― 原 著 ―
薬剤量 か らみたAUC依
存性薬剤 に対 す る各種
抗癌剤感受性試験 の比較検討
武本
俊彦
日本医科大学 内科学第4教 室
A comparative study of chemosensitivity tests in vitro for AUC-dependent
drugs focusing on the usefulness of MTT assay with drug
washout and additional incubation (M-MTT)
Toshihiko Takemoto
Fourth
Department
of Internal
Medicine,
Nippon
Medical
School
Although many in vitro chemosensitivity tests for anticancer agents have been reported, no scientific assessment of the optimum exposure time and dose of anticancer drugs for such tests has been established.
We assessed the cytotoxicity of 4 anticancer agents (CDDP, CBDCA, ADM, MMC)by analyzing the relationships between the IC50 values and the drug exposure time in a study using PC-14 cells. The clinical AUC (Area Under the Curve) of each drug was compared with the dose giving 50% inhibition of the control level for cell growth (IC50) in a conventional MTT assay (C-MTT). A modified MTT assay, which involved washing out of the drugs and additional incubation (M-MTT) and a HTCA (Human Tumor Clonogenic Assay) was also carried out with PC-9 and PC-14 cells.
The results suggested that all of 4 anticancer drugs were AUC-dependent agents. The HTCA was considered to be the assay giving results closest to the doses effective in clinical practice among the 3 assays tested, while the C-MTT gave a much higher AUC than the clinical AUC. It is suggested the reason is that in the C-MTT all the cells are viable at the end of drug exposure. Thus, not only viable cells with the potential of proliferate but also those without this potential are included in the results.
On the other hand, viable cells with a proliferative potential are better assessed by the M-MTT, which has an additional incubation time.
This study indicated that the C-MTT was unsuitable in vitro chemosensitivity tests for new AUC-dependent drugs. In contrast, the HTCA and M-MTT showed the doses of AUC to be effectively closer to those in clinical practice and proved useful for analyzing the cytotoxicity of AUC-dependent drugs.
Key words: chemosensitivity test, MTT assay, AUC-dependent drug, additional incubation
緒 言
HTCA (Human Tumor Clonogenic Assay)1) やMTT
(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dophenyl tetrazolium bromide) Assay2)な ど,こ れ ま で に 様 々 なin vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 が 臨 床 効 果 の 予 測,新 しい 抗癌 剤 の ス ク リー ニ ン グ な ど の癌 化 学 療 法 の 基 礎 的 研 究 手 段 を 目的 に考 案 され て きて い る3,4).しか し,細 菌 学 の 薬 剤 感 受 性 試 験 の よ うに 確 立 され た 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 は存 在 して い な い.こ の 理 由 の一 つ と し て,臨 床 で 用 い られ る薬 用 量 に お け る薬 剤 の血 中 動 態 か ら算 出 され る 薬 剤 量 とin vitroに お け る抗 癌 剤 感 受 性 試 験 で の 薬 剤 量 との 関 係 につ い て検 討 され て い な か った こ とが あ げ られ る.一 方,人 癌 細 胞 培 養 株 を用 い た 細 胞 障害 性 に 関 す る近 年 の解 析 に よ り,抗 癌 剤 は Correspondence to Toshihiko Takemoto, Fourth
Department of Internal Medicine, Nippon Medical School, 1-1-5 Sendagi, Bunkyo-ku, Tokyo 113, Japan
そ の 細 胞 障 害 性 に よ りAUC (Area Under the Curve)依 存 性 薬 剤 お よび 時 間 依 存 性 薬 剤 に大 別 され る こ とが 判 明 して い る.前 者 で は そ の細 胞 障 害 性 はAUC (Area Under the Curve),す な わ ち 活 性 型 薬 剤濃 度 ×暴 露 時 間 の み で 想 定 され る こ と が 明 らか とな った5,6).現在,AUC依 存 性 薬 剤 に お い て は ア ニ マ ル ス ケ ール ア ップ7)を応 用 し てin vitroの デ ー タを 直 接 に 臨 床 使 用 の 参 考 とす る こ と さえ可 能 とな って きて い る8). 今 回,我 々は い くつ か のAUC依 存 性 薬 剤 を 用 い てMosmannら に よ り開 発 さ れ た 従 来 か ら の MTT assay(以 下Conventional MTT assay; C-MTT)2),暴 露 薬 剤 の洗 浄 後 に 追 加 培 養 を 行 う MTT assay(以 下Modified MTT assay; M-MTT)お よ びHTCA1)に お け るそ れ ぞ れ の 追 加 培 養 に 対 す る50%増 殖 抑 制 率 を 得 る た め に 必 要 と され るAUC量 と通 常 臨 床 で 投 与 され る薬 用 量 に お け るAUC量 の 比 較 を 行 った.そ して 薬 剤 量 (AUC)の 点 か ら どの 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 が 臨 床 に 近 い もの で あ る か を 検討 し,同 時 にin vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 に お け る薬 剤 接 触 条 件 お よび 薬 剤 洗 浄 後 の 追 加 培 養 に つ い て 検 討 した の で報 告 す る. 実験 材 料 な らび に方 法 (1) 実 験 材 料 1) 細 胞 実 験 に使 用 した細 胞 は 培 養 人 肺 腺 癌 細 胞 株 で あ るPC9, PC-14の2株 で あ る.こ れ らの細 胞 は 抗 生物 質 添 加RPMI 1640+10%FCS(牛 胎 児血 清) を 含 む 組 織 培 養 フ ラス コ内 で37℃, 5%CO2の 環 境 下 で 培 養 した. 2) 薬 剤 Cis-dichlorodiammine platinum(以 下 CDDP;日 本 火 薬 株 式 会 社 よ り供 与)は,そ の生 理 食塩 水 溶 解 液 を直 前 に生 食 水 を 用 いて 目的 とす る 濃 度 に 希 釈 して 実 験 に使 用 した.Cis-diammine-1, 1-cyclobutane dicarboxylate platinum II (以 下 CBDCA;ブ リス トル マ イ ヤ ー ズ 研 究 所 よ り供 与),Doxorubicin hydrochloride(以 下ADM;協 和 発 酵 工 業 株 式 会 社 よ り供 与),Mitomycin C(以 下MMC;協 和 発 酵 工 業 株 式 会 社 よ り供 与)は そ れ ぞ れ の 原 末 を 使 用 直 前 に 生 食 に よ り溶 解,希 釈 し て 使 用 し た. (2) 測 定 方 法 1) In vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 の 方 法 C-MTTで は,RPMI 1640+10%FCSに よ り 1×105個/mlに 調 節 さ れ た 癌 細 胞 浮 遊 液135μl を96穴Tissue Culture Plate (FALCON 3072) に 分 注 し,生 食 に よ り種 々 の 濃 度 に 希 釈 さ れ た 薬 剤15μlを 加 え て37℃5%CO2下 に て72時 間 の 培 養 を 行 っ た.そ の 後,MTT溶 液(5μg/ml in PBS)15μlを 加 え て4時 間37℃5%CO2下 に 置 き,10%SDS(n-Dodecylsulphate sodium salt) in 0.01N HCL溶 液100μlを 加 え た.24時 間 後, マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー(日 本 バ イ オ・ ラ ッ ド ラ ボ ラ ト リー ス 株 式 会 社,モ デ ル3550EIAリ ー ダ ー)に よ り560nmの 波 長 で 吸 光 度 を 測 定 し た. M-MTTで は,癌 細 胞 浮 遊 液(1×105個/ml in RPMI 1640+10%FCS)0.9mlに 種 々 の 濃 度 の 薬 剤0.1mlを 加 え て37℃5%CO2下 に て2時 間 の 薬 剤 暴 露(薬 剤 のAUC依 存 性 を 検 討 す る 実 験 で は1,2,4,8,24,48,96時 間)を 行 っ た. 薬 剤 洗 浄 後RPMI 1640+10%FCSに て 再 浮 遊 さ せ1mlと し,そ の150μlを96穴Tissue Culture Plateに 分 注,37℃5%CO2下 に て72時 間 追 加 培 養 を 行 っ た.そ の 後MTT溶 液(5μg/ml in PBS)15μlを 加 え,以 下C-MTTと 同 様 の 方 法 に て 測 定 を 行 っ た. HTCA1)で は 種 々 の 濃 度 の 薬 剤0.3mlに,癌 細 胞 浮 遊 液(PC-9, PC-14と も5×104個/ml in RPMI 1640+10%FCS)2.7mlを 加 え,37℃ 以 下 に て2時 間 の 薬 剤 暴 露 を 行 っ た.薬 剤 洗 浄 後, RPMI 1640+10%FCS 2.7mlに 再 浮 遊 さ せ,さ ら に3%noble agar 0.3mlを 加 え,そ の1mlを 35mm培 養 皿 を 用 い た 二 重 軟 寒 天 培 地 の 上 層 と し た. 下 層 と し て 最 終 濃 度0.6%noble agarを 含 む 10%FCS+5%HSA (Horse Serum Albumin) 加McCoy's 5Aの1mlを 用 い た.37℃5%CO2 環 境 下 に て14日 間 培 養 後 コ ロ ニ ー カ ウ ン タ ー(東 洋 測 器Colony-Analyzer CA-7)で コ ロ ニ ー 数 を 算 定 し た.
2) 薬 剤 のAUC依 存 性 の 検 討 薬 剤 の 暴 露 時 間 を1,2,4,8,24,48,96 時 間 と し たM-MTTに よ りPC-14(人 肺 腺 癌 細 胞 株)に 対 す る 各 薬 剤(CDDP, CBDCA, ADM, MMC)の 細 胞 障 害 効 果 を 薬 剤 の 暴 露 時 間 とIC50 値(薬 剤 暴 露 群 のIC50値:薬剤 非 暴 露 の コ ン ト ロ ー ル 値 の50%値 を 示 す と き の 薬 剤 濃 度)と の 相 関 か ら 検 討 し た. す な わ ち,log〔IC50〕-log〔 暴 露 時 間 〕グ ラ フ を 描 きAUC依 存 性 か 否 か の 検 討 を 行 っ た.こ の と き-1の 傾 き を 持 つ 直 線 に な る も の はAUC依 存 性 薬 剤 と 判 断 され る9). 3) 各 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 に お け るIC50お よ び そ のAUC (AUCIC50) 各 感 受 性 試 験(C-MTT, M-MTTお よ び HTCA)で は 培 養 人 腺 癌 細 胞 株 のPC-9とPC-14 細 胞 を 対 象 と した.そ れ ぞ れ の 感 受 性 試 験 に お け る50%抑 制 を 示 す 薬 剤 暴 露 培 地(RPMI 1640+ 10%FCS)中 の そ の 薬 剤 のAUC量(AUCIC50)を 算 出 す る た め に,CDDPとCBDCAで は 薬 剤 暴 露 培 地 中 のCDDP, CBDCAか ら の 非 蛋 白 結 合 プ ラ チ ナ(free Pt.)濃 度 を 経 時 的 に 測 定 し た.CDDP, CBDCAを 薬 剤 暴 露 培 地 に 加 え37℃5%CO2下 に て0(薬 剤RPMI1640+10%FCSに 加 え た 直 後 の も の),1,2,4,8,24,48,72時 間 静 置 後,ア ミ コ ン セ ン ト フ リー(code number 4104) で1970G,20分 間 遠 心 分 離 し て 限 外 濾 過 液 を 得 た.こ の 限 外 濾 過 液 中 のfree Pt.濃 度 を フ レ ー ム レ ス 原 子 吸 光 度 法10)に よ り測 定 し た. さ ら に 台 形 法 に よ り薬 剤 暴 露 培 地 中 に お け る free Pt.のAUCIC50を 計 算 した. ADMとMMCで は,薬 剤 暴 露 培 地 中 のADM, MMC濃 度 を 経 時 的 にHPLC法(High Perfor-mance Liquid Chromatography)11)で 測 定 し, CDDPやCBDCAと 同 様 に 台 形 法 に よ り薬 剤 暴 露 培 地 中 のADM, MMCのAUCIC50を 求 め た2). 4) 追 加 培 養 過 程 に お け るIC80と 細 胞 数 の 変 化 PC-14細 胞 浮 遊 液(1×105個/ml in RPMI1640+10%FCS)0.9mlに 種 々 の 濃 度 の 薬 剤0.1mlを 加 え て37℃5%CO2下 に て72時 間 の 薬 剤 暴 露 を 行 っ た. 次 い で 薬 剤 非 洗 浄 群 で は,PC-14細 胞 浮 遊 液 150μlを96穴Tissue Culture Plateに 分 注 し た 後 にMTT溶 液(5μg/ml in PBS) 15μlを 加 え て4時 間37℃5%CO2下 に 置 き,10% SDS in 0.01N HCL溶 液100μlに 加 え た.24時 間 後,マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー に よ り560nmの 波 長 で 吸 光 度 を 測 定 し た. 薬 剤 洗 浄 群 で は2回 の 薬 剤 洗 浄 後,24,48,72, 96時 間 の 追 加 培 養 を 行 っ た 後 にMTT溶 液(5 μl/ml in PBS)15μlを 加 え,以 下C-MTTと 同 様 の 方 法 に よ り吸 光 度 を 測 定 し てIC80値 の 変 化 を 検 討 し た. ま た,追 加 培 養 過 程 に お け る 生 細 胞 数 の 変 化 を 調 べ る 目 的 でCDDP 2μg/ml, CBDCA 30μg/ ml,お よ びADMとMMCは そ れ ぞ れ1μg/ml に よ る72時 間 の 薬 剤 暴 露 を 行 っ た.そ し て 薬 剤 洗 浄 後,そ れ ぞ れ の 追 加 培 養 時 間(0,24,48,72 時 間)ご と にDye exclusion法13)に よ り生 細 胞 数 を 測 定 した.Dye exclusion法 は,PC-14細 胞 浮 遊 液5.0μlに ト リ パ ン ブ ル ー 溶 液50μlを 混 和 し た 後,生 細 胞 数 を 血 球 計 算 板 を 用 い て 算 定 し た. 結 果 1. 薬 剤 のAUC依 存 性 の 検 討 CDDP,CBDCA,ADMお よ びMMCの4薬 剤 のM-MTTを 用 い たlog〔IC50〕-log〔 暴 露 時 間 〕 グ ラ フ は い ず れ も傾 き-1の 直 線 と し て 示 さ れ た (Fig. 1).こ の 実 験 結 果 か ら4薬 剤 と も す べ て AUC依 存 性 薬 剤 で あ る こ と が 判 明 し た8). 2. 各 薬 剤 感 受 性 試 験 に お け るIC50お よ び そ のAUC (AUCIC50) Table 1は,そ れ ぞ れ の 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 で 50%抑 制 を 得 る た め の,各 薬 剤 のAUC (AUCIC50) と 臨 床 使 用 時 のAUC (AUCCLIN.)と の 比 較 を 示 し た も の で あ る14∼18).4薬 剤 す べ て に お い てC-MTT, M-MTT,次 い でHTCAの 順 に 高 い AUCIC50値 が 得 られ た.特 にC-MTTの 場 合, AUCCLIN.と 比 べ て 掛 け 離 れ て 高 値 のAUC量 を 必 要 と し た.C-MTTで は,PC-9で 得 ら れ た4薬 剤
Fig. 1 log-log relationships between IC50 and exposure time for (a) CDDP (b) CBDCA
(c) ADM (d) MMC by modified MTT assay using PC-14 cells
のAUCIC50/AUCCLIN.比 は101.2±155.0倍 と 著 し く高 く,さ ら にPC-14に お い て も68.9±89.9 倍 と高 か っ た. M-MTTで は,PC-9のAUCIC50/AUCCLIN.比 は 15.9±21.3倍 と 低 下 し,ま たPC-14で も9.3± 8.4倍 と な っ て い た.さ ら にHTCAの 場 合, AUCIC50/AUCCLIN.比 はPC-9で0.69±0.42倍,同 様 にPC-14で も1.14±1.13倍 と い う結 果 が 得 ら れ た. こ の 実 験 結 果 か らM-MTT, HTCAの 順 に AUCCLIN.に 近 いAUC量 で50%抑 制 率 を 得 る こ と が 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ た. 特 にHTCAか ら 得 ら れ たAUC量 は,臨 床 使 用 時 に 最 も近 い 結 果 と な っ て い た. 3. 追 加 培 養 過 程 に お け るIC80お よ び 生 細 胞 数 の 変 化 薬 剤 非 洗 浄 時 のIC80値 と 薬 剤 洗 浄 後 に 追 加 培 養 を 行 っ た 群 の 経 時 的 なIC80値 の 変 化 をTable 2に 示 し た.薬 剤 洗 浄 群 に お い て 洗 浄 直 後(追 加 培 養 時 間:0時 間)と 薬 剤 非 洗 浄 群 のIC80値 に は ほ と ん ど 相 違 は み ら れ な か っ た.さ ら に4薬 剤 す べ て に お い てIC80値 は 洗 浄 後 の 追 加 培 養 時 間 が 延 長 す る に し た が っ て 低 下 し,72時 間 の 追 加 培 養 後 に お け るIC80値 は0時 間 のIC80値 の14%か ら24%に ま で 低 下 し て い た.
Table 1 Comparison of required AUC of four drugs (CDDP, CBDCA, ADM, MMC) to get 50% inhibition in three assays (C-MTT, M-MTT and HTCA) using PC-9, PC-14 cells and AUC in clinical practice
Table 2 IC 80 of four drugs (CDDP, CBDCA, ADM, MMC) in Conven-tional MTT assay and changes of IC80 by time of additional incubation using PC-14 cells
Fig. 2 Changes of viable PC-14 cells by time of additional incubation. Open circles (-○ -) represent the numbers of viable cells
which have no drug exposure . Open squares (-□-) represent the numbers of viable cells during drug exposure at each of (a) 2μg/ml CDDP, (b) 30μg/ mlCBDCA, (c) 1μg/ml ADM, (d) 1μg/ ml MMC. Each point indicates the means of three experiments (n=3) . 72時 間 の追 加 培 養 に お け る 生 細 胞 数 の 変 化 を Fig. 2に 示 した.4薬 剤 と も コ ン トロー ル群(薬 剤 無 処 理 の もの)に お い て 追 加 培 養 時 に生 細 胞 数 の対 数増 殖 過 程 が 認 め られ た も の の,薬 剤 処 理 群 で は4薬 剤 と も生 細 胞 数 の 対 数 増 殖 過 程 は 見 られ なか った. 考 察 これ まで に多 くの抗 癌 剤 感 受 性 試 験 が 報 告 され て きた が,い まだ 確 立 され た も の は な い .こ の主 な理 由 と して,1)正 常 細 胞(繊 維 芽 細 胞 な ど)の 混 入 な ど技 術 的 な 問 題 の た め に 感 受 性 試 験 の 成 功 率 や 再 現 性 に乏 しい こ と,2)新 し い抗 癌 剤 の ス ク リー ニ ン グや 臨 床 効果 の 予 測 を 目的 と した これ ま で の 感 受 性 試 験 で は,薬 剤 濃 度 や 暴 露 時 間 の 設 定 は そ れ ぞ れ の 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 に よ って 異 な り, さ ら に そ の 明 確 な 設 定 根 拠 が 明 ら か で な か っ た4,19,20).3)さらに 今 まで の 感 受 性 試 験 で は,臨 床 で用 い られ る 薬 用 量 に お け る薬 剤 の血 中 動 態 か ら 算 出 され る薬 剤 量 とin vitroに お け る薬 剤 量 との 関 係 につ い て全 く検 討 され て い な か った こ と,な どが あ げ られ る. 今 回 のPC-14を 用 い た 実 験 で,小 沢 ら9)のlog 〔IC50〕-log〔暴 露 時 間〕 カー ブに した が って 解 析 した結 果,CDDP, CBDCA, ADMお よびMMC はす べ てAUC依 存 性 で あ る こ とが 明 ら か に され た(Fig. 1).こ の4薬 剤 がAUC依 存 性 で あ る限
り,そ の細 胞 障 害 性 はAUC量 に よ って 規 定 され る6,21).この た めAUC依 存 性 薬 剤 で は,今 まで の よ うな薬 剤 濃 度 に よ る細 胞 障 害 性 の 検 討 で は な く,そ れ ぞ れ のAUC量 に よ っ て抗 癌 剤 の細 胞 障 害 性 を検 討 す る こ とが 理 論 的 と考 え られ る. ま た,M-MTTを 用 い た 今 回 のAUC依 存 性 薬 剤 の 実 験 結 果 か ら も,そ の暴 露 時 間 は 任 意 の時 間 で よ い こ とが示 され た(Fig. 1). RPMI1640+10%FCS中 の 各 薬 剤 のAUC量 は,暴 露 倍 地 中 の 薬 剤 濃 度 ×暴 露 時 間(台 形 法) で 求 め る こ とが 可 能 で あ る12).今 回 の 実 験 で4薬 剤 の 暴 露 倍 地 中 に お け る濃 度 変 化 に つ い て み る と,臨 床 投 与 時 の よ うな 急 激 な薬 剤 の 消 失傾 向 は み られ ず22∼24),暴露 後72時 間 経 過 し た 時 点 に お い て も4薬 剤 す べ て が 検 出 さ れ た.と くにCDDP の 薬 剤 暴 露 倍 地 中 の 薬 物 動 態 は 投 与 後3時 間 で free Pt.が 消失 す る臨 床 薬 物 動 態25)とま った く異 な って いた.こ の 理 由 と して 薬 剤 暴 露 倍 地 中 の蛋 白 濃 度 が0.9g/dlと 低 値 で あ る た めCDDPの free Pt.が 倍地 中 に長 時 間残 存 した も の と考 え ら れ た.こ の こ と か らみ て も,暴 露 倍 地 中 で は生 体 内 と比 べ て 抗 癌 剤 の薬 物 動 態 に著 し い相 違 が存 在 して い る こ とが 明 らか と な った. 一 方,in vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 の 再 現 性 や 成 功 率 を 高 め るた め に 使 用 す る培 養 株 の選 択 も重 要 な 点 で あ る.今 回 の 実 験 で はPC-9とPC-14を 使 用 した が,こ の培 養 株 は 技 術 的 にsingle-cell sus-pensionと す る こ とが 容 易 で あ り,コ ロニ ー形 成 能 や 感 受 性 試 験 の 再 現 性 も高 く,有 用 な 培 養 株 と 考 え られ た26). 各 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 で50%抑 制 率 を 示 す 各 薬 剤 のAUC (AUCIC50)と 臨 床 使 用 時 のAUC (AUCCLIN.)の 比 較 で は,C-MTTか ら算 出 され た 各 薬 剤 のAUCIC50はAUCCLIN.と 比 べ てCDDPは 26.8倍 か ら29.4倍,CBDCAは9.4倍 か ら11.7 倍,ADMは33.0か ら33.4倍 と な り,と く に MMCは202.7倍 か ら333.3倍 と非 常 に 高 値 と な った.ま た,今 回 用 い た培 養株 別 のAUCIC50も AUCCLIN.と 比 べ てPC-9は101.1倍,PC-14は 68.7倍 と な っ て い た.一 方,暴 露 薬 剤 の 洗 浄 と追 加 培 養 を 加 え たM-MTTに お け る 各 薬 剤 の AUCIC50はAUCCLIN.の4.1倍 か ら47.9倍 に ま で 低 下 した.さ ら にHTCAよ り得 られ たAUCIC50 は,4薬 剤 と も ほ ぼAUCCLIN.の 約0.04倍 か ら 0.68倍 で50%抑 制 が得 られ て い た. この 各 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 に お け るAUCIC50の 相 違 の 原 因 を み るた め に,薬 剤 洗 浄 後 の追 加 培 養 の 影 響 に つ い て 検 討 した.暴 露 時 間 を洗 浄 した後 の 追 加 培 養 に よ り,IC80値 の低 下 が追 加 培 養 時 間 の 延 長 に 伴 って 認 め られ た(Table 2).ま た,IC80 の 変 化 を 解 明 す るた め に薬 剤 暴 露 後 の追 加 培 養 中 の 細 胞 数 変 化 をDye exclusion法13)で み る と,追 加 培養 時 間 が72時 間 まで の 間 は 薬 剤 処 理 後 の 癌 細 胞 に は コン トロー ル群 に見 られ た よ うな対 数 増 殖 過 程 は見 られ ず,非 増 殖 期 に入 っ て い る こ とが 判 明 した.さ らに4薬 剤 と も死 細 胞 数 の経 時的 変 化 は薬 剤 処 理 群 と コン トロー ル群 間で は ほ とん ど 相 違 はみ られ ず,今 回 の実 験 で用 い た薬 剤 量 で は こ のIC80値 低 下 の 原 因 と し てdividing cell deathは 関与 して い な い もの と考 え られ た(Fig. 2).し た が って,こ れ らの 実 験 結 果 よ り,C-MTT で は感 受 性 試 験 に お け るすべ て の 生細 胞(増 殖 能 を有 す る細 胞 な らび に生 き残 って い て も増 殖 能 を 持 って い な い細 胞)を ま とめ て測 定 して い る と思 わ れ,こ の た め に 臨 床使 用 時 と比 べ て極 端 に 高 い AUC量 が 必要 に な った と考 え られ た.つ ま り,暴 露 薬 剤 を 洗 浄 した 後 に 行 うM-MTTで は 増 殖 能 を 有 す る生 細胞 を よ り選 択 的 に検 討 して い る と推 察 され た. これ らの こ とか ら臨 床 効 果 の 予 測 を 目的 と した 抗 癌 剤 感 受 性 試 験 でC-MTTを 用 い る場 合 に は, そ の カ ッ トオ フ値(抗 癌 剤 の 殺 細 胞性 を 決 定 す る 境 界 濃 度)の 薬 剤 量 が 非 常 に 高 値 にな る もの と判 断 され る.こ の カッ トオ フ値 は,多 く症 例 のC-MTTの 結 果 と臨 床 効 果 の 相 関 に よっ て決 め られ た 値 で あ り,臨 床 効 果 を 予 測 す る こ とにつ い て は 科 学 的 根 拠 が あ る と言 え る.し か しなが ら,こ の カ ッ トオ フ値 は 薬 剤 量 か ら設 定 さ れ た 値 で は な く,例 えば 便 宜 的 に 最 大 血 中 濃 度 の10倍 を指 標 と す る設 定 根 拠 は不 適 切 な もの で あ る と考 え ら れ る.し か もC-MTTは,1)薬 剤 暴 露 時 間 が 長 く, 薬 剤 暴 露 倍 地 中 の薬 剤 量 を測 定 す る こ とが 容 易 で
な い た め 抗 癌 剤 のAUC量 と細 胞 障 害 の相 関 関 係 を 把握 しに く く,2)臨 床 使 用 時 の 薬 剤 量 よ り非 常 に 高 い 薬 剤 量 で 判 定 して い るな どの 問題 点 が 存 在 して い る. 新 しい 抗 癌 剤 の ス ク リー ニ ング な ど癌 化 学 療 法 の 基礎 的 研 究 手 段 と して の抗 癌 剤 感 受 性 試 験 に お い て,薬 剤 量 は μg/ml, μM/mlな どの単 位 で表 わ され て い る26,27).しか し な が ら,今 回検 討 した AUC依 存 性 薬 剤 に お い て この 様 な薬 剤 濃 度 を 基 準 と した 従 来 か らの 検 討 法 で はAUC依 存 性 薬 剤 を扱 う場 合 に は 正 当 性 が な い と思 わ れ る. 今後 のin vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 に求 め られ る こ とは,1)抗 癌 剤 のAUC量 と細 胞 障 害 性 が 定 量 的 か つ,2)臨 床 使 用 時 の 薬 剤 量 に近 い値 で,そ の 抗 癌 剤 の細 胞 障 害 性 が 判 定 可 能 な こ とが 重 要 な点 と考 え ら れ る.こ れ らの 結 果 か らHTCAとM-MTTは 完 全 で は な い が両 条 件 を 備 え て お り,よ り臨 床 に近 いAUC量 と細 胞 障 害 性 の 相 関 を定 量 的 に判 定 す る こ とが可 能 で あ り,有 用 な抗 癌 剤 感 受 性 試 験 と思 わ れた. 結 論 これ まで のin vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 で は,臨 床 で 用 い られ る薬 用 量 に お け る薬 剤 の 血 中 動 態 か ら算 出 され る薬 剤 量 と,in vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 に お け る薬 剤 量 との 相 関 に つ い て 検 討 した 報 告 は な か った. 今 回,CDDP, CBDCA, ADM, MMCの4薬 剤 がAUC (Area Under the Curve)依 存 性 か 否 か を 検 討 し た.次 ぎ にMosmannら のMTT assay (C-MTT),暴 露 薬 剤 を洗 浄 した後 に追 加培 養 を行 うMTT assay (M-MTT)お よびHTCA (Human Tumor Clonogenic Assay)で,50%抑 制 率 を 得 るた め のAUC量 と臨 床 使 用 時 のAUC 量 とを比 較 す る こ とに よ っ て,ど の抗 癌 剤 感 受 性 試 験 が 臨 床 に近 い も の か を検 討 した. 1) log〔IC50〕-log〔 暴 露 時 間〕 カ ー ブ の解 析 よ りCDDP, CBDCA, ADMお よ びMMCは す べ て AUC依 存 性 薬 剤 で あ る こ とが 判 明 した .AUC依 存 性 薬剤 で あ る限 り,そ の 細 胞 障 害 性 は これ まで の よ うな薬 剤 濃 度 に よ らず,AUCに よ って 規 定 され るべ き もの と判 断 され た. 2) そ れ ぞ れ の抗 癌 剤 感 受 性 試 験 で50%抑 制 を 得 る た め の 各 薬 剤 のAUC量 と 臨 床 使 用 時 の AUC量 を 比 較 した と こ ろ,HTCAとM-MTTが 臨 床 に近 い結 果 が 得 られ た もの の,C-MTTで は 臨 床 時 と比 べ て 著 し く高 値 のAUC量 を 必 要 と し た. 3) Dye exclusion法 に よ る検 討 か ら,C-MTT で は 薬 剤 処 理 後 に増 殖 能 が失 わ れ て い る細 胞 も含 め て 測 定 して い るた め,M-MTTと 比 べ てAUC 量 が 高 くな る と推 測 され,暴 露 薬 剤 の洗 浄 と追 加 培 養 の導 入 に よ り増 殖 能 を 有 す る生 細 胞 の み に つ い て よ り選 択 的 な検 討 が 可 能 に な った と考 え られ た. AUC依 存 性 薬 剤 で は,新 し い 抗 癌 剤 の ス ク リー ニ ン グ な ど癌 化 学 療 法 の 研 究 手 段 と してin vitro抗 癌 剤 感 受 性 試 験 を 行 う場 合,C-MTTで 得 られ た 結 果 は生 体 内 の 薬 物 動 態 と比 べ て大 き な相 違 が み られ,よ り臨 床 に近 いAUC量 と細 胞 障 害 性 を 定 量 的 に 検 討 し得 るHTCAやC-MTTが 適 して い る と考 え られ た. 本稿 を終えるにあた り御指導,御 校 閲を賜 りました本学 内科学第4教 室仁井谷久暢主任教授に深謝 いた します とと もに,小 林国彦博士,青 山昭徳講師,林 原賢治先生,和 才 さつ き女史および教室の諸兄 に深甚の謝意を表 す. なお,本 論文の要 旨は,第28回,第29回 日本癌治療学 会(平 成2年10月,平 成3年10月),第24回 制癌剤適応 研究会(平 成3年3月)お よび第50回 日本癌学会(平 成3 年9月)に て発表 した. また,薬 剤を提供 していただいた 日本化薬株式会社,協 和発酵工業株式会社およびプ リス トル ・マイヤーズ株式会 社 と実験 の協力をしていただいた諏訪正人博士,菊 地 孚 博士,日 吉千浪博士および武本宣教博士 に深謝 します. 文 献
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