特集
生 命 現 象 を 目で 見 る
組織標本 を用 いた細胞内 力ル シウム濃度 変動 の画像解析
佐
藤
洋
一,齋
野
朝
幸
(岩 手医科大学医学部)
キ ー ワー ド: 細 胞 内 カル シ ウ ム濃 度 測定,ア デ ノ シ ソ三 リン酸, 共 焦 点 レーザ ー走 査 型 顕 微 鏡 末 梢 神 経 組 織,角 膜 上 皮1.は
じめ に
電 子 顕 微 鏡 は至 高 のバ イ オ イ メー ジ ン グ と言 っ て良 い.細
胞 内 の微 細 構 造 の詳 細 に加 え,機 能 分 子 の構 造 を 明 らか にす
る 上 で電 子 顕 微 鏡 は これ まで 以 上 に 威 力 を 発 揮 す る で あ ろ
う.し か しな が ら,電 子 顕 微 鏡 像 は いか に高 精 細 であ ろ う と
も,動 画 像 で は な い.そ れ に対 して蛍 光 顕 微 鏡 を使 った 細 胞
の イ メ ー ジ ン グは,生
きた 細胞 の動 きを リア ル タイ ム で観 察
で き る とい う利 点 が あ る.空 間 的 解 像度 は 電 子顕 微鏡 に比 べ
て 極 め て 低 い とは い え,機 能変 化 を 目で 見 る こ とが で き る の
は 形 態 学 者 に と って 堪 え られ な い よ ろ こび で あ る.そ の イ
メ ー ジ ン グで 最 も頻 繁 に お こな わ れ て い るの が,細 胞 内 カ ル
シ ウム濃 度([Ca2+]i)の
画 像 解 析 で あ る.
細 胞 内 情 報 伝 達 系 で重 要 な位 置 を 占め て い るCa2+は,も
と も と細 胞 に と って 有 毒 で あ り,[Ca2+]1は
細 胞 外 に比 べ て
極 め て 低 い レベ ル に 抑 え られ て い る.こ の[Ca2+]iは,何
らか の刺 激 に応 じて上 昇 し,引 き続 いて 運 動,分 泌,分 裂 や
細 胞 死 な ど様 々な細 胞 活 動 が起 き る こ とが 知 られ てい る.す
なわ ち,こ の変 動 を観 察 す る こ とに は,細 胞 の種 々の 反 応 を
モ ニ タ ー す る こ と とほ ぼ 同 義 と言 って 良 か ろ う1).Ca2+と
結 び つ く こ とに よ って蛍 光 特 性 が変 化 す る試 薬 の開 発 と,そ
の 微 弱 な 光 の変 化 を 捉 え る こ との で きる カ メ ラ,そ し て高 速
演 算 装置 の 普 及(す な わ ち パ ソ コ ンの高 性 能 化 と低 価 格 化)
に よ り,[Ca2+]iの
測 定 は細 胞 生 物 学 の 研 究 で 日常 的 に お こ
な わ れ る よ うに な った.
しか しな が ら,こ れ ま で な さ れ た[Ca2+]i動
態 に 関 す る
研 究 の多 くは,観 察 対 象 が 単 離 細 胞 で あ り,組 織 とい う場 の
中 で細 胞 を 観 察 した 例 は 多 くな い.そ の 原 因 の一 つが,顕 微
鏡 の空 間 的 解 像 度 の 悪 さで あ る.通 常 の 蛍光 顕 微 鏡 を ベ ー ス
に した シ ス テ ムで,細 胞 が 重畳 した 組織 標 本 を観 察す る と,
焦 点 面 以 外 か ら発 す る迷 光 に よ り組 織 を構 成 す る個 々 の細 胞
を 明 瞭 に分 別 で き な い.し た が って,細 胞 内 部 の イ オ ン濃 度
の変 動 を 細 胞 レベ ル で解 析 す るた め には,ど
うして も細 胞 を
単離 せ ざる を 得 な か った.け れ ど も,ピ ンホ ー ル で迷 光 を 除
去す る共 焦 点 レ ーザ ー走査 型 顕 微鏡 がバ イ オ イ メ ー ジ ン グに
導 入 され,組 織 内 の 細 胞 を 明 瞭 に観 察 す る こ とが可 能 とな っ
て きた2).
私 た ち は,組 織 侵 襲 時 に 細 胞 外 へ逸 脱 した ア デ ノ シ ン三 リ
ン酸(ATP)が
周 辺 組 織 へ どの よ うな 刺 激 を 与 え るか 解 析 し
て きた.本 稿 で は 組 織 標 本 を 用 い た 実験 の ノ ウハ ウを述 べ る
と と も に,末 梢 神 経 組 織 や 角 膜 上 皮 組 織 のATPに
対 す る反
応 性 を[Ca2+]iを
指 標 と して 検 討 した 結 果 を 慨 述 す る.神
経 組 織 は 多 様 な細 胞 が 寄 り集 ま って 構 成 され て お り,個 々の
細 胞 の 機 能 解 析 をす る上 で格 好 の モデ ル と思 わ れ る.ま た,
上 皮 組 織 は 分 化 ・成 熟 度 が 異 な る細 胞 が 整 然 と並 ん で お り,
分 化 度 に応 じた細 胞 内情 報 伝 達 系 の変 化 を 観 察 す る こ とが で
き る と期 待 した.
2.ATPに
よ って 引 き起 こ され る[Ca2+]i変
動 の メカ
ニ ズ ム
細 胞 質 の[Ca2+]iは,細
胞 外 に比 べ て10,000分 の1以 下 に
抑 え ら れ て い る.こ
の[Ca2+]iを
上 昇 させ る メ カ ニ ズ ム は
簡 単 に 分 け る と2系 統 あ る(図1).1つ
は,細 胞 膜 上 の受
図1細 胞 内 カ ル シ ウ ム イ オ ン 濃 度 上 昇 機 構.Pl受 容 体 や P2Y受 容 体 の よ う にGタ ン パ ク質 に 連 関 した 受 容 体 が 刺 激 さ れ る と,イ ノ シ トー ル 三 リ ン酸 が 産 生 さ れ,細 胞 内 貯 蔵 場 か らのCa2+放 出 ・動 員 を 引 き 起 こ す,Reactive Blue2はP2Y受 容 体 の ア ン タ ゴ ニ ス トで,Thapsigarginは 細 胞 内 貯 蔵 場 を 枯 渇 さ せ る働 き が あ る.チ ャ ネ ル 型 のP2X受 容 体 や イ オ ン チ ャ ネ ル を 通 じ て,細 胞 外 か らCa2+が 流 入 す る.Gd3+は こ れ を 抑 制 す る.
Yoh-ichi Satoh and Tomoyuki Saino: Digital image analysis of intracellular calcium ion concentration in tissue specimens
〒020-8505盛 岡 市 内 丸19-1
TEL: 019-651-5111 Ext. 3351, 3353; FAX: 019-651-5605
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2003年9月1日 受 付
電 子 顕 微 鏡Vol.38,No.3(2003) 166
容 体 がGタ ンパ ク 質 な ど を 介 し て イ ノ シ トー ル 三 リ ン酸(IP 3)を 産 生 し,そ れ が 小 胞 体 や 筋 小 胞 体,核 膜 槽 な ど の 細 胞 内 カ ル シ ウ ム 貯 蔵 場 か ら カ ル シ ウ ム イ オ ン を 動 員 す る 機 構 で あ る.も う一 つ が,細 胞 外 か ら単 純 に 細 胞 内 ヘ カ ル シ ウ ム イ オ ン を 導 入 す る も の で,イ オ ソ チ ャ ネ ル 型 の 受 容 体 や 電 位 依 存 性 カ ル シ ウ ム チ ャ ネ ル が こ れ に 相 当 す る.ま た,細 胞 内 カ ル シ ウ ム 貯 蔵 場 が 枯 渇 す る と,そ れ に 応 じ て 細 胞 外 か ら カ ル シ ウ ム イ オ ン が 流 入 す る こ と も 分 か っ て い る(Capacitative Ca2+entry)3). ATPお よび そ の 分 解 産 物 が 刺 激 物 質 と な る プ リ ン受 容 体 に は,大 別 してP1受 容 体 とP2受 容 体 が あ り,P2は さ ら にP2X受 容 体 とP2Y受 容 体Y`分 け られ る.P1受 容 体 とP 2Y受 容 体 は,Gタ ン パ ク質 と共 役 し たmetabotropic受 容 体 で あ り,細 胞 内 カ ル シ ウ ム 貯 蔵 場 か ら の カ ル シ ウ ム放 出 に よ り[Ca2+]iを 上 昇 さ せ る.一 方,P2Xはionotropic受 容 体 で,刺 激 さ れ る と細 胞 外 か ら のCa2+流 入 を 引 き起 こ す も の で あ る.ち な み に,ATPは 組 織 内 で 素 早 く分 解 さ れ て AMPや ア デ ノ シ ン に な り,そ れ に 対 し て 反 応 す る の がP1 受 容 体 で あ る.
3.顕
微 鏡 と測 定 装 置
細 胞 生 物 学実 験 では,実 験 槽 周 囲 に広 い ス ペ ース が確 保 し
や す い倒 立 顕 微 鏡 が多 く用 い られ て い る.け れ ど も倒 立 顕 微
鏡 は,組 織 ・細 胞 周 囲 を灌 流 して い る液 が 漏 れ る と,ス テ ー
ジの 下 に あ る対 物 レ ンズか ら ミラー,フ
ィル タ ー まで 汚 染 し
かね な い よ うな構 造 とな っ て い る.と
りわ け 対 物 レン ズは 汚
染 しやす く,メ ソテ ナ ンス に注 意 を 払 う必 要 が あ る.灌 流 液
は塩 類 を含 む の で錆 の 原 因 とな る.レ
ンズの 付 け 根 に つ い た
液 を放 置 す る と,レ ン ズが タ ー レ ッ トに 固 着 して しま い,ペ
ンチや プ ライ ヤ ーを 使 って 対 物 レン ズを 外 した,と い う事 例
は稀 では 無 い.そ こで 私 た ち は,実 験 終 了 時 は 必 ず対 物 レ ン
ズ を外 して,灌 流 液 の 漏 れ を チ ェ ック し,レ ンズ の付 け根 を
無 水 アル コール で 清 拭 す る よ うに 習慣 付 け て きた が,そ れ で
も灌 流 液 が レンズ 内 に 滲 入 して補 正環 が 錆 び 付 く事 態 を招 い
た こ とが あ る.最 近,水 漏 れ 事 故 防 止 を考 慮 した製 品 も出 て
きた とは いえ(Zeiss社
のAquaス
トッ プ),そ
うした も の
に頼 る こ とな く,顕 微鏡 本体 や 周 囲 を 清拭 す る よ うに 習慣 づ
け る方 が 良 い.
画 像 解 析 装 置 に は,蛍 光 顕 微 鏡 を ベ ー ス と した もの と,レ ー
ザ ー 光 を 走 査 す る共 焦 点 顕 微 鏡 や 多 光 子 顕 微 鏡 が あ る(表
1).画
像 解 析 装 置 の 最 高 峰 は(価 格 面 で も,性 能面 で も),
多 光 子 顕 微 鏡 で あ る が,も
と も と扁 平 な培 養 細 胞 で あれ ばZ
軸 方 向か ら発す る迷 光 も気 に しな くて 良 い の で,安 価 な蛍 光
顕 微 鏡 ベ ース の 装置 でか まわ な い 。一 方,私
た ち の よ うに 組
表1画
像解析装置の特徴
特 集 組織 標 本 を用 い た 細 胞 内 カル シ ウ ム濃 度 変 動 の 画 像解 析 167織 塊 の 個 々 の 細 胞 を 観 察 対 象 と し て い る 場 合 は,光 学 的 ス ラ イ ス 効 果 を 期 待 で き る 共 焦 点 顕 微 鏡 や 多 光 子 顕 微 鏡 を 使 用 す る こ と に な る. 細 胞 内 カ ル シ ウ ム動 態 を 観 察 す る 画 像 解 析 装 置 は,高 速 な 画 像 取 得 が で き れ ば そ れ に 越 した こ と は 無 い.け れ ど も,一 般 的 な レ ー ザ ー走 査 型 顕 微 鏡 で は ガ ル パ ノ ミ ラ ー ス キ ャ ナ ー を 用 い て レ ー ザ ー ビ ー ム 走 査 を す る た め,1画 面 の 取 得 に 長 い 時 間 が か か る.そ こ で レ ゾ ナ ン ス ガ ル パ ノ メ ー タ ー ス キ ャ ナ ー や 音 響 素 子 で 走 査 す る タ イ プ,あ る い は ニ ポ ウ デ ィ ス ク で 画 像 取 得 す る顕 微 鏡 が 開 発 さ れ た.Nikon RCM-8000や BioRad RTS2000,Noran OZは,高 い 空 間 的 解 像 度 に 加 え, か つ 画 像 取 得 時 間 が 短 い(一 画 面 あ た り1/30秒 以 下)と い う 特 質 を 有 す る 優 れ た レ ー ザ ー 走 査 型 顕 微 鏡 で あ っ た が 製 造 と 販 売 を 中 止 し て し ま っ た.現 在,リ ア ル タ イ ム で 精 細 画 像 を 取 得 で き る レ ー ザ ー 走 査 型 顕 微 鏡 は,横 河 電 機 の も の だ け に な っ て し ま っ た(表2).ち な み に,横 河 電 機 の 製 品 は 機 械 い じ りが 不 得 意 な 人 に は 向 か な い が,こ の 走 査 ヘ ッ ドを 使 用 し たPerkinElmer社 のUltraVIEW RSは 使 い や す い シ ス テ ム とな っ て い る. け れ ど も,生 理 実 験 で 使 わ れ る レ ー ザ ー 走 査 型 顕 微 鏡 に 求 め ら れ る 最 重 要 フ ァ ク タ ー は,「 速 さ 」 よ りは 「光 路 系 の 明 る さ」 で あ ろ う.一 般 的 な レ ー ザ ー 走 査 型 顕 微 鏡 の 時 間 分 解 能 は,ミ リ秒 以 下 の 時 間 単 位 で 起 き て い る 瞬 時 の[Ca2+] iの 変 動 を と ら え る に は 不 十 分 で あ る が,腺 細 胞 の 律 動 的 変 動 の よ うに 秒 単 位 で 起 き て い る ゆ っ く り した 変 動 を 観 察 す る こ と は 可 能 で あ る.私 た ち は 高 速 画 像 取 得 が 可 能 な 共 焦 点 顕 微 鏡(Nikon RcM-8000改 良 型)を 使 用 し て い る が,ど ち ら か と い え ば1∼5秒 の 間 欠 画 像 取 得 す る 方 が 多 い.光 路 系 が 明 る け れ ば,励 起 レ ー ザ ー 光 を 弱 く で き る た め,照 射 に よ る 蛍 光 強 度 の 減 弱(bleaching)は 軽 微 で,光 毒 性 も 軽 減 さ れ る.多 光 子 顕 微 鏡 は 原 理 的 にbleachingが お き に く く,空 間 的 解 像 度 も よ り高 い と い わ れ るが,あ ま りに 高 価 で あ る. む し ろ,明 る い 光 路 系 を 有 す る 一 般 的 な レ ー ザ ー 走 査 型 顕 微 鏡 を 使 っ て,標 本 作 製 に 工 夫 を 凝 らす 方 が 良 い.
4.組
織 標 本 作 製 方 法
最 新 の 画 像 解 析 装置 は 操作 が簡 便 に な り,培 養 細 胞 や切 片
であ れ ば さほ ど苦 労 す る こ と無 く画 像 が 取得 で きる.し か し
なが ら,厚 み の あ る組 織 標 本 で 美麗 な画 像 を 出す には そ れ な
りの テ ク ニ ックが 必 要 で あ り,さ らに難 しい の は,適 切 な標
本 作 りで あ ろ う.研 究 の オ リジ ナ リテ ィ ーは標 本 作製 にあ る
と言 っ て も過 言 では な い.
4.1組 織 小 片 化 ・ス ラ イ ス 標 本 切 除 し た 組 織 塊 は,そ の ま ま で は 結 合 組 織 が 多 す ぎ て イ メ ー ジ ン グ に 適 さ な い.本 来 の 組 織 形 態 を 残 す 程 度 に 細 切(直 径:100∼500μmぐ ら い)す る か,切 片 に す る.私 た ち は, 実 体 顕 微 鏡 下 で 丹 念 に 結 合 組 織 を 除 去 し た 後,コ ラ ゲ ナ ー ゼ (粗 製 又 は 純 化)な ど で,結 合 組 織 を 消 化 し て い る.ま た, 柔 ら か く て 保 持 が 困 難 な 組 織 や 方 向 性 を 定 め た い 時 に は,標 本 を 寒 天 に 包 埋 し た 後 に マ イ ク ロ ス ラ イ サ ー で 切 片(厚 さ 100∼200μm)と し て い る. 4.2蛍 光 指 示 薬 の 負 荷 蛍 光 指 示 薬 は,イ オ ン と結 合 す る こ と に よ り蛍 光 強 度 を 増 す(あ る い は 蛍 光 ス ペ ク ト ラ ム が 変 化 す る)試 薬 で,カ ル シ ウ ム感 受 性 蛍 光 指 示 薬 と し て 代 表 的 な も の が,Fura-2,Indo-1,Fluo-4な ど で あ る.カ ル シ ウ ム 感 受 性 蛍 光 指 示 薬 を 細 胞 表2代 表 的 な 高 速 レーザ ー走 査 型 顕 微 鏡 電 子 顕 微 鏡Vol,38,No.3(2003) 168に導 入 す る方 法 と して は,1)イ
ンジ ェ ク シ ョン装 置 を 用 い
て 蛍 光 指 示 薬 を直 接 細 胞 に 注 入 す る方 法 と,2)脂
溶 性 の蛍
光指 示 薬 を用 いて 細 胞外 か ら細胞 内へ 導 入 す る方 法 が あ る.
組織 内 の細 胞 それ ぞ れ に 指示 薬 を 注入 す る の は実 際 的 で は無
い た め,私 た ちは お もに 脂 溶性 蛍 光 指 示 薬 を用 い て い る.
蛍 光 指 示 薬 そ の もの は 水 溶性 で,脂 質 二 重 膜 か らな る細 胞
膜 を 通過 しに く く,そ の ま まで は 細胞 外 に指 示 薬 を 入れ て も
容易 に細 胞 に入 って い か な い.そ
こで指 示 薬 の一 部 に ア セ ト
キ シ メチ ル基 な どを 導 入 した脂 溶 性 の も の を用 意 す る.こ の
脂溶 性 試 薬 は細 胞 膜 を通 り抜 け て細 胞 内 に 入 る が,そ の ま ま
で は イ オ ンと結 合 して蛍 光 特 性 を変 化 させ る こ とは無 い.ア
セ トキ シ メ チル 基 が 細胞 内 の エ ス テ ラー ゼ に よっ て蛍 光 指 示
薬 か ら分 離 した 段 階 で,イ オ ン結 合 能 力 を獲 得 して指 示 薬 と
して の働 きを 発 揮 す る こ とに な る(図2).
私 た ち の 研 究 室 で は,脂 溶 性 の 蛍 光 指 示 薬 を2∼10μM
の濃 度 で 細 胞 外 液 に 加 え て,室 温 ∼37℃,40∼60分,組
織
・細 胞 を 滲 漬 す るの が一 般 的 で あ る .
指 示 薬 は 測 光 装 置 が蛍 光 を感 知 で き る程 度 に負 荷 しな け れ
ば い け な いが,あ
ま りに 負荷 が 良好 な場 合 は,か え って 反 応
が起 きに くい こ とを しば しば 経 験 して い る.こ れ は カル シ ウ
ム感 受 性 蛍 光 指 示薬 が カル シ ウム キ レー ト剤 を も とに した も
の で あ り,大 量 の 蛍 光指 示 薬 が細 胞 に入 る と遊 離Ca2+を
キ
レー トして しま うた め か も しれ な いが,も
っ と大 き な要 因 は
蛍 光 指 示 薬 の コ ンパ ー トメ ン ト化 で あ ろ う.蛍
光 指示 薬 は
細胞 質 内 に と ど ま るの が理 想 的 で あ るが,さ
ら に小 胞 体 な ど
の小 器 官 に蓄 積 され る こ とが知 られ て い る.そ
うな る と,細
図2蛍 光 指 示 薬 の 導 入.(a)蛍 光 指 示 薬(★)に 脂 溶 性 部 分 (○)を つ け た も の を 細 胞 外 液 に 加 え る と,細 胞 内 に 入 る. (b)細 胞 内 の エ ス テ ラ ー ゼ に よ って 蛍 光 指 示 薬 か ら脂 溶 性 部 分 が 外 れ,細 胞 質 内 に指 示 薬 は拡 散 す る.(c)細 胞 質 内に 拡 散 した指 示 薬 は,Ca2+と 結 合 す る と蛍 光 特 性 が 変 化 す る.そ の 蛍 光 強 度 の変 化 を解 析 す る こ とに よ り,Ca2+濃 度 の変 動 を 推 算 で きる,(d)細 胞 小 器 官 に 指 示 薬 が 取 り込 ま れ る コ ンパ ー トメ ン ト化 が 起 きる と,そ こか ら発 した 蛍 光 が,細 胞 質 の指 示 薬 に よ る蛍 光 を覆 い 隠 して しま う.胞 質 の蛍 光 が 少 々変 動 して も,小 器 官 由来 の 蛍光 に よ って覆
い隠 され て しま うこ と にな る.こ の コ ンパ ー トメ ン ト化 は,
脂 溶 性 蛍 光 指 示 薬 を用 い る限 り,少 な か らず 生 じて い る ので,
反 応 が予 想 に反 して弱 い場 合 は,蛍 光 指示 薬 の濃 度 を下 げ た
り負 荷 時 間を 短 縮 して み る と良 い.
4.3作
成 した組 織 標 本 の機 能 的 ・形 態 的 な検 証
標 本 の細 胞 が 痛 んで い な い か,実 験 終 了 時 に色 素 排 泄 法 で
チ ェ ッ クす る.私 た ち は,エ チ ジ ムホ モ ダイ マ ー を細 胞 外 液
に加 え て10∼30分 後 に 緑 色 光励 起 で 検鏡 して い る.色 素 排 出
能 力 を失 った 細 胞(す な わ ち死 ん だ 細胞)は 赤 く光 る の で,
作 製 した 標 本 が ダ メー ジの 大 きい ものか ど うか,容 易 に判 定
で き る.ま
た 本来 の 微 細 構 造 を 維 持 して い るか ど うか,実
験 終 了 後 に電 子 顕 微鏡 で観 察 して い る.本 稿 で述 べ た よ うな
組 織 標 本 では,細 胞 が 比較 的正 常 な微 細 構 造 を保 って い るの
に対 し,完 全 に 単 離 され た細 胞 で は 小胞 体 や ミ トコン ドリア
の膨 化,核
ク ロ マチ ンの異 常凝 集,分 泌 果 粒 の異 型 な ど,か
な りの 変 性 像 が 見 られ た.当 然,細 胞 間 の接 合 も失 わ れ て い
る.小 胞 体 は 上 昇 した細 胞 質 内 のCa2+を
貯 え る場 所 と して
重 要 な役 目を して い る が,そ
こが変 性 した細 胞 で測 定 され た
[Ca2+]iは どれ だけ 生 理 的 な もの か,疑 問 が残 る.
5.末 梢 神 経 組織 5.1標 本 作 製 Wistarラ ッ トを 炭 酸 ガ ス 屠 殺 し た 後,坐 骨 神 経,上 頚 神 経 節,後 根 神 経 節 を 取 り出 し,用 手 的 に 結 合 組 織 を 実 体 顕 微 鏡 下 で 取 り去 る.結 合 組 織 の 被 膜 を ピ ン セ ッ トで 軽 く破 き, カ ル シ ウ ム 感 受 性 蛍 光 指 示 薬 のIndo-1/AMあ る い はFluo-4/AM液(5∼10μM)に 滲 漬 す る. 通 常 の 蛍 光 指 示 薬 の 導 入 条 件 だ と,結 合 組 織 に 接 して い る 衛 星 細 胞 は 強 い 蛍 光 を 発 す る の に 対 し,衛 星 細 胞 に 被 覆 さ れ た ニ ュ ー ロ ン の 蛍 光 像 は 暗 く て 測 定 に 耐 え な い 場 合 が 多 か っ た.そ こ で,冷 暗 所(4∼10℃)で 一 晩,ゆ っ く り振 盪 さ せ な が ら 蛍 光 指 示 薬 を 細 胞 外 液 に 加 え た と こ ろ,比 較 的 均 等 に 組 織 内 の 細 胞 に 蛍 光 指 示 薬 が 導 入 さ れ た.ま た,蛍 光 指 示 薬 に 純 化 コ ラ ゲ ナ ー ゼ を300U/mlと 界 面 活 性 剤 の CremophoreｰELを0.02%加 え る こ と に よ り,組 織 深 部 の 細 胞 ま で 蛍 光 指 示 薬 が 導 入 さ れ た.こ の 際,タ ン パ ク 分 解 酵 素 活 性 を 有 す る 粗 製 コ ラ ゲ ナ ー ゼ(た と え ばTypeIIコ ラ ゲ ナ ー ゼ)を 用 い る と,組 織 形 態 が 崩 れ て 単 離 さ れ た 神 経 細 胞 標 本 を 得 る こ と が で き る.こ う した 単 離 細 胞 や ス ラ イ ス し た 神 経 節 で,こ の 長 時 間 低 温 負 荷 を お こ な う と コ ン パ ー ト メ ン ト化 が 生 じて し ま い,カ ル シ ウ ム 濃 度 変 動 が ほ と ん ど検 出 で き な くな っ た.用 い る 標 本 形 態 に 応 じて,コ ラ ゲ ナ ー ゼ の 濃 度 と純 度,負 荷 時 間 と温 度 を 調 整 して,至 適 実 験 条 件 を 決 め る こ と に な る. 指 示 薬 の 負 荷 が 終 了 した ら,灌 流 液 に よ っ て 標 本 が 動 か な い よ う に,カ バ ー ガ ラ ス に 標 本 を 固 着 す る.私 た ち は カバ ー ガ ラ ス に 細 胞 接 着 因 子 の セ ル ・タ ッ ク(BD Cel1-Tak TM)を 特 集 組 織 標 本 を 用 いた 細 胞 内 カル シ ウム濃 度 変 動 の画 像 解 析 169塗 布 して い る が,パ ッチ ク ラ ン プ 用 の ア ン カ ー を 併 用 す る こ と も あ る. 5.2神 経 周 膜 末 梢 神 経 線 維 は,束 に な っ て 結 合 組 織 内 を 走 行 して い る. そ の 神 経 線 維 束 は,扁 平 な 細 胞 が シ ー ト状 に 数 層 重 な っ て い る 鞘 に 包 ま れ て い る.こ れ を 神 経 周 膜perineuriumと 言 い, 結 合 組 織 中 の 環 境 変 動 か ら 神 経 線 維 東 内 の 環 境 を 守 り,拡 散 障 壁 と し て 働 い て い る と考 え ら れ て い る.組 織 損 傷 時 に 逸 脱 し たATPに 対 し て,こ の 神 経 周 膜 が 反 応 す る か ど うか 検 討 し た. 末 梢 神 経 線 維 を 取 り巻 く シ ュ ワ ン細 胞 はP2X受 容 体 を 有 す る と い わ れ て い る.私 た ち も,神 経 周 膜 を 破 い て,む き 出 し の 有 髄 神 経 線 維 にATPを 与 え る と,シ ュ ワ ン 細 胞 の [Ca2+]iが 上 昇 す る こ と を 確 か め た が,神 経 周 膜 を 被 っ た 状 態 で は シ ュ ワ ン 細 胞 は 反 応 せ ず,た しか に 神 経 周 膜 が 拡 散 障 壁 と して 働 い て い る こ と が わ か っ た.一 方,神 経 周 膜 細 胞 そ の も の もATPに 対 して 反 応 し た が,P1受 容 体 刺 激 薬 の ア デ ノ シ ン やAMPは 反 応 を 引 き起 こ さ な か っ た. 細 胞 外 液 か ら カ ル シ ウ ム イ オ ンを 除 去 した 状 態,あ る い は 非 特 異 的 チ ャ ネ ル ブ ロ ッ カ ー のGd3+存 在 下 でATP刺 激 し て も 反 応 は 起 き な か っ た こ とか ら,ATPに よ っ て 引 き 起 こ さ れ る[Ca2+]iの 上 昇 は 細 胞 外 か ら の カ ル シ ウ ム 流 入 に よ る も の と 判 定 で き た.こ れ は,神 経 周 膜 細 胞 がP2X受 容 体 を 有 し て い る こ と を 示 唆 し て お り,実 際 にP2X受 容 体 刺 激 薬 のa,β-Methylene ATPで 刺 激 す る と カ ル シ ウ ム の 上 昇 が 見 ら れ た.P2Y受 容 体 刺 激 薬 のUTPで は 反 応 が 引 き 起 こ さ れ ず,P2Y受 容 体 の ア ン タ ゴ ニ ス トで あ るReactive Blue2でATPに よ る 反 応 は 抑 え ら れ な か っ た.以 上 か ら, 神 経 周 膜 は 組 織 内 に 逸 脱 し たATPな ど の 物 質 が 直 接 に 神 経 線 維 に 触 れ な い よ うな 拡 散 障 壁 と し て 働 い て い る が,そ の 構 成 細 胞 そ の も の はATPに 対 し て 反 応 し,そ れ はP2X受 容
体 を 介す る も ので あ る こ とが 確 か め られ た.
5.3末 梢 神 経 節 臨 床 医 学 的 に,交 感 神 経 節 が 障 害 さ れ る こ と は 稀 で は な く, そ の 際 に 生 じ て い る 細 胞 の 反 応 を 解 析 す る こ とは 意 義 が 大 き い と 思 わ れ る.そ こ で 私 た ち は 上 頚 神 経 節 の イ メ ー ジ ン グ を 試 み た と こ ろ,神 経 細 胞 と 衛 星 細 胞 を 同 時 に 観 察 す る こ と が で き た.灌 流 液 にATPを 加 え る と,は じめ に 衛 星 細 胞 の す ぼ や い[Ca2+]iの 上 昇 が 生 じ,次 い で 比 較 的 ゆ っ く り し た[Ca2+]iの 上 昇 が 神 経 節 細 胞 に 起 っ た(図3).ア デ ノ シ ン やAMPは 反 応 を 引 き 起 こ さ な か っ た こ と か ら,ATPに 対 す る 反 応 はP2受 容 体 を 介 す る も の と 思 わ れ た. 衛 星 細 胞 の[Ca2+]iの 変 動 は,細 胞 外 液 のCa2+の 存 否 に 依 存 し て お り,Ca2+流 入 を 抑 え るGd+で も反 応 は 抑 制 さ れ た.α,β-Methylene ATPに よ り反 応 が 引 き起 こ され た が, UTPに は 反 応 せ ず,Reactive Blue2に よ る 抑 制 は 起 き な か っ た.し た が っ て,上 頚 神 経 節 の 衛 星 細 胞 はP2X受 容 体 を 有 して お り,細 胞 外 のATPに よ っ て 刺 激 を 受 け た 細 胞 は, 細 胞 外 か らCa2+を 流 入 させ て,[Ca2+]iを上 昇 さ せ る と思 わ れ た. 神 経 節 細 胞 で は,細 胞 外 か ら のCa2+流 入 を 抑 え て も ATPに よ っ て[Ca2+]iの 上 昇 が 観 察 さ れ,細 胞 内 カ ル シ ウ ム 貯 蔵 場 を 枯 渇 さ せ るThapsigarginで 反 応 は 抑 え ら れ た こ と か ら,ATPに よ っ て 細 胞 内 カ ル シ ウ ム 貯 蔵 場 か ら の Ca2+放 出 ・動 員 が 生 じて い る も の と 思 われ た.UTPに よ り反 応 が 引 き 起 こ され た が,α,β-Methylene ATPは 効 果 が な く,Reactive Blue2に よ っ て 反 応 は 抑 え ら れ た.以上 よ り,ラ ッ ト上 頚 神 経 節 の 神 経 節 細 胞 はP2Y受 容 体 を 有 して い る と結 論 で き た. こ の 組 織 標 本 を 用 い た 仕 に よ っ て は じ め て 示 さ れ た の が,衛 星 細 胞 と神 経 節 細 胞 のATPに 対 す る 反 応 の タ イ ム ラ グ で あ る.こ の 意 義 や メ カ ニ ズ ム に つ い て は ま だ 分 か ら な い図3ATPに よ っ て 引 き 起 こ さ れ る 上 頚 神 経 節 の[Ca2+]i変 動.ATPを 灌 流 液 に 加 え た 時 の,上 頚 神 経 節 の 擬 似 カ ラ ー 像(黄 ∼ 赤 が [Ca2+]iが 高 く,緑 ∼ 青 は 低 い 状 態)と グ ラ フ(青 線:衛 星 細 胞,赤 線:神 経 細 胞).蛍 光 指 示 薬 と し てIndo-1を 使 い,蛍 光 波 長 が440 nm以 上 の 蛍 光 強 度(F>440)と440nm以 下 の 蛍 光 強 度(F<440)の 比 が,[Ca2+]iを 反 映 し て い る.ATP刺 激 後 ,衛 星 細 胞(S)で 律
動 的 な[Ca2+]i変 動 が 生 じ,次 い で 神 経 細 胞(N)の[Ca2+]iが 上 昇 した.
電 子 顕 微 鏡Vol.38,No.3(2003)
が,一 つ の可 能 性 と して,神 経細 胞 は 衛 星 細胞 に密 に 囲 まれ
て い るの で,ATPが
浸透 しに くい の か も しれ な い.あ
る い
は,衛 星 細 胞 か らパ ラ ク ライ ン と してATPが
出 て い る可 能
性 も考 え られ る.い ず れ に しろ,神 経 節 損 傷 時 に生 体 内 で起
き て い る反 応 を解 析 す る上 で,衛 星 細 胞 と神 経 節 細 胞 の 反 応
パ タ ー ンの 相違 は念 頭 に入 れ る必 要 が あ ろ う.
5.4末
梢 神 経 組 織 のプ リン受 容 体
これ ま で,交
感 神 経 系 の 神 経 節 細 胞 の プ リ ン受 容 体 は
P2XとP2Y受
容 体 の どち ら も報 告 され て きた が,そ れ らの
多 くは 本 来 の組 織 形 態 を失 った 細 胞 で お こ なわ れ た 電 気 生 理
学 的 な 仕 事 で あ った(表3).ま
た,神 経 節 細 胞 を密に 取 り
巻 く衛 星細 胞 につ い ては,全
く言 及 され て こな か った.私 た
ち は で きる だけ 正 常 に近 い 組 織 で イ メ ー ジ ン グを お こな うこ
とに よ り,こ れ まで 無 視 され て きた 衛 星 細 胞 の反 応性 を,神
経 節細 胞 と と もに観 察 す る こ とに 成 功 した.そ の 結果 を概 観
す る と,支 持 す る細 胞(神 経 周膜,衛
星 細 胞)はP2X受
容
体 を有 して お り,神 経 節 細 胞 そ の もの はP2Yが
機 能 して い
る よ うに 思 わ れ た(図4).こ
れ まで の プ リン受 容体 に 関 す
る研 究 結 果 が 一 致 しな:かった の は,も
しか した ら神 経 節 細 胞
を取 り囲ん でい る衛 星 細胞 の 関与 を考 慮 して こな か っ たせ い
図4末 梢 神 経 組 織 を構 成 す る細 胞 のATPに 対 す る反 応 模 式 図,神 経 節 細 胞 はP2Y受 容 体 を 介 し たCa2+放 出 ・動 員 で [Ca2+]i上 昇 が 起 き るの に対 し,神 経 周 膜 や 衛 星 細 胞 の 反 応 は P2X受 容 体 を 通 じたCa2+流 入 に よ る.か も しれ な い.
と こ ろが,脊 髄 後 根 神 経 節 で は,組 織形 態 を保 った まま の
標 本 を 用 い た画 像解 析 を お こな って も反 応 が一 様 で は な く,
P2Y受
容 体 を有 す る衛 星 細 胞 や,P2X受
容 体 を 有 す る神 経
細 胞 が 混在 して い た.ま た,老 化 ラ ッ トと新 生 仔 ラ ッ トの 脊
表3交 感 神 経 系 神 経 節 細 胞 の プ リン受 容 体特集
組織標本を用いた細胞内 カル シウム濃度変動 の画像解析
171図5角 膜 上 皮 組 織 の[Ca2+]i変 動.角 膜 上 皮 の 中 間 翼 細 胞 層 にATPを 局 所 的 に 与 え た と き の,各 細 胞 層 の[Ca2+]i変 動 を あ らわ した グラ フ と模 式 図.中 間 翼 細 胞 層 で は[Ca2+]i変 動 が 水 平 方 向 へ 広 が るの に 対 し(実 線),表 層細 胞 層 や(灰 色 線} 基 底 細 胞 層(破 線 》 で は[Ca2+]i変 動 が 伝 播 しに くい.
髄 後 根 神 経 節 細 胞 を比 較 す る と,[Ca2+]i変
動 に 著 しい 相 違
が 認 め られ た(予 備 実 験,未
発 表).脊
髄 後 根 神 経 節 を 構 成
す る神経 細 胞 は,識 別 的 な 触 圧 覚 を 伝 え る も のや 温 痛 覚 を 伝
え る もの まで 千 差 万 別 で あ り,後 根 神 経 節 で なん らか の 結 論
を 得 るに た め に は,個
々の 細 胞 の 反 応 を 見 る と と もに 細 胞 の
種類 を 詳 細 に 吟 味 す る必 要 が あ ろ う.
6.角
膜 上 皮組 織
細 胞 が 分 裂 す る際 や 細 胞 が 死 ぬ 時 に も[Ca2+]iが
変 動 し
て い るが,核
内 のCa2+変
動([Ca2+]n)も
これ に 関 与 して
い る と思 わ れ る.一 方,分 化 度(成 熟 度)の
相違 が[Ca2+]i
変 動 に影 響 して い る可 能性 が あ る.[Ca2+]n変
動 を観 察 す る
ため に は空 間 的解 像度 に優 れ た顕 微 鏡 を 用 い るだ け で な く,
細 胞 核 とそ の 周 囲 の 小 器官 が弁 別 しや す い扁 平 な 細 胞 を標 本
系 と した 方 が 良 い.そ
こで 私 た ち は,分 化 度 に 相違 の あ る細
胞 か ら構 成 され る 角膜 上 皮 を 用 い て,[Ca2+]i変
動 の相 違 を,
組 織 標 本 と培 養 細 胞 標 本 を 用 い て検 討 した.
6.1標 本 作 製 日本 白 色 ウ サ ギ を ペ ン トバ ル ビ タ ー ル で 安 楽 死 させ た 後, 眼 球 か ら 角 膜 を 採 取 し た.デ ィ ス パ ー ゼ 処 理 で 角 膜 上 皮 を 実 質 か ら剥 離 す る.カ バ ー ガ ラ ス 上 に 標 本 を 接 着 し,灌 流 チ ェ ン バ ー に 移 し た 後,蛍 光 指 示 薬Indo-1/AMを 負 荷 し た (1μM20∼25℃45分).ま た,こ の 標 本 で ギ ャ ッ プ 結 合 の 構 成 タ ンパ ク質 で あ る コ ネ キ シ ン50の 局 在 を,ABC法 を 用 い て 免 疫 組 織 化 学 的 に 検 討 し た. ま た,ヒ ト角 膜 上 皮 細 胞 株 を ク ラ ボ ウ よ り購 入 し,標 本 に 用 い た.培 地 に はEpilife(R)を 用 い,2∼3日 後 に カ バ ー ガ ラ ス 上 に 細 胞 がconfluentに 発 育 し た 時 点 で,実 験 を お こ な っ た.一 部 の 標 本 で は,Mitotrackerで ミ ト コ ン ド リア を 染 め 出 し た. 6.2角 膜 上 皮 組 織 角 膜 上 皮 は,基 本 的 に は 表 皮 と 同 様 の 重 層 扁 平 上 皮 で あ る が,角 膜 実 質 か ら 表 層 に 向 っ て 基 底 細 胞 層,中 間 翼 細 胞 層, 表 層 細 胞 層 の3層 に 分 け ら れ て い る.ATPあ る い はUTP を 灌 流 液 中 に 加 え る と,角 膜 上 皮 全 体 の[Ca2+]iは 上 昇 し た が,細 胞 層 に よ っ て,そ の 反 応 パ タ ー ンが 異 な っ た.中 間 の 翼 細 胞 層 で は[Ca2+]iの 律 動 的 な 変 動 が 観 察 さ れ,そ の 変 動 は 近 接 し た 細 胞 ど う し で し ぼ し ば 同 期 し て い た の に 対 し,表 層 の 扁 平 な 細 胞 は,ATPに 対 す る 反 応 は 大 き い も の の 律 動 的 変 動 は 少 な か っ た.ま た,基 底 部 の 幼 弱 な 細 胞 は [Ca2+]iの 変 動 そ の も の が 弱 か っ た.局 所 的 に 中 間 翼 細 胞 層 にATP刺 激 を 加 え た と こ ろ,[Ca2+]iの 変 動 は,翼 細 胞 層 内 で 伝 播 した も の の,表 層 細 胞 層 や 基 底 細 胞 層 へ は 拡 が っ て い か な か っ た(図5). 細 胞 間 に 見 ら れ る[Ca2+]i変 動 の 同 期 や 伝 播 は,ギ ャ ッ プ 結 合 抑 制 作 用 の あ るOctanolで 抑 え ら れ た.コ ネ キ シ ン 43は 基 底 細 胞 層 に の み に 認 め られ る の に 対 しID,コ ネ キ シ ン 50は 全 細 胞 層 に 存 在 し た が,ど ち ら か と い え ば 表 層 細 胞 で は 染 色 が 薄 か っ た.す な わ ち,角 膜 上 皮 に お け る[Cap+]i変 動 の 細 胞 間 伝 播 に は ギ ャ ッ プ ジ ャ ン ク シ ョ ン が 関 与 して い る とは い え,そ れ は コ ネ キ シ ン の 種 類 と存 在 と は 必 ず し も 一致 し て お らず,言 い 換 え れ ば 「物 が あ る か ら と 言 っ て,機 能 し て い る とは 限 ら な い.」 と い う こ と で あ る. 6.3培 養 ヒ ト角 膜 細 胞 ATP刺 激 に よ る[Ca2+]i上 昇 は,最 初 に 核 周 囲 部 や 核 膜 槽 に 生 じ,そ の 後 に 核 内 な ら び に 細 胞 周 辺 部 へ と拡 が っ て い っ た 。 細 胞 質 の[Ca2+]i上 昇 よ り も,細 胞 核 の[Ca2+] n上 昇 が 素 速 く か つ 大 き い の が 特 徴 的 で あ っ た.こ の こ と は, [Ca2+].変 動 は 細 胞 質 の[Ca2+]i変 動 が 波 及 し た 受 動 的 な も の とい う よ りは,む し ろ 細 胞 核 も独 自 のCa"動 員 機 構 を 有 電 子 顕 微 鏡VoL38,No.3(2003) 172し て い る こ と を うか が わ せ る.核 膜 槽 が カ ル シ ウ ム 貯 蔵 場 と して か な りの ボ リ ュ ー ム を 占 め る 小 胞 体 と 連 絡 し て い る の で, [Ca2+].の 上 昇 は 核 膜 槽 か ら放 出 され た 大 量 のCa2+に よ る も の と 思 わ れ る.ミ ト コ ン ド リ ア も[Ca2+]i変 動 に 少 な か ら ず 影 響 を し て い る と言 わ れ て い る が,ATPに よ っ て 最 初 に 生 じ る 核 周 囲 部 の[Ca2+]iの 上 昇 領 域 は,ミ ト コ ン ド リ ア の 局 在 と 一 致 し て い な か っ た.な お,ATPを 局 所 投 入 し た と こ ろ,培 養 細 胞 で も[Ca2+]i上 昇 が 細 胞 間 を こ え て 広 が っ て い った が,こ の 広 が りはOctanolで 抑 え ら れ た. 6.4細 胞 成 熟 と 細 胞 間 コ ミ ュニ ケ ー シ ョ ン 今 回 の 実 験 で は,ATP刺 激 で 最 も 強 い 反 応 を 引 き 起 こ す の が 中 間 翼 細 胞 で あ り,細 胞 間 の シ グ ナ ル 伝 達 に も細 胞 層 に よ っ て 相 違 が 認 め られ た.こ の こ と は 細 胞 の 成 熟 度 に 応 じて, 個 々 の 細 胞 の[Ca2+]iの 変 動 パ タ ー ン が 異 な る だ け で な く, 細 胞 間 の コ ミ ュ ニ ケ ー シ ョ ン も 制 御 さ れ て い る こ と を 示 唆 し て い る.も っ と も,カ ル シ ウ ム 非 依 存 性 の 何 ら か の シ グ ナ ル が 分 化 度 の 異 な る 隣 接 細 胞 に 伝 え ら れ て い る 可 能 性 は 否 定 で き な い.今 後,[Ca2+]i変 動 と[Ca2+]、 変 動 の 相 違 が 分 化 度 や 成 熟 度 に ど の 程 度 影 響 さ れ て い る か 明 ら か に で きれ ば, 組 織 の 再 生 や 修 復 機 構 の 解 明 に 役 立 つ も の と 思 わ れ る.
