VOL. 36 S-6
CTM-HE,関
連 化合 物 の微生 物学 的 定量 法
111生 体 試 料 中 のCefotiam
hexetil
関 連 化 合 物 の 微 生 物 学 的 定 量 法
畚 野 剛 ・前 田憲 一
武田薬品工業株式会社技術管理本部試験分析 センター率
Cefotiam hexetilの 活 性 体 で あ るcefotiam(CTM)の 生 体 試 料 中 濃 度 測 定 法(標 準 法) と し て,Proteus mirabilis TCC 211OOを 試 験 菌 と し,DST寒 天(pH8.0)を 測 定 培 地 とす るAgarwell法 を 設 定 し た。 本 法 の 測 定 下 限 濃 度 は0.1Mリ ン 酸 塩 緩 衝 液(pH7.0) 及 び ヒ ト血 清 中 で,共 にCTMと し て 約0.1μg/mlで あ っ た。
低 濃 度 ま た は 微 量 試 料 に適 し た 方 法(高 感 度 法)と して 検 討 したProvidencia rettgeri ATCC 9250及 びMacConkey寒 天(pH8.0)を 用 い るAgar well法(ま た はPaper disc 法)は 測 定 下 限 がCTMと し て 約0.03(ま た は約0.1)μg/mlで あ っ た。
活 性 代 謝 物 検 索 の た めProvidencia rettgeri ATCC 9250を 用 い る バ イ オ オ ー トグ ラ フ法 を設 定 し, cefotiam hexeti1を 経 口投 与 した ヒ トの血 漿 及 び 尿 を 分 析 し た 結 果CTM及 び 微 量 の 活 性 代 謝 物(SCE-1006及 びSCE-1136)を 検 出 し た 。
Key words: Cefotiamhexetil,微 生 物 学 的 定 量 法,生 体 試 料, Agar well法,バ イオ オー トグラフ 法
Cefotiam hexetilはcefotiam (CTM)のprodrugで あ って1),経 口 投 与 に よ り消 化 管 よ り吸 収 され た の ち,活 性 体 で あ るCTMと な り血 中 に移 行 す る2)。CTMの 微 生 物 学 的 定 量 法 に つ い て は,Proteus mirabilis ATCC 21100を 試 験 菌 と しDST(pH8.0)を 測 定 培 地 と す る 薄 層 カ ッ プ法 の 設 定 経 過 を 既 に 報 告 し た3)。 今 回 は そ れ を Agar well法 に 改 変 し さ ら にProvidencia rettgeri ATCC 9250を 用 い る 高 感 度 法 及 び バ イ オ オ ー ト グ ラ フ 法 に つ い て検 討 しcefotiam hexetilの 経 口 投 与 試 験 に お け る 生 体 内 動 態 研 究 に 適 用 す る こ と が 可 能 と な っ た 。
実 験 材 料 と 方 法
1. 薬 剤: Cefotiam hexetil及 び 関 連 化 合 物(Fig。 1) は 当 社 中 央 研 究 所 で 合 成 し た も の を 用 い た 。
2. 試 験 菌 株:当 研 究 室 で 保 存 中 のProteus mir. abilis ATCC 21100 (IFO 13300)及 びProvidencia rettgeri ATCC 9250 (IFO 13501)を 用 い た 。
3. 微 生 物 学 的 定 量 法3):
1) 測 定 用 培 地: Diagnostic sensitivity test
Fig. 1 Chemical structures of cefotiam hexetil and related compounds
(DST)寒 天 培 地(Oxoid), Bile violet DST培 地 (DSTに 胆 汁 酸 塩 を0.15%,ク リ ス タ ル バ イ オ レ ッ トを0.2mg%添 加 した もの)4)及 びMacConkey 寒 天 培 地(MCA,栄 研)を そ れ ぞ れ 滅 菌 前 にpHを 8.0に 調 整 して 用 い た 。 2) 菌 液:寒 天 斜 面 培 地 上 で37℃,一 夜 培 養 し た 新 鮮 な 菌 叢 を 滅 菌 水 に 懸 濁 し,光 電 比 色 計(日 立 EPO-B型)に よ り吸 光 度 が0.8に な る よ う に 調 整 * 〒532大 阪 市 淀 川 区 十 三 本 町2丁 目17 -85
112 CHEMOTHERAPY DEC. 1988
Cefotiam (ƒÊg/ml)
Fig. 2 Standard curves for assay of cefotiam
using Proteus mirabilis ATCC21100 as
the test organism
Medium : DST (pH 8.0) Vehicle : •œ•\•œAgar well
○―○Cylinder し た 。 3) 標 準 液:CTM標 準 品 を0.1Mリ ン 酸 塩 緩 衝 液(pH7。0)で 溶 解 して1,000μg(力 価)/mlと した も の を原 液 と し,さ ら に 同緩 衝 液 ま た は血 清(血 漿) で 希 釋 して 標 準 希 釋 系 列 を調 製 し た 。 4) 薄 層 カ ッ プ 法:含 菌 寒 天 平 板 上 に ス テ ン レ ス カ ッ プ を 立 て標 準 希 釋 液 及 び検 液 を 注 入 後34℃,一 夜 培 養 した 。 阻 止 円 の 直 径 を測 定 し,CTM濃 度 の 対 数 と平 均 阻 止 円 直 径 との 関 係 を2次 回帰5)し,こ の 曲 線(標 準 曲 線)に よ り検 液 中 のCTM濃 度 を算 出 した 。 5) Agar well法:薄 層 カ ッ プ法 と同 様 に して 調 製 し た含 菌 寒 天 平 板 に 直 径8mmの ノ ズ ル を 用 い て 穿 孔 し,各 孔 に標 準 希 釋 液 お よ び検 液 を50μ1ず つ 注 入 し た 。 以 下 の 操 作 は 前 項 に 準 じて 行 った 。 6) Paper disc法:ス テ ン レ ス カ ッ プ を 用 い る か わ り に,直 径6mmのPaper disc (Whatmann)に 検 液 各20μlを ス ポ ッ トし た もの を 含 菌 寒 天 平 板 上 に貼 付 した 。 そ の 他 の 操 作 は 薄 層 カ ッ プ 法 と同 様 に 行 った 。
4. 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ー バ イ オ オ ー ト グ ラ フ 法3):担 体 にSpotfilm silica gel f(東 京 化 成)を 用 い,溶 媒 系 と し て ア セ トン― 酢 酸 一 水 一 ア ン モ ニ ア 水(20:8:5:1)を 用 い て 薄 層 ク ロマ トグ ラ フ ィー
Cefotiam (ƒÊg/ml)
Fig. 3 Effect of diluent on standard curves for
assay of cefotiam by agar well method Test organism : P. mirabilis ATCC 21100 Medium : DST (pH 8.0)
Diluent : •œ•\•œ 0.1M phosphate buffer (pH 7.0)
○―○control serum (Consera, Nissui)
を 行 っ た 。 バ イ オ オ ー トグ ラ フ 法 の 試 験 菌 はP rettgeri ATCC 9250を 用 い,培 地 はMCA (pH8.0) を 用 い た 。 実 験 結 果 1. 微 生 物 学 的 定 量 法 1) 標 準 法:P.mirabilis ATCC 21100株 を試験 菌 と す る薄 層 カ ッ プ法 とAgar well法 の 標 準 曲線 はFig.2の よ う に な り,各 濃 度 に お け る 阻 止 円直 径 はAgar well法 の 方 が1.5∼2.5mm大 きか った。 また 阻 止 円 周 縁 の 鮮 明 度 に つ い て は両 者 に差 は なか っ た 。 Agar well法 に お い て 希 釋 液 の 影 響 を 検 討 し た結 果 をFig.3に 示 す 。 緩 衝 液 希 釋 と比 較 して 血 清 希 釋 に お い て 阻 止 円 の 直 径 は0.3∼1.1mm小 さ くな っ た が,両 者 の 測 定 下 限 濃 度 は ほ ぼ 同 等 でCTMと し て 約0.1μg/mlで あ っ た 。 また 血 清 希 釋 と血 漿希 釋 との 間 で 阻 止 円直 径 お よ び 測 定 下 限 濃 度 に差 は 認 め られ な か っ た 。 2) 高 感 度 法:低 濃 度 また は 微 量 の 生 体 試 料 に つ い て測 定 を 行 う た め,P.rettgeri ATCC 9250株 を試 験 菌 と す る 高 感 度 法4)を 設 定 し た 。 本 菌 を用 い た Agar well法 とPaper disc法 の 標 準 曲 線 はFig.4 の と お りで,そ の 測 定 下 限 濃 度 は そ れ ぞ れ 約0.03
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連化 合物 の微 生物 学 的定 量 法
113Fig. 4 Standard curves for assay of cefotiam using Providencia rettgeri ATCC9250 as the test organism
Medium : MCA (pH 8.0) Vehlcle: ●― ●Agar well
○― ○Paper dlsc
μg/ml,約0.1μg/mlで あ っ た 。 な お 測 定 培 地 と し てMCAの か わ りにBile violet DST (pH8.0)を 用 い た場 合 も ほぼ同 等 の 成 績 で あ っ た 。 標 準 法 お よ び高感 度 法 の 測 定 条 件 をTable 1に ま と め て 示 し た 。 2.バ イ オ オ ー トグ ラ フ 法:活 性 代 謝 物 検 索 の た めCTMと そ の 関 連 化 合 物 の 分 離 検 出 が 可 能 な 条 件 を 検 討 した 。 薄 層 ク ロ マ トグ ラ フ 法 は既 報 の 系3)を 用 い,バ イ オ オ ー トグ ラ フ 法 の 試 験 菌 と培 地 は 前 項 の 高 感 度 法 と同 じ も の と した 。 本 系 に お け る 標 品 の Rf値 はCTM, SCE-1136, SCE-1106が,そ れ ぞ れ 0.38, 0.62, 0.72で あ っ た。 ま た 測 定 下 限 量 は,そ れ ぞ れ1.2, 0.6, 0.6ngで あ っ た。生 体 試 料 をCTM と し て200ngを ス ポ ッ トし た 場 合SCE-1136ま た はSCE-1006はCTMの 約1/300存 在 す れ ば 検 出 可 能 と考 え られ る 。 Cefotiam hexetil, 200mg力 価 錠 を ヒ トに 経 口 投 与 し た 後,採 取 し た 尿 に つ い て の バ イ オ オ ー トグ ラ ム をFig.5に 例 示 す る。CTMに よ る大 きい 阻 止 帯 の 他 に,SCE-1136及 びSCE-1006標 品 のRfに 相 当 す る位 置 に,測 定 下 限 に近 い 小 さ い 阻 止 帯 が 認 め られ た 。 同 時 に 採 取 し た血 漿 に つ い て の バ イ オ オ ー トグ ラ ム に お い て も,CTMの 他 に ご く微 弱 なSCE -1136及 びSCE-1006と 思 わ れ る 阻 止 帯 が 検 出 され た 。 考 察 二 次 元 拡 散 法 に よ る生 体 試 料 中 の 抗 生 物 質 の 定 量 に お い て 我 が 国 で は 宮 村 ら6)に よ っ て 始 め られ た 薄 層 カ ッ プ法 が 汎 用 さ れ て 来 た 。 一 方Agarwell法 に つ い て はBennetら5)の 報 告 が 一 つ の 典 型 と考 え ら
Table 1 Microbiological
assay for cefotiam
(a summary
of assay conditions)
114 CHEMOT HERAPY DEC.1988 Urine of subj. A Urine of subj. B SCE-1006 Cefotiam SCE-1136 Urine of subj. C Urine of subj. D
Fig. 5
Bioautograms
of human urine after oral
administration
of cefotiam
hexetil
(200 mg)
れ る が,そ の後 我 が 国 に お い て も報 告 さ れ る よ う に な っ た7)。 カ ッ プ 法 が 約0.3mlの 検 液 を必 要 とす る の に 対 して,Agarwell法 で は50μlで よ い こ と, 及 び 検 液 注 入 後 の シ ャ ー レ の取 り扱 い 時 に カ ッ プ の 転 倒 の よ う な 失 敗 の な い こ と等 か ら,CTMの 測 定 も今 回 の検 討 に よ りAgarwell法 で 実 施 す る こ と と し た。CTMの 血 清 蛋 白 結 合 率 は8%と 報 告 さ れ て お り8),血 清(ま た は血 漿)試 料 の 測 定 に お い て は 血 清(ま た は血 漿)希 釋 に よ る 標 準 曲 線 の 調 製 が 望 ま し い。 今 回検 討 の 結 果 に 従 い,入 手 の容 易 な 市 販 血 清(Consera,日 水)を 用 い る こ と と した 。 本 法 に よ るPhase I試 験 血 漿 試 料 の 測 定 値 は,CTMと し て0.1∼6.0μg/mlの 範 囲 に お い て,HPLC法 に よ る値 と艮 好 な相 関(r=0.978)を 示 し た9}。 し た が っ て 上 記 希 繹 用 血 清 の 選 択 を 含 め て,本 微 生 物 定 量 法 の 設 定 は妥 当 で あ っ た と考 え られ る 。 経 口剤 は 注 射 剤 と比 較 し て低 濃 度 領 域 で の 測 定 が 多 くな る た め,標 準 法 とは 別 に 高 感 度 法 の 設 定 が 必 要 と考 え られ る 。 今 回 設 定 した 高 感 度 法 は 喀 痰,乳 汁 な ど の 試 料 の 測 定 に適 し て お り,ま た微 量 の 組 織 か らの 抽 出 液(3∼10倍 抽 出)を 対 象 と して も,十 分 な 測 定 感 度 が 保 証 され る よ う に な っ た 。 また 臨床 現 場 に お い て 微 量 の 試 料(液)を 直 接Paper discに 採 取 し,小 容 器 中 で 凍 結 保 存 した もの を定 量 に供 す る方 法10)も,高 感 度 法 の裏 付 が あ っ て は じ め て 可 能 とな った 。 Cefotiam hexetilを 投 与 し た ヒ トの 血 漿 及 び尿 中 よ りCTM以 外 に,微 量 の 活 性 代 謝 物(SCE-1136 及 びSCE-1006)が バ イ オ オ ー トグ ラ フ法 に よ り検 出 され た が,こ れ らの 代 謝 物 は動 物 実 験 に お い て も 認 め ら れ て い る11)。 (研究 期 間S59.2∼62.6) 文 献
1 ) NISHIMURA T, YOSHIMURA Y, MIYAKE A,
YAMAOKA M, TAKANOHASHI K, HAMAGUCHI N,
HIRAI S, YASHIKI T, NUMATA M Orally active
1-(cyclohexyloxycarbonyloxy) alkylester prodrugs
of cefotiam. J. Antibiotics 40: 81•`90, 1987 2) 棚 山 薫 晴, 吉 田 清 志, 三 谷 政 義, 塚 本 剛 司, 鳥 井 洋: 新 規 経 ロ セ フ ァ ロ ス ポ リ ンSCE-2174の ラ ッ ト, マ ウ ス, イ ヌ に お け る 生 体 内 運 命― エ ス テ ル 側 鎖 由 来 成 分 を 中 心 に し た 検 討 ― 。Chemotherapy投 稿 中 3) 番 野 剛, 前 田 憲 一: Cefotiam(SCE-963)の 体 液 内 濃 度 測 定 法 。Chemotherapy 27(S-3): 106∼ 111, 1979 4) 番 野 剛, 前 田 憲 一, 逸 見 昭 二: Protetts retrgeri ATCC 9250を 試 験 菌 と す るaminothiazolyl ce-phalosporinの 高 感 度 測 定 法 。Chemotherapy 32: 109∼110, 1984
5 ) BENNET JN, BRODIE JL, BEMER EJ, KIRBY WM M : Simplified, accurate method for antibiotic assay of clinical specimens. Appl. Microbial, 14: 170∼177, 1966
Microbiol. 14: 170∼177, 1966
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連 化合 物 の微生 物学 的 定量 法
115 ニ シ リ ンお よ び ス ト レ プ トマ イ シ ン の 濃 度 測 定 法 。 J.Antibiotics 3: 411∼416, 1950 7) 吉 田 正, 木 村 靖 雄, 土 肥 正 善, 片 桐 謙: 体 液 内 Tobramycinの 生 物 学 的 定 量 法 に 関 す る 検 討 。 Chemotherapy 23, 886∼893, 1975 8) 土 屋 皖 司, 近 藤 正 煕, 喜 多 八 洲 男, 畚 野 剛, 野 路 弓 子, 武 内 真 理 子, 水 田 栄 治: Cefotiam (SCE-963) の マ ウ ス, ラ ッ ト, ウ サ ギ お よ び イ ヌ に お け る 吸 収 ・ 体 内 分 布 お よ び 排 泄 に つ い て 。Chemotherapy 23: (S.3): 121∼132, 1979 9) 山 下 健 治, 太 田 竜 一, 青 木 勇, 前 田 憲 一, 畚 野 剛, 矢 敷 孝 司: 生 体 試 料 中 のCefotiam hexetilお よ び そ の 代 謝 物 の 高 速 液 体 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ る 定 量 法 。Chemotherapy投 稿 中 10) 西 代 博 之, 中 西 昌 美, 葛 西 洋 一, 橋 本 伊 久 雄, 沢 田 康 夫, 中 村 孝, 畚 野 剛, 前 田 憲 一: 抗 生 剤 体 液 内 濃 度 測 定 法 の 臨 床 的 研 究,微 量 試 料 に て 可 能 な 測 定 法 の 検 討 。JPn.J. Antibiotics 36: 3412∼3421, 1983 11) 喜 多 八 洲 男, 浜 口 直, 平 井 真 一 郎, 今 田 哲: Cefotiam hexetilの マ ウ ス, ラ ッ ト及 び イ ヌ に お け る 体 内 動 態― セ フ ェ ム 骨 格 成 分 を 中 心 に し た 検 討― 。 Chemotherapy投 稿 中 。MICROBIOLOGICAL
METHODS
FOR ASSAY
OF CEFOTIAM
HEXETIL
RELATED
COMPOUNDS
IN BIOLOGICAL
SPECIMENS
TAKESHI FUGONO and KENICHI MAEDA
Analytical Laboratories, Corporate Technology, Takeda Chemical Industries, Ltd.,
2-17-85 Juso-honmachi, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan
We developed assay methods for cefotiam (bioactive form of cefotiam hexetil, CTM) and related
compounds in biological specimens. For determination of CTM, an agar well mathod using Proteus
mirabilis ATCC 21100 as the test organism and DST agar (OXOID, pH 8.0) as the test medium was
established. The sensitivity of the mothod for CTM was about 0.1ƒÊg/ml both in 0.1 M phosphate
buffer (pH 7.0) and in human serum.
A method with higher sensitivity was also elaborated by using Providencia rettgeri ATCC 9250 and
MacConkey agar (pH 8.0). The sensitivity of this method using agar wells and paper discs as the
vehicles was about 0.03 and 0.1ƒÊg/ml respectively/
A bioautographic method using the same Probidencia strain was devised for detection of
antibactetially active metabolites. By this method, CTM and two minor metabolites (SCE-1006 and
