氏 名・（本籍） 齊
さい
藤
とう
由紀子
ゆ き こ
（秋田県）
専 攻 分 野 の 名 称 博士（医学）
学 位 記 番 号 医博甲第 857 号 学 位 授 与 の 日 付 平成 26 年 3 月 22 日
学 位 授 与 の 要 件 学位規則第 4 条第 1 項該当 研 究 科 ・ 専 攻 医学系研究科医学専攻
学 位 論 文 題 名 The effect of pharmacological PI3Kγ inhibitor on eotaxin-induced human eosinophil functions
（eotaxin によって誘導されたヒト好酸球機能における PI3Kγ阻害薬の影響）
論 文 審 査 委 員 （主査） 教授 佐々木 雄 彦
（副査） 教授 石 川 和 夫 教授 柴 田 浩 行
Akita University
学 位 論 文 内 容 要 旨
The effect of pharmacological PI3K inhibitor on eotaxin-induced human eosinophil functions
（eotaxin
に よ っ て 誘 導 さ れ た ヒ ト 好 酸 球 機 能 に お け るPI3K
阻 害 薬 の 影 響 ）申 請 者 氏 名 齊 藤 由 紀 子
研 究 目 的
喘 息 は Th2リ ン パ 球 と 好 酸 球 を 含 む 炎 症 細 胞 の 活 性 化 を 原 因 と す る 慢 性 の 気 道 炎 症 が 特 徴 で あ る 。以 前 我 々 は Phosphoinositide 3-kinase(PI3K)ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス を 用 い て 喘 息 の 病 態 に お け る PI3Kの 役 割 を 検 討 し 、PI3Kノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は 好 酸 球 性 気 道 炎 症 、 気 道 過 敏 性 亢 進 、 気 道 リ モ デ リ ン グ 形 成 が 抑 制 さ れ る こ と を 報 告 し た 。PI3Kノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス で は 気 道 へ の 好 酸 球 集 積 が 起 こ ら ず 、PI3Kが 好 酸 球 機 能 に 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ る 。 し か し 、 好 酸 球 細 胞 機 能 に お け る PI3Kの 役 割 に つ い て そ の 詳 細 な メ カ ニ ズ ム は よ く 分 か っ て い な い 。PI3Kは G Protein Coupled Receptor(GPCR)の 下 流 に 存 在 す る シ グ ナ ル で GPCR 刺 激 に よ り 活 性 化 さ れ 、好 中 球 を は じ め と し た 炎 症 細 胞 の 遊 走 に 関 わ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 CC ケ モ カ イ ン Eotaxin（CCL11） は GPCR で あ る CCR3 を 介 し て 好 酸 球 の 遊 走 ・ 接 着 ・ 脱 顆 粒 な ど の 細 胞 機 能 に 影 響 を 及 ぼ す こ と が 知 ら れ て い る 。 今 回 の 研 究 で は ヒ ト 好 酸 球 の 細 胞 機 能 に お け る PI3Kの 関 わ り を 明 ら か に す る た め に 、PI3K選 択 的 阻 害 薬 を 用 い て Eotaxin に よ り 誘 導 さ れ た 好 酸 球 機 能 に お け る PI3Kの 役 割 を 検 討 し た 。
研 究 方 法
ヒ ト 末 梢 血 か ら CD16 negative selection 法 に よ り 高 純 度 分 離 し た 好 酸 球 を 用 い 、Eotaxin に よ り 誘 導 さ れ た 接 着 能 、遊 走 能 の 亢 進 な ら び に 脱 顆 粒 に お け る PI3K選 択 的 阻 害 薬 AS605240 の 影 響 を 検 討 し た 。 好 酸 球 は Eotaxin 刺 激 す る 前 に AS605240 で 37℃ 下 1 時 間 の 前 処 理 を 行 っ た 。好 酸 球 接 着 能 は ICAM-1 coating plate を 用 い て 10nM Eotaxin で 45分 間 刺 激 し 、ICAM-1 coating plate へ 接 着 し た 好 酸 球 数 を 計 測 し た 。 遊 走 能 へ の 影 響 に つ い て は Boyden chamber 法 を 用 い て 10nMの Eotaxin に 対 し て 遊 走 し た 好 酸 球 数 を カ ウ ン ト し 、検 討 し た 。脱 顆 粒 は 20n M Eotaxin で 4時 間 好 酸 球 を 培 養 し 、 そ の 上 清 中 の EDN 濃 度 を ELISA法 を 用 い て 測 定 し た 。 加 え て 受 容 体 発 現 な ら び に シ グ ナ ル 経 路 へ の 影 響 を 調 べ る た め に 、CCR3発 現 と ERK1/2 の リ ン 酸 化 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い て 検 討 し た 。 ま た 、 好 酸 球 生 存 へ の PI3K選 択 的 阻 害
薬 の 影 響 に つ い て も フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い て 検 討 し た 。生 存 能 で は Pan-PI3K 阻 害 薬 で あ る LY294002も 用 い て PI3K選 択 的 阻 害 薬 AS605240 と の 相 違 を 24 時 間 後 、48時 間 後 の 生 存 能 に つ い て 検 討 し た 。
研 究 成 績
ICAM-1 coating plate を 用 い た 好 酸 球 接 着 能 の 検 討 で は 好 酸 球 は AS605240 10- 8M、10- 7M の 濃 度 で Eotaxin に よ り 誘 導 さ れ た 接 着 を 有 意 に 抑 制 す る こ と が 観 察 さ れ た 。 ま た 、Boyden chamber 法 に よ る 好 酸 球 遊 走 能 の 検 討 で は AS605240 10- 7M の 濃 度 に お い て Eotaxinに よ り 亢 進 し て い た 細 胞 遊 走 が 抑 制 さ れ た 。 さ ら に 、Eotaxin に よ り 誘 導 さ れ た 好 酸 球 EDN 産 生 が AS605240 10- 7M で 減 少 し 、 脱 顆 粒 を 抑 制 す る こ と が 観 察 さ れ た 。
次 に 、観 察 さ れ た 好 酸 球 細 胞 機 能 抑 制 の メ カ ニ ズ ム を 検 討 す べ く CCR3発 現 変 化 、ERK1/2 リ ン 酸 化 へ の 影 響 を 検 討 し た 。そ の 結 果AS605240はCCR3発 現 に は 影 響 を 与 え な か っ た が 、 ERK1/2 リ ン 酸 化 を 抑 制 し た 。
好 酸 球 の 生 存 能 に 対 す る PI3K 阻 害 薬 の 影 響 に つ い て 時 間 依 存 性 を 見 る と 、LY294002 は 10- 5M で 24 時 間 、48時 間 に お い て 好 酸 球 の 生 存 を 有 意 に 減 少 さ せ た が 、AS605240は 影 響 を 及 ぼ さ な か っ た 。ま た AS605240の 濃 度 依 存 性 に つ い て も 検 討 し た が 、AS605240は10- 9、10- 8、 10- 7Mい ず れ の 濃 度 に お い て も 生 存 に 影 響 を 与 え な か っ た 。
結 論
好 酸 球 の 局 所 に お け る 接 着 ・ 遊 走 ・ 脱 顆 粒 は 喘 息 を は じ め と し た ア レ ル ギ ー 疾 患 の 病 態 形 成 に 深 く 関 連 し て お り 、Eotaxin は こ れ ら の 好 酸 球 機 能 発 現 を 増 強 さ せ る 重 要 な 役 割 を 果 た す 。 今 回 の 検 討 か ら 、PI3K選 択 的 阻 害 薬 はCCR3下 流 のERK1/2の リ ン 酸 化 抑 制 を 介 し て 、Eotaxin に よ り 誘 導 さ れ た 接 着 ・遊 走・ 脱 顆 粒 を 抑 制 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。ま た 、Pan-PI3K阻 害 薬 を 用 い た 細 胞 生 存 の 実 験 か ら は PI3Kの す べ て のisoformを 阻 害 す る こ と は 生 体 へ の 有 害 な 影 響 を 引 き 起 こ す 事 が 考 え ら れ る 。事 実 、PI3Kα、β の ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は 胎 生 致 死 す る 事 が 報 告 さ れ て い る 。 そ の た め 疾 患 の 治 療 応 用 を 考 え た と き 、PI3K の isoform を 阻 害 す る 薬 剤 の 効 果 が 期 待 さ れ て い る 。PI3Kノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス が 正 常 に 発 育 す る 事 、 ま た ヒ ト に お い て も 今 回 の 検 討 で PI3Kを 選 択 的 に 阻 害 す る こ と は 生 体 へ の 影 響 を 考 え た 際 、 有 用 で あ る と 考 え ら れ る 。
以 上 よ り PI3Kを 選 択 的 に 阻 害 す る こ と は 喘 息 を は じ め と し た 好 酸 球 が 病 態 形 成 に 関 わ る 疾 患 の 治 療 に 対 し て 重 要 な タ ー ゲ ッ ト と な る こ と が 示 唆 さ れ た 。
Akita University
学位（博士－甲）論文審査結果の要旨
主 査：佐々木 雄彦 申請者：齊藤 由紀子
論文題名：
The effect of pharmacological PI3Kγ inhibitor on eotaxin-induced human eosinophil function
（eotaxin
により誘導されたヒト好酸球機能におけるPI3Kγ
阻害薬の影響）要旨
Phosphoinositide 3-kinase(PI3K)γ
はGTP
結合タンパク質共役型受容体（G protein-coupled receptor
/GPCR
)の刺激に伴い活性化され、好中球をはじめとした炎 症細胞の遊走に関わる。著者の研究は論文内容要旨に示すように、ヒト好酸球の細 胞機能におけるPI3Kγ
の役割を明らかにするものである。PI3Kγ
選択的阻害薬を用 いて、GPCR
であるCCR3
を介して好酸球の遊走・接着・脱顆粒などの細胞機能に 影響を及ぼすことが知られているeotaxin
（CCL11
）により誘導された好酸球機能における
PI3Kγ
の役割を解明している。本論文の斬新さ、重要性、研究方法の正確性、表現の明確さは以下の通りである。
１）斬新さ
喘息は
Th2
リンパ球と好酸球を含む炎症細胞の活性化に起因する慢性の気道炎 症が特徴である。先行研究で、PI3Kγ
ノックアウトマウスが好酸球性気道炎症、気 道過敏性亢進、気道リモデリング形成に抵抗性であることが明らかになっていた。しかし、ヒト好酸球の細胞機能における
PI3Kγ
の役割については不明であった。本 研究の斬新さはヒト好酸球の細胞機能におけるPI3Kγ
の関わりを明らかにするために、
PI3Kγ
選択的阻害薬を用いてEotaxin
により誘導される多様な好酸球機能を解析し、これらにおける
PI3Kγ
の役割を直接的に検討したことにある。２）重要性
著者の研究により、
PI3Kγ
選択的阻害薬はCCR3
下流のERK1/2
のリン酸化抑制 を介して、Eotaxin
により誘導されたヒト好酸球の接着・遊走・脱顆粒を抑制する ことが示された。好酸球は喘息をはじめとしたアレルギー疾患の病態形成に重要な 役割を果たすことが知られており、以上の結果はアレルギー疾患におけるPI3Kγ
の 重要な役割を実証したものと考えられる。また、臨床上問題になるステロイド抵抗 性の難治性喘息患者に対する新たな治療選択肢としてPI3Kγ
選択的阻害薬の可能性 を考える上でも有用であると考えられる。３）研究方法の正確性
ヒト好酸球は末梢血から
CD16 negative selection
法により高純度分離した好酸球を 用いて行っている。各種好酸球機能の検討法についてはすでに著者らのグループが 開発し、報告した方法を用いており、接着はICAM-1 coated plate
法、遊走Boyden
chamber
法、脱顆粒はELISA
法、受容体発現、シグナル、生存についてはフローサイトメーターを用いて検討している。いずれも統計学的検討を加えており、客観的 な評価法で、正確性があると考えられる。
４）表現の明確さ
ヒト好酸球の細胞機能における
PI3Kγ
の関わりを明らかにするための研究目的、方法、実験結果、考察を簡潔、明瞭に記載していると考える。
以上述べたように、本論文は学位を授与するに十分値する研究と判定された。
