の培養に関する品質管理法ならびに作業手順書の作成

フィーダー細胞を用いない無血清

培地を用いて培養を行う場合、その品質管理も従来の培養法を用いる場合とは異なってくる。東京大学浅島研究室にて無フィーダー・

無血清にて樹立され寄託されたヒト iPS 細胞 UTA‑SF2‑2 の資源化に備えて、 hESF9a 培地を用いた培養工程における品質管理方法を平成 24 年度に策定した。平成 25 年度には、策定した品質管理方法に従いヒト iPS 細胞 UTA‑SF2‑2 の資源化を行った。また、解凍・培地交換、

継代、凍結について作業工程表および作業手順書を作成した。

近年、次々と無血清培地が開発されていることから、どの培養条件にも対応できるような品質維持培養技術を策定する必要がある。そこで、

これまでに報告されている既知の組成よりなるフィーダー細胞を用いない市販の培地；ｍ TeSR1 培地、TeSR2 培地、TeSR‑E8 培地、申請者が開発した既知組成よりなる hESF9a 培地、動物由来成分不含 hESF‑FX 培地を用いて、複数の培養技術者がヒト ES/iPS 細胞を 5 継代にわたって培養を行い、評価や検査を行って、品質管理法を検討した。

倫理面の配慮

本研究についてヒト試料を用いてゲノム解析を用う研究を実施する場合には「ヒトゲノム･遺伝子解

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析研究に関する倫理指針」に、その他の研究は「臨床研究に関する倫理指針」に従って行うほか、研究機関等で定められた倫理規定を遵守して研究を遂行した。また、ヒト ES 細胞使用研究に関しては「ヒトＥＳ細胞の樹立及び使用に関する指針」

に従って行うほか、各研究機関等で定められた規定を遵守して研究を遂行した。あらかじめ当該研究機関の長等の承認、届出、確認等が必要な研究については研究開始前に所定の手続きを行っている。

将来有用な医療に繋がる可能性を秘めたヒト幹細胞研究が、社会の理解を得て適正に実施・推進されるよう、個人の尊厳と人権を尊重し、かつ、科学的知見に基づいて有効性及び安全性を確保できるよう厚生労働省「ヒト幹細胞を用いる臨床研究に関する指針」に従い、研究を推進した。JCRB細胞バンクならびに難病バンク運営にかかる倫理問題について従来より研究・政策提言を行っている難病疾患資源研究部・増井徹部長と連携し、研究推進のあり方、

情報公開における問題等に関する検討も行っている。「ヒト ES 細胞の品質管理に関する研究」（医薬基盤研究所）については文部科学大臣確認済みである。

C. 研究結果

１．未分化状態でのヒトiPS細胞の特性解析

2007年の ISCI の報告によれば、

未分化なヒトES細胞に発現している遺伝子は、NANOG, POU5F1 (OCT4), TDGF1, DNMT3B, GABRB3 やGDF3であった。このプロジェクトで使われた幹細胞遺伝子 PCR アレイは市販されており、

資源化の際に使用して、その検査に必要な細胞量などを計算した。具体的には、RNA（必要 RNA量1pg 〜 2μg ）を抽出し、High Capacity RNA-to-cDNA Kit (ABI 社、品番：4387406）を用いて逆転写し、

PCR アレイにアプライする。PCR アレイ解析には TaqMan Array Human Stem Cell Pluripotency Panel（ABI社、品番4385344）を使用し、AB7900HT リアルタイム PCR システムで測定し、ヒト幹細胞関連マーカー遺伝子の発現を測定した（研究論文④）。解析対象は図1の表に示すようにヒトES、iPS、間葉系幹細胞や癌細胞などを用いて解析を行った。さらに、ヒト

ES/iPS 細胞の培養過程におけるヒ

ト幹細胞の未分化マーカーや早期分化マーカーなどの遺伝子群の発現の安定性を確認するために、同じ手法を用いて、対象株について異なる継代数で複数回、解析した。さら

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にバイオインフォマティクス解析を行った結果については、分担研究者水口の項に譲る。水口らによる解析により、他の細胞株との比較解析も可能であり、幹細胞バンクにおける品質管理として有用であることが示唆された。問題点としては、コントロール株の設定であった。ISCI などにおいてコントロール株としてはヒトES 細胞H9株とEC細胞

株である 2012EP 細胞が使用され

ている。H9 細胞は培養しやすい安定した細胞株であるが、使用する MEF によって未分化マーカーの発現は揺れる（図3）。また、2012EP 細胞は EC 細胞であるが、ヒト ES 細胞よりも不安定であり、コントロール株として使用することが難しいことが明らかとなった。MEF や培地などのロットにより変化しない株をコントロールとするか、あるいは、ロット差のできるだけ少ない培養条件下における細胞をコントロールとするか、今後の課題であると思われる。

また、この幹細胞遺伝子 PCR アレイはin vitro分化能評価にも使用可能であった（図2）。ヒトES細胞は、受精卵の内部細胞塊由来であることから、成体組織を構成するすべての細胞に分化するとされる。ヒト ESと同様の分化能を持つiPS細胞も多くの細胞に分化するとされる。

その分化能は免疫不全マウスに移植しテラトーマ形成により確認される。しかし、マウスES細胞とは

異なり、ヒト ES/iPS細胞のテラトーマ形成試験の際には、精巣や腎皮膜下などへの移植が必要で技術を要する。また、分化にも時間がかかるため、必ずしも適確に分化能を評価できず、国際的に問題となっている。一方、再生医療や創薬などへの応用を目指す場合、通常はin vitro で分化させる。in vitroでの分化能を評価する場合、ES/iPS 細胞を凝集させて胚様体(Embryoid body;

EB)を作成させて分化誘導し、10日間から 3 ヶ月程度培養を行って分化マーカー遺伝子の発現を解析する。細胞はあらゆる細胞に分化する可能性があることから、分化マーカーの選択が難しい。幹細胞遺伝子 PCR アレイには早期分化マーカーも含まれており、EBを1週間以上 1ヶ月以内であればその分化を評価することが可能であり、未分化状態と分化状態の遺伝子を比較解析できた。それらの結果については、分担研究者・水口らとともに、バイオインフォマティック解析を行ったので、詳細については水口の項に譲る。

幹細胞関連遺伝子発現は、それほど大きく変化することは少ないが、

細胞表面抗原発現プロフィールは、

ヒト ES/iPS細胞を培養しているその培地やフィーダーのロットにより変化することも多い（図 3）。位相差顕微鏡像を見て普段の状態とは異なると思われるような場合には、フローサイトメトリーを行って

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確認すると、SSEA-1陽性細胞が増加していたり、SSEA-3陽性細胞が低下していたりする。しかし、実際に FACS をするためには細胞数が必要であり、解析もその当日前後に行う必要がある。一方、免疫染色の場合には、検査の必要性があると考えられた時点で固定を行い、数日間時間の猶予があり、作業工程を調整することが可能である。実際に免疫染色の結果をイメージアナライザーにより画像を取得して解析を行うことによりフローサイトメトリーと同様の解析結果が得ることが可能であった（図 4）。その際の作業として、抗体2種による二重染色を行うのは効率的ではあるが、実際にはバックが高くなるなどのトラブルも多い。バックグラウンドが高くなるとイメージアナライザーによる解析においてロット差が大きくなってしまう。そのため、基本的にはすべてシングルで染色を行う工程として設定した。免疫染色の場合には、6ウェルプレート2枚に播種し、6抗体による染色を行う。また、フローサイトメトリーと免疫染色はほぼ同じ抗体を用いることが可能であるが、いくつかの二次抗体でフローサイトメトリー測定においてバックグランドに影響を与えることが明らかとなったため、免疫染色とフローサイトメトリーと全く同じ抗体を使用することはできなかった。このヒト多能性幹細胞の未分化マーカーの解析の詳細につ

いては、分担研究者・川嵜の項に譲る。

また、下記図5のように、長岡技術科学大学にて培養を行った細胞を固定し、独）医薬基盤研究所に送付後、免疫染色を行ってイメージアナライザーにより解析を行って、長岡技術科学大学にて行ったフローサイトメトリーでの解析結果と比較したところ、高い相関性が得られた。フローサイトメトリーによる解析を行うためには、細胞数が必要であり、また、解析を行うタイミングも限定される。一方、細胞をプレートで培養後固定して免疫染色を行って解析を行う場合は、少ない細胞数で解析でき、また、固定後は随時解析を行うことができることから、

作業効率がよい。また、輸送を行った後に解析を行うこともできることから、品質評価法として有用であることが示された。

このように、平成 24 年度にヒト iPS 細胞 Tic を用い、長岡技術科学大学にて培養を行った細胞を固定し、独）医薬基盤研究所に送付後、

免疫染色を行ってイメージアナライザーにより解析を行って、長岡技術科学大学にて行ったフローサイトメトリーでの解析結果と比較するという工程を作成し、平成 25 年度に実際にTicを含む複数株のヒト

ES/iPS 株を用いて比較解析をおこ

なった。ヒト ES 細胞株 H9 については、培養、固定、フローサイトメトリー解析、イメージングサイトメ

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トリー解析すべての工程を医薬基盤研究所において行った。その結果、

高い相関性が得られることが確認された（図5）。フローサイトメトリーによる解析を行うためには、細胞数が必要であり、また、解析を行うタイミングも限定されるのに対し、

細胞をプレートで培養後固定して免疫染色を行って解析を行う場合は、少ない細胞数で解析でき、また、

固定後は随時解析を行うことができ、輸送を行った後に解析を行うこともできることから、品質評価法として有用であることが示された。

（結果の詳細については大沼の項を参照されたい。）

イメージアナライザーによる未分化マーカータンパクの解析がヒト幹細胞の品質評価法として特に有用であり、結果の信頼性も高く、

汎用性もあることが示された。そこで、これまで用いてきたヒト多能性幹細胞のマーカータンパク発現解析のための画像解析プロトコルの改良についても検討した。具体的には、これまではフィーダー細胞を用いてヒト幹細胞の培養を行った場合に、フィーダー細胞を特異的に染色できる抗体を用いてフィーダー細胞を解析対象から除いていたが、

このような抗体染色をしなくともフィーダー細胞とヒト幹細胞の細胞面積や核の大きさの差異等を利用してヒト幹細胞のみを画像認識させるというプロトコルへと改良した。この改良版のプロトコルを用

い、ヒトiPS細胞UTA-SF2-2の品質評価を行った（図 5 下図）。この改良版のプロトコルは、より汎用性が高く、フィーダー細胞を用いない培養にも応用できるものであることが示された。今後当バンクでも標準の評価方法として活用していく。

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図

イメージアナライザーによる未分化マーカータンパクの解析

図5 イメージングサイトメトリー解析

イメージングサイトメトリー解析

23 イメージングサイトメトリー解析

イメージアナライザーによる未分化マーカータンパクの解析イメージアナライザーによる未分化マーカータンパクの解析イメージアナライザーによる未分化マーカータンパクの解析

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2．細胞登録システムの基礎設計案についての検討

ヒト ES／iPS 細胞の株数は急ピッチで増加しており、既に数千株にも及ぶ。ところが、ヒト ES／iPS 細胞株の命名法について整備されておらず、混乱が生じている。細胞株の命名は細胞登録においては重要な案件である。2010 年の国際幹細胞学会（ISSCR：International Society for Stem Cell Research、 2010年7月15日開催）、及びISCI

（2010年9月15日開催）のワークショップで議論された内容に準拠して、2011 年 4 月に米国マサチューセッツ医科大学ヒト幹細胞バンクの International stem cell registry（ISCR）が代表として米国、

英国、オーストラリア、中国などの幹細胞バンクや幹細胞研究者らが提案する「ヒトES/iPS細胞株の命名法および細胞登録に関する統一規定の案」が米国科学誌Cell Stem Cell 2011年4月8日号に掲載された。これに対し、京都大学 iPS 細胞研究所（CiRA）山中伸也所長らの意見と米国細胞バンクAmerican Type Culture Collection （ATCC） Brian Pollok 所長らの意見が同誌の6月3日号に掲載された。両者ともISCRの提案に大筋で同意した上で、幹細胞研究の将来展望をもとに想定される問題を提起し、改善案を提示した。しかし、これらの改善案においても命名法は解決されてい

ないことから、京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター細胞プロセシング研究領域、

京都大学再生医科学研究所附属幹細胞医学研究センター霊長類胚性幹細胞研究領域、京都大学 iPS細胞研究所規制科学研究部門、理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室の研究者らと連携して、命名法についての提案を行った（研究論文⑤）。

ヒト幹細胞応用開発室にて資源化を行った細胞の細胞培養記録および各種検査結果記録は、JCRB 細胞バンクへの情報提供を行い、JCRB 細胞バンクにおいても情報の管理がなされている。それらの情報は JCRB 細胞バンクのホームページ http://cellbank.nibio.go.jp/ に掲載されている。また、資源化を行った細胞について、厚生労働省「ヒト幹細胞情報化事業」に情報提供を行い、その情報は

http://www.skip.med.keio.ac.jp/へ記載されている。また、海外の細胞バンクのサイトを収集し、ヒト幹細胞応用開発室のホームページに掲載した（次頁表）。

http://www.nibio.go.jp/baiyou/myweb1 _025.htm

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海外ヒト幹細胞分譲機関リスト

（ヒト幹細胞応用開発室のホームページ

http://www.nibio.go.jp/baiyou/myweb1_025.htm

ヒト幹細胞応用開発室のホームページ

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http://www.nibio.go.jp/baiyou/myweb1_025.htmに掲載）に掲載）

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3．臨床応用などに資するヒト幹細胞の品質維持技術の策定

海外の幹細胞バンクからヒト ES 細胞についての資源化工程表などが発表されており、これらの資料を集めて調査した。英国においては、

独立行政法人 Health Protection Agency (HPA、健康保護局)のセンターである National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC、国立生物学的製剤研究所)にUK Stem Cell Bankが設置されている。HPAは2003年設立され、 2005 年に英国放射防護庁（NRPB：National Radiological Protection Board）と合併し、独立行政組織（ NDPB ： Non − departmental Public Body）となって、関連機関と直接連携協力して業務を遂行していたが、2009 年に NIBSCと合併し、NIBSCが中核的機能を担っている。このような研究所にUK Stem Cell Bankが設置されたことは、英国における幹細胞の位置づけを示しており、英国においては厚生省がヒト幹細胞の研究を標準化し、創薬や医療への応用を目指している。

UK Stem Cell Bankの部長である Glyn Stacy 博士は、各国の幹細胞バンクにおける資源化に際する評価基準を標準化するため、国際ヒト幹細胞バンキングイニシャティブ(ISCBI)プロジェクトを設置して、国際連携を推進している。

ISCBIでは、ヒト多能性幹細胞の各

国で相互に研究利用して医療創薬への応用を促進する目的で、品質の確保されたヒト幹細胞の安定的な供給を行うにあたっての研究用幹細胞バンキングガイドラインを発表した（図 6 参考資料）。さらに、

ISCBI ではヒト幹細胞のワクチン

や再生医療などへの応用のための臨床用幹細胞バンキングガイドラインも作成中である。これについて、

ISCBI の会議に参加するとともに

厚生労働省医政局研究開発振興課再生医療研究推進室など関係機関より品質管理関連資料を収集し、ドラフトについての検討を行い、

ISCBI に日本における臨床用細胞

の品質管理に関する情報提供ならびにバンキングガイドラインの改定案の提出を行った。

ISCBI のバンキングガイドライ

ンの基盤となる UK Stem Cell Bank における臨床用ヒト幹細胞の作業工程表（図6参考資料）は、2005 年にすでに公表されている。ヒト ES 細胞の解凍率は一般細胞に比べて高くなく、樹立者から受け取った細胞を解凍・培養できないことも多い。そのため、培養を行うことができなかった場合なども記載されている（図 6 参考資料）。このようなフローチャートを作成することは、

実際に現場で作業を行う際には大変有用である。欧州においてカトリック文化圏であるにもかかわらず、

早くからヒトES細胞の研究を推進

(27)

27

してきたスペインは、早くからヒト幹細胞バンクの設置に動いてきた。

いくつかの幹細胞バンクがあるが、

その中でもアンダルシア幹細胞バンクはスペインで2004 年に設置された。2006 年に UK Stem Cell Bankの資源化工程表を参考として改良した工程表を発表している（図 7,8,9）。これらの作業工程表は実際に資源化を行う際には大変有用であった。図7は樹立者より提供されたアンプルのプレマスターバンクを作成する際の作業工程表である。

JCRB 細胞バンクにおいてはトークンと称している樹立者から供与されたアンプルのバックアップとしての保存工程である。できるだけ少ない継代数でバックアップを作成する必要があるが、検査も同時に行う必要があり、この作業工程は慎重に行う必要がある。JCRB細胞バンクにおいては、樹立機関からの提供は1アンプルとしているが、4アンプルの提供により効率的に品質検査を行うことが可能となる。しかし、1アンプルは細菌検査やマイコプラズマ検査の目的であり、培養上清で検査が可能であり、貴重な細胞の資源化の場合には、培養上清の提供がより有用であると考えられる。

マスターバンク作成の際には、プレマスターバンクを解凍することになるが、解凍率を測定する際にも、

ヒト幹細胞ならではの問題がある。

ヒトES/iPS細胞はシングルセルにすると細胞死に至るため、凍結する

際に細胞数を正確に測定することができない。実際には一部を採取して別途トリプシンなどによりシングルセルにして細胞数を測定することになる。しかし、解凍時に生存率を測定するためにはシングルセルにせねばならず、一方それでは播種できず、本質的な解凍率を知ることはできない。図 8にSpain Stem Cell Bankにおけるマスターバンク作成工程表を転載した。１アンプルを培養せずに検査のみに利用している。一方、分譲用バンク作成の際にはマスターバンク作成用のフラスコをそのまま凍結の工程を経ずに培養を継続している。しかし、これでは凍結したマスターバンクを解凍した場合の分譲用バンクと品質が異なる可能性がでてくる。

これらの工程表を参考にして、

JCRB細胞バンクにおけるヒトiPS 細胞資源化工程表を作成して（図 10、11）、実際に資源化を行う際に使用した。樹立者からの寄託分 1アンプルのバックアップとして５アンプルのトークンを作成し、うち 3 アンプルを保存し、2アンプルをシード作成に用いることとした。トークン作成時には STR による細胞同一検査のみを行った。本来は樹立機関より 5 アンプル提供されることとすれば、うち2アンプル解凍時に、

細胞生存率、細菌検査、真菌・酵母・

ウィルスなどの汚染検査、STR検査を行うこととする。解凍後の細胞増殖動態が不明の場合が多く、まずは

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28

1：2 にスプリットを行い、慎重に細胞増殖を行った。寄託者からのアンプルのバックアップとしてシード作成過程でトークンを作成する。

シード作成時には、汚染検査、生存率検査、染色体検査、未分化マーカー遺伝子発現検査、未分化表面マーカー検査、in vitro分化能検査、倍加速度検査を行った（図 11、12）。

シード解凍時も 3 アンプル解凍を行い、うち1アンプルは解凍後生存率検査を行うとともに、汚染検査に使用した。また、2アンプルは培養を行った。これによりロット内の解凍後生存率に差がないことが確認できた。細胞増殖させる際に、UK Stem Cell Bankなどの海外の幹細胞バンクでは、6ウェルプレートを使用している。そこで、当所も6ウェルプレートを使用した。UK Stem Cell Bankでは1ウェルあたり5アンプルを作成しているが、それでは解凍後のコロニー数が少なくなり、

セレクションが起きる可能性があり、当所では2アンプルから３アンプルまでとした。6ウェルプレートを用いることにより、効率的に作業を行うことが可能となることは明らかとなった。また、分譲用アンプルを作成後、品質保証試験を行って、

ユーザーが問題なく使用できるかどうか検査を行った。資源化開始時は不安定な形質であった株であっても、分譲用アンプル解凍後の検査では、培養法における注意点などがわかっていれば、トラブルなく培養

できる。樹立機関による培養法の指示だけではなく、第三者である細胞バンクにおける客観的な培養法の確認は重要であることが示唆された。

また、培養の状態を把握するために培養記録表を作成した。この記録表策定に当たっては、京都大学再生医科学研究所末盛准教授や京都大学 iPS 細胞研究所の青井教授らにも情報提供を行って、意見交換を行い、作成した。細胞名、継代数はもとより、使用する培地の名前、培地の量、添加する増殖因子の濃度や添加容量、あるいは作業工程などを詳細に明記してチェックすることにより、培養時に技術者が注意点を確認しながら作業できるように作成した。このフォームを他研究施設にも提供し、多施設で共用することにより、同じプラットフォームで培養法について検討でき、品質管理においても有効に利用できる（研究論文④）

(29)

図

（Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 1981

図 6．参考資料

Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 1981 資料 UK Stem Cell Bank

Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 1981 UK Stem Cell Bank

Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 1981

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UK Stem Cell Bank におけるヒト Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 1981

におけるヒト ES Advanced Drug Delivery Reviews 57 (2005) 1981–

ES 細胞の資源化工程表 – 1988 図３より転載）

細胞の資源化工程表図３より転載）

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図

ンク作成工程表

図 7．参考資料ンク作成工程表

参考資料アンダルシアンク作成工程表（Stem Cell Reviews

アンダルシア Stem Cell Reviews

30

アンダルシア Stem Cell Bank

Stem Cell Reviews 6:Stem Cell Bank におけるプレマスターバ 117 117–126 (2006) におけるプレマスターバ (2006) 図２より転載）におけるプレマスターバ

図２より転載）

におけるプレマスターバ図２より転載）

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図 8．

成工程表

．参考資料

成工程表参考資料アンダルシア（Stem Cell Reviews Stem Cell Reviewsアンダルシア Stem Cell Reviews

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Stem Cell Bank 6: 117–126 (2006)

Stem Cell Bank におけるマスターバンク作 126 (2006)

におけるマスターバンク作 126 (2006) 図３より転載）

におけるマスターバンク作図３より転載）

におけるマスターバンク作

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図 9．

程表

．参考資料

程表（Stem Cell Reviews

参考資料アンダルシア Stem Cell Reviews

アンダルシア Stem Cell Reviews 6: 117

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Stem Cell Bank 6: 117–126 (2006)

Stem Cell Bank における分譲バンク作成工 126 (2006) 図２より転載）

における分譲バンク作成工図２より転載）

における分譲バンク作成工

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図 10 ル作成

10．NIBIO ヒトル作成

ヒト iPS 細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用アンプ

細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用アンプ

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細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用アンプ細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用アンプ細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用アンプ細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用アンプ細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用アンプ

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図 11

11． NIBIO

NIBIO ヒト iPS

iPS 細胞資源化工程表：

34

細胞資源化工程表：

細胞資源化工程表：分譲用アンプル解凍後検査工程分譲用アンプル解凍後検査工程分譲用アンプル解凍後検査工程分譲用アンプル解凍後検査工程

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図 12

12．NIBIO ヒトヒト iPS 細胞資源化における検査細胞資源化における検査

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細胞資源化における検査細胞資源化における検査

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図1313．改訂ヒト．改訂ヒトiPS細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用バイアル作成細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用バイアル作成

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細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用バイアル作成細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用バイアル作成細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用バイアル作成細胞資源化工程表：トークン、シード、分譲用バイアル作成

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(i) フィーダーを用いたヒト ES/iPS 細胞の培養に関する作業工程表ならびに作業手順書の作成

平成 23 年度に英国の UK Stem Cell Bank やスペインアンダルシア Stem Cell Bank などにおける分譲バンク作成工程表を参考にして、資源化工程表を策定した。その工程表を元に実際に資源化を行ったところ、

それぞれの株間の特性の差により、

工程表に沿って作業が行えない事例があった。そこで、平成 24 年度には、特性の異なる様ざまな株に対応できるよう、また、できるだけ短い継代数で資源化できるよう作業工程を改訂した。平成 25 年度は、

改訂した工程表に従い、ヒト iPS 細胞 Tic ならびに Skipper の資源化を行い、詳細に検討を重ね、図 13 に示すような最終版の作業工程表に改訂した。平成 24 年度に作成した作業手順書についても同様に改訂を行い、JCRB 細胞バンクからの iPS 細胞の分譲時に添付する取り扱い説明書として提供を行った。

（ii) フィーダーを用いないヒト ES/iPS 細胞の培養に関する品質管理ならびに作業手順書の作成

東京大学浅島研究室にて無フィーダー・無血清にて樹立され寄託されたヒト iPS 細胞 UTA‑SF2‑2 の資源化にあたり、平成 24 年度には、上記（i）で策定した作業工程表をも

とに、UTA‑SF2‑2 の資源化を行い、

ウシファイブロネクチンならびに hESF9a 培地を用いた培養工程に実際に応用できた。さらに、平成 25 年度に（i）で策定した最終版の作業工程表がフィーダーを用いない培養工程にも汎用できることを確認した。一方、作業手順書は別途作成する必要があった。ウシファイブロネクチンならびに hESF9a 培地を用いた培養における解凍、継代、培地交換、凍結の作業手順書を作成し、

細胞分譲時の添付資料として JCRB 細胞バンクに提供した。

また、MEF（CF‑1）や SNL などのフィーダー細胞を用いて樹立、培養されたヒト ES 細胞・iPS 細胞を市販の TeSR‑E8 培地、申請者が開発した既知組成よりなる hESF9a 培地、動物由来成分不含 hESF‑FX 培地を用いて 5 継代以上培養し、評価や検査を行い、無フィーダー・無血清培養に馴化させて使用できることを確認した。

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[解凍解凍作業手順書作業手順書]

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[培地交換培地交換作業手順書作業手順書]

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[継代継代作業手順書作業手順書]

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[凍結凍結作業手順書作業手順書]

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D. 考察

１．未分化状態でのヒトiPS細胞の特性解析

国内外で多くのヒトiPS細胞が樹立され、再生医療のソース、ワクチン作製や生物製剤原料、創薬研究ツールとして実用化が期待されている。実用化に際しては、プレマスターバンク、統合的に管理するマスターバンク、実用のためのワーキングセルバンクの設置が望まれ、共用の基盤システムを構築しておく必要がある。しかしながら、ヒトES 細胞とほぼ同じ特性を持つヒトiPS細胞においても、

絶対的なマーカーはなく、また、多分化能を持つがゆえに、未分化状態は不安定である。これまで細胞バンクにおいて資源化されてきた培養細胞は、多くが癌細胞である。細胞増殖速度も速く、解凍後の生存率も高い。しかし、ヒトiPS細胞は癌細胞とは異なり、細胞倍加時間は遅く、解凍後の生存率も低い。また、培養過程において細胞形質が変化しやすく、

実用化を目指してバンク設置と運営を円滑に行うためには、幹細胞特性検査などを含めた作業工程などのフローを事前に構築しておく必要がある。そこで、実用に資するヒト幹細胞バンクに必要なデータベースの基盤設計、品質管理に必要な基盤技術の策定を行い、実用ヒト幹細胞バンクの基盤システムを設計について研究を行っている。また、多様な形質をもつヒトiPS細胞の標準化は、細胞自体を標準化するのではなく、品質評価を標準化することが先決であると考えられ、研

究を進めている。

未分化マーカーや分化マーカーなど 84遺伝子を集めたPCRアレイを用いて遺伝子プロフィールの解析を行うためのプロトコールを策定し、その方法を用いて各細胞株の未分化状態の品質管理を行うため、異なる継代数の細胞から RNA を抽出してStem Cell PCR アレイ解析を行い、継代による未分化状態の変化を確認した。詳細については、分担研究者・

水口の項にゆずるが、継代数が異なることにより発現が変動する遺伝子と、ほとんど変動しない遺伝子があることが明らかとなった。また、細胞株によって発現量が大きく異なる遺伝子が複数存在することが明らかとなった。これらの遺伝子の特徴を理解し、ヒト ES/iPS 細胞の遺伝子発現プロフィール解析を行っていくことが重要である。

ヒトiPS細胞における未分化マーカータンパク発現のプロフィール解析は、フローサイトメトリーを用いて行われるが、

機器やその操作方法、また、解析操作により、しばしば結果が異なる。詳細については、分担研究者・大沼の項にゆずるが、フローサイトメトリーによる解析のためには、多くの細胞数が必要であり、

解析のタイミングも制限される。本研究で、イメージアナライザーによって、フローサイトメトリーと同等の解析を行うことが可能であることが明らかとなった。

イメージアナライザーによる解析の場合、

プレートに播種された細胞を固定して 4℃で保存し、数週間の期間、保存することが可能である。凍結保存する細胞と同じロットの細胞を評価しようとする際、