虚血性脳障害とミトコンドリア機能不全

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(1)● シンポジウム 12 脳救急医学と脊髄・新生児脳障害. 虚血性脳障害とミトコンドリア機能不全内野博之＊，原直美，石田裕介，長島史明，西山遼太鎌田早紀，小平亜美，白澤一弘，荻原幸彦. 要旨心肺蘇生後に起こってくる心停止後症候群を如何に軽減させるか，それは早期から積極的に脳保護を念頭に置いた治療を行い，脳機能不全までの段階で負のカスケードを阻止して機能改善を図っていくことである．心肺蘇生時の救命救急処置法の改善および脳梗塞時の血流改善治療法の進歩および脳指向型集中管理法の併用により，神経機能回復に光明を見出すことができるようになってきたが，人の脳は，予備力が少なく，虚血侵襲に対しての防御機構を兼ね備えていない．また，神経細胞障害のメカニズムは複雑かつ多要素で，治療に対する therapeutic window が極めて短く，脳機能不全から患者を完全に回復させ，社会復帰させることができる状況とは言い難く現在も社会復帰率の向上を目指した努力が続けられている．さらに，脳保護のためには，脳障害を誘発するメカニズムの解析が重要となるが，中でも，ミトコンドリア機能不全に焦点を当てた解析と創薬は蘇生後脳症の治療と脳保護において重要な役割を担うものと思われる．本稿では，心停止後症候群について触れ，これらの要因となる虚血性神経細胞死のメカニズムを紹介し，細胞死誘発に深く関わるミトコンドリア機能不全とカルシニューリン・イムノフィリン情報伝達系の重要性を概説した．（脳循環代謝 26：155∼161，2015）. キーワード : 心停止後症候群，脳障害，ミトコンドリア機能不全，MPT，脳保護. これまで，心肺蘇生後自己心拍が再開した状態は，. 1．心停止後症候群とは（図 1）. 蘇生後病と呼ばれていた．国際蘇生連絡協議会（The lnternational Liaison Committeeon Resuscitation; ILCOR）. 心停止後に誘発される脳障害から脳を護るために. は，米国心臓学会（American Heart Association; AHA）な. は，心停止に伴う蘇生および脳梗塞や頭部外傷に伴う. どの団体と合同で，この蘇生後病などと称されていた. 急性期の治療の開始から脳機能回復までを念頭におい. 状態を総称し，心停止後症候群（Post-Cardiac Arrest. た治療法として Safer らによって提唱された脳指向型. Syndrome; PCAS）と定義した2）．心停止後症候群は，時. 集中管理法1）によって心停止後の頭蓋外臓器の機能を. 相により 4 段階に分類できる（図 1）．本邦における院. 脳に有利になるような方法で管理し，かつ頭蓋内の恒. 外心停止患者は，毎年 10 万人発生している3）．また，. 常性を維持することの重要性が提唱されてきた．これ. 横田らは，総務省のウツタインスタイル集計から，心. は血流再開後の脳障害の発症を抑え，できるだけ脳の. 停止患者の 1 カ月後の生存率は 8.5％で，除細動を. 機能を損なわないようにすることをその主目的として. 行った場合は，32.1％となり，脳低体温療法を施行し. いる．その一方で，現状では心停止後の心拍再開に伴. た場合転帰良好な症例は 24.4％になると報告してい. う虚血性脳神経細胞障害から脳を完全に保護し，すべ. る3）．心停止の主要原疾患のおよそ 40％が急性冠症候. ての患者を社会復帰させることができる状況には至っ. 群，20％がその他の心臓性疾患であり，院外心停止患. ていない．. 者の 50∼60％は心臓性の心停止患者である．SOS-. 東京医科大学麻酔科学分野＊〒 160-0023 東京都新宿区西新宿 6-7-1 E-mail: [email protected]. KANTO での報告によると4），院外心臓性心停止成人患者における自己心拍再開率は 29％で，その社会復帰率は 10％であり，この大部分は病院到着時に，標準的 ─ 155 ─.

(2) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. 心停止後症候群の病態ᴾ 図1 心停止後脳損傷. 心停止後症候群. 残存する心停止の原病. 心停止後心筋不全. 心肺蘇生㻌全身性虚血・再灌流障害図 1．蘇生後症候群とは時相により 4 段階に分類できる．第 1 段階：心筋機能不全，第 2 段階：脳機能不全，第 3 段階：全身性再灌流障害，第 4 段階：残存する心停止の原病の治療および敗血症と類似した病態への対応である．. CPR や自動体外式除細動器（Automated External Defi-. 能不全や血液凝固障害が顕在化する．その程度は心停. brillator; AED）などにて，すでに自己心拍が再開して. 止中の虚血時間，心拍再開後の臓器血流および心停止. いた患者であった．すなわち，病院到着時に自己心拍. 前のおのおのの臓器の状態などが複雑に絡み合って出. が再開していない患者の社会復帰率は，極めて不良で. 現してくる．. ある．. D．第 4 段階：残存する心停止の原病の治療および. A．第 1 段階：心筋機能不全. 敗血症と類似した病態への対応. 心拍再開後 24 時間以内はさまざまな心筋機能不全. 残存する心停止の原因疾患の治療の重要性も指摘さ. が出現し，その多くが心拍再開後 24 時間以内に再度. れている．早期の冠動脈造影による生命予後への有益. 心停止に陥り死亡する．SOS-KANTO 研究では，全. 性も指摘されている．. 心拍再開例の 64％が心筋機能不全で死亡していた．. また，心停止という生体最大侵襲時には免疫制御系. B．第 2 段階：脳機能不全. も障害される．同時に，虚血に最も鋭敏で脆弱な消化. 心拍再開後の心筋機能不全死を免れても脳機能不全. 管ではその粘膜透過性が充進する．この透過性充進. が遷延する．この神経学的予後予測は，心拍再開後 3. （好中球，有害酵素，サイトカイン，フリーラジカル. 日以内は困難である．神経学的転帰が不良となる予測. などが関与）は，腸内細菌が血中に侵入していく易感. 4）. 因子として，常温管理下では① 24 時間後の角膜反射. 染性を助長させる．心停止後症候群により心停止後自. 消失，② 24 時間後の瞳孔反応消失，③ 24 時間後の疹. 己心拍が再開しても，その大多数の患者は不幸な転帰. 痛刺激に対する逃避反射消失，④ 24 時間後または 72. （死亡，植物状態，重度障害：SOS-KANTO 研究4）で. 時間後の運動反応消失，⑤ 72 時間後の正中神経体性. は，93％が不幸な転帰）をとっていた．PCAS は敗血症. 感覚誘発電位の反応が両側とも消失などが報告されて. と似た症状を呈することがある．. いる．. 「脳を蘇生させる」ことは，まず，脳への血流をでき. C．第 3 段階：全身性再灌流障害. るだけ早く再開させることに始まり，脳機能不全まで. 心拍再開後の心筋機能不全から回復しても，全身性. の段階で蘇生後症候群をいかに進展させないかがポイ. 再灌流に伴う肺・肝・膵・腎・消化管などの多臓器機. ントとなる．そのためには神経細胞死誘発機構の解明. ─ 156 ─.

(3) 虚血性脳障害とミトコンドリア機能不全. 虚血性脊髄神経細胞死誘発のメカニズムと神経保護薬の作用部位. 虚血中㻌. 虚血（低酸素および術後のモルヒネ投与）. Pre-synaptic. グルタミン酸放出 Ca2+ channel blocker. AMPA mGLU. 細胞内. Ca2+. 蛋白リン酸化. PAF TXA2. ロイコロリエン. 7;$特異的阻害剤、抗体. NMDA. VSCC. [Ca2+] i. Ca2+. 脂肪分解(DAG). Activated Glia cell. アデノシン. Antagonist. 受容体およびイオンチャンネルの変化. Increased Calcium cycling. 膜および血管系の機能低下. 虚血後（再灌流）. Na+channel riluzole NOS 阻害薬. Ca2+ Lubeluzole. 蛋白分解. 酵素の活性化 (NOS,PKC,Calcineurin) Conversion(XDH XO) 遺伝子発現および蛋白合成. 微小血管の閉塞. Post-synaptic. iNOS サイトカイン. 細胞骨格の破壊. フリーラジカル軸索輸送の障害の産生. フリーラジカルの産生. Ca2+ overload. 細胞死誘導蛋白の発現自殺プログラムの発現 Cell death. Trilazad minocycline. 細胞膜の破裂. Trilazad minocycline. 特異的阻害剤、抗体. ガングリオシドシチコリン. Cell death. 図２. 微小血管の機能低下. 接着分子、血小板凝集マクロファージの活性化 . 図 2．虚血性細胞死が誘発されるカスケードグルタミン酸–Ca2+ 仮説によって作られた代表的な細胞内情報伝達機構の図を示した．虚血に伴いグルタミン酸が細胞外に放出され，細胞内 Ca2+ が増加し，2 次的にさまざまなカスケードが動いて細胞死へと至る．虚血中脳血流はほぼゼロとなり血流再開とともに一過性に充血（Hyperemia）の状態となり，やがて血流低下が起こり細胞死が誘発される．. が待たれる．. 2．虚血性脳神経細胞死誘発のメカニズム（グルタミン酸－ Ca2+ 説に基づく神経細胞死）（図 2）. 脳神経細胞死のメカニズムは長年に亘る神経科学分野の課題である．これまでは，グルタミン酸–Ca2+ 仮説がその中核をなすと考えられてきた．近年，免疫抑制剤の脳保護作用からカルシニューリンとミトコンドリア内に存在するイムノフィリンが重要な役割を担っ. 前に述べた脳虚血に伴う脳内での好気的な反応の停. ていることが判明した．イムノフィリンはミトコンド. 止は ATP を ADP+Pi に変換させてエネルギー基質の. リア内膜に MPT（Mitochondrial Permeability Transition）. 喪失反応を惹起し5），嫌気的な反応を促進させ細胞内. と呼ばれる現象を誘発し，ミトコンドリア機能不全を. の乳酸と H+ 濃度を上昇させ，脳内アシドーシスへと. 惹起する．本稿では脳虚血のなかでも我々が通常の麻. 至る．さらには ATP 依存性の ion homeostasis を喪失. 酔業務に従事する際に遭遇する可能性の高い，「心停. させるため，細胞外の K + の増加と細胞内へ Na + の増. 止」を想定したラットの前脳虚血モデルで得られた結. 加を生じるため細胞は脱分極を起こす．その結果，電. 果を中心に，脳蘇生における虚血性神経細胞死のメカ. 位依存性の Ca2+channel（Voltage-dependent calcium chan-. ニズムについて分子生物学的な観点から捉え，脳保護. nels: VDCC）を介した Ca2+ の流入が起こり，シナプス. におけるミトコンドリア機能不全の重要性について概. 前部より細胞外腔への過剰なグルタミン酸放出を誘発. 略を述べる．. し，過剰なグルタミン酸は細胞膜上の受容体（NMDA: N-methyl-D-aspartate, AMPA: alfa-amino-3-hydroxy5-methyl-4-isoxazolepropionic acid あるいは代謝型受容 ─ 157 ─.

(4) 細胞内脱リン酸化酵素の役割およびミトコンドリア機能不全とは脳循環代謝第 26 巻第 2 号. 図３. Ischemia, Hypoxia, TBI 敗血症、麻酔薬. 虚血・低酸素がミトコンドリアに及ぼす影響. [Ca2+]i↑. VDAC ANT Cyclophilin D Cytochrome c. ストレス：Caspase, Free Radical, PLA2, [Ca2+]i↑. PBad/BclXL P P Bad BclXL. VDAC/ANT. Mitochondria. Bad. Bcl-2 Bax. Calcineurin. Cyclosporin A FK506. DYm. MPT pore opening. CsA. Bax. Bcl-2. Caspase. Necrosis or Apoptosis. mtROS production. Cytochrome c Caspase independent pathway. ATP. ミトコンドリア機能不全. AIF. 図 3．細胞内脱リン酸化酵素の役割およびミトコンドリア機能不全とは虚血による細胞内 Ca2+ 上昇に伴うカルシニューリン活性化と MPT pore の開孔に伴うミトコンドリア機能不全の誘発により細胞は apoptosis や necrosis になる．. 体）と結合して細胞内への持続的な Ca2+ 流入を惹起す. 脂質の機能を障害して透過性の変化を誘発し，持続的. る6）．細胞内 Ca2+ 濃度（［Ca2+］i）の上昇は Ca2+ 依存性の. な［Ca2+］i 増加を作り出すのではないかという説もある. 酵素の活性化（NOS, PLA2, CaMKinase 等），膜構成成. が結論には至っていない．持続的な［Ca2+］i 増加を緩衝. 分の脂質の障害，ROS の産生，ミトコンドリア呼吸鎖. するためにミトコンドリアは Ca2+ を取り込むが，結果. の傷害と ATP 産生産生不全という過程を引き起こ. として , ミトコンドリア膜電位（Δψm）の低下および. し，急性あるいは遅発性の神経細胞死が誘発されると. ATP 産生低下を招来し，ミトコンドリア機能不全から. 考えるグルタミン酸–Ca2+ 説が支持されてきた．近. MPT （Mitochondrial Permeability Transition: ミトコンド. 年，心臓や肝臓を用いた再灌流傷害誘発機構の解析. リア内膜透過性亢進）が誘発される．MPT の程度によ. 結果から，ミトコンドリア機能不全が細胞死の中核を. りアポトーシス誘発因子を放出，ミトコンドリアの膨. なす可能性が強く示唆され，脚光を浴びはじめて. 化へと伸展し，アポトーシスおよびネクローシスに至. いる. る可能性が指摘された11, 12）．. ．. 7, 8）. 3．虚血再灌流に伴う脳内 Ca2+ の変動とミトコンドリア機能不全. 4．免疫抑制剤の抗虚血作用からみた虚血性神経細胞死のメカニズム（カルシニューリン/イムノフィリン情報伝達系の細胞死への関与）（図 3）. 虚血に陥った臓器に血流が再開された状況を再灌流（reperfusion）と呼ぶ．遅発性神経細胞死や no-reflow 現象の誘発に関与すると考えられている．虚血再灌流に. 免疫抑制剤の抗虚血作用が注目されはじめたのは. 伴う酸素供給は同時に ROS: Reactive Oxygen Species. Sharky らが 1994 年に FK506 の梗塞縮小作用を報告し. （活性酸素種：O2･（酸素ラジカル），･OH （ハイドロキ. たことに端を発する13）．著者は翌年に CsA の前脳虚血. シラジカル），H2O2 や RNS（Reactive Nitrogen Species）. に対する抗虚血作用を報告した14）．CsA は前脳虚血モ. の発生を生じる（図 3）．神経細胞が虚血により細胞死. デルにおいて劇的な脳保護作用を発現するが，FK506. に陥る過程においては，細胞内カルシウムイオン濃度. は強い脳保護作用を示さないことも明らかとなっ. ［Ca ］i の上昇（Ca overload）が深く関わると考えられ. た14）．両薬剤はカルシニューリンを共通の標的として. る9, 10）．脳虚血中および虚血再灌流直後は［Ca2+］ i 上昇. いるが，CsA はミトコンドリアに特異的に発現するイ. を伴う．［Ca2+］i 増加に伴って惹起される PLA2 や Free. ムノフィリンの CyclophilinD を制御する作用を有して. radical が受容体やイオンチャンネルの構成蛋白やリン. いることが判明し14），この作用が両薬剤の脳保護効果. 2+. 2+. ─ 158 ─.

(5) 図４. MPTを抑制する可能性のある薬剤にスクリーニングを行った結果の虚血性脳障害とミトコンドリア機能不全まとめ. (Morota et.al 2009) 図 4．MPT を抑制する可能性のある薬剤にスクリーニングを行った結果のまとめ Ca2+ retention capacity と MPT を抑制できる特性を有する薬物が脳保護作用を発現できる可能性がある．図では Debio 025 がそれに該当する．. の違いとして現れたものと考えられる．これらの実験. 6．21 世紀における神経麻酔・集中治療のあり方と神経再生への展望（図 5）. 結果から，虚血後の脳内においてはカルシニューリンとイムノフィリン（CyclophilinD）という全く異なる機能活性を持つ分子作用が複雑に絡み合ってアポトーシスやネクローシス制御に重要な役割を果たしているこ. 21 世紀の脳保護と薬物療法のありかたを示した．ま. とが明らかとなり，これらの制御システムがミトコン. ず，迅速な蘇生の遂行に始まり，再灌流障害を制御し. ドリア上に存在し，微妙なバランスを保ちながら細胞. つつ therapeutic window を考慮した薬物療法を施行す. の生と死を司っているものと考えられる．今後は脳虚. る．細胞死実行経路の特定とそれに基づく創薬（多価. 血後のアポトーシスおよびネクローシスの制御機構を. 標的薬）を目指す．侵襲度の少ない治療法の確立．生. 解明するためにはカルシニューリン/イムノフィリン. 体に内在している保護機構の活用．低体温療法の工. 情報伝達系として総括的に捉えていくことが必要であ. 夫．脳指向型集中治療法の発展と改善を目指す．ま. ると考えられる．. た，遺伝子解析により患者の易障害性を予測するなどの集学的アプローチにより脳障害の進展を阻止し，脳. 5．脳保護薬候補に必要な特性（図 4）. 保護を目指す．さらに，機能障害等の残存に対しては再生医療によ. 脳保護作用を有する薬剤であるためには，① Ca. 2+. overload によるミトコンドリアの膨化を抑制できる，. る幹細胞の移植や遺伝子導入により機能回復を図ることになろう．. ② Ca のミトコンドリア内への取り込み能力を増加さ 2+. せる性質を持つという必要がある．もし，この 2 つの性質を持ち合わせた薬物であるなら脳だけでなく臓器保護薬としての可能性も有するものと思われる15）．現在，この 2 つの性質を有する薬剤は CyclophilinD 抑制剤（シクロスポリン等）が該当する．. 文献 1） Gustafson I, Edgren E, Hulting J: Brain-oriented intensive care after resuscitation from cardiac arrest. Resuscitation 24: 245–261, 1992 2） Nolan JP, Neumar RW, Adrie C, Aibiki M, Berg RA, Bbttiger BW, Callaway C, Clark RS, Geocadin RG, Jauch EC,. ─ 159 ─.

(6) 脳循環代謝第 26 巻第 2 号. ２１世紀における神経麻酔・集中治療の在り方と神経再生への展望神経変性防御学. 細胞死実行経路の解析とプロテオミックスによる創薬と新規脳脊髄内輸送システム（''6）の開発. 薬物療法 Therapeutic (reperfusion)window を考慮した上での有効薬物の投与. 低体温療法のさらなる発展. 図５. プレコンディショニングによる脳保護虚血性神経細胞障害の発症阻止. 脳指向型集中治療法の発展と改善. 早期診断システムの確立（バイオマーカー捕捉 MUSTag、神経スコア、画像診断等）. マイクロダイアリシスの応用脳機能新規モニタリングの開発. 死亡. 機能障害. 機能回復および社会復帰. 神経再生学. 遺伝子導入神経栄養因子. 障害部位. 脳、脊髄内への導入図 5．21 世紀における神経麻酔・集中治療のあり方と神経再生への展望 21 世紀の脳保護と薬物療法のありかたを示した．まず，迅速な蘇生の遂行に始まり，再灌流障害を制御しつつ therpeutic window を考慮した薬物療法を施行する．細胞死実行経路の特定とそれに基づく創薬（多価標的薬）を目指す．侵襲度の少ない治療法の確立．生体に内在している保護機構の活用．低体温療法の工夫．脳指向型集中治療法の発展と改善．遺伝子解析により患者の易障害性を予測するなどの集学的アプローチにより脳障害の進展を阻止し，脳保護を目指す．さらに，機能障害等の残存に対しては再生医療による幹細胞の移植や遺伝子導入により機能回復を図る．. Kern KB, Laurent I, Longstreth WT, Merchant RM, Mor-. lowing forebrain ischemia in the rat. 2. A 2-vessel occlu-. ley P, Morrison LJ, Nadkarni V, Peberdy MA, Rivers EP,. sion model. Acta Neurol Scand 69: 385–401, 1984. Rodriguez-Nunez A, Sellke FW, Spaulding C, Sunde K,. 6） Cooper HK, Zalewska T, Kawakami S, Hossmann KA,. Hoek TV: Post-cardiac arrest syndrome: epidemiology,. Kleihues P: The effect of ischaemia and recirculation on. pathophysiology, treatment, and prognostication: a scien-. protein synthesis in the rat brain. J Neurochem 28: 929–. tiﬁc statement from the International Liaison Committee. 934, 1977. on Resuscitation; the American Heart Association Emer-. 7） Cooper HK, Zalewska T, Kawakami S, Hossmann KA,. gency Cardiovascular Care Committee; the Council on. Kleihues P: Delayed inhibition of protein synthesis during. Cardiovascular Surgery and Anesthesia; the Council on. recirculation after compression ischemia of the rat brain.. Cardiopulmonary, Perioperative, and Critical Care; the. Acta Neurol Scand Suppl 64: 130–131, 1977. Council on Clinical Cardiology; the Council on Stroke. 8） Wu D: Neuroprotection in experimental stroke with tar-. (Part 1). Int Emerg Nurs 17: 203–225, 2009. geted neurotrophins. NeuroRx 2: 120–128, 2005. 3）横田裕行：臨床医のために標準的蘇生法と脳蘇生．. 9） Siesjö BK, Siesjö P: Mechanisms of secondary brain. 日本医科大学医学会雑誌 4: 143–147, 2008. injury. Eur J Anaesthesiol 13: 247–268, 1996. 4） SOS-KANTO study group: Cardiopulmonary resuscitation. 10） Moro MA, Cárdenas A, Hurtado O, Leza JC, Lizasoain I:. by bystanders with chest compression only (SOS-. Role of nitric oxide after brain ischaemia. Cell Calcium. KANTO): an observational study. Lancet 369: 920–926,. 36: 265–275, 2004. 2007. 11） Honda HM, Korge P, Weiss JN: Mitochondria and isch-. 5） Smith ML, Bendek G, Dahlgren N, Rosén I, Wieloch T, Siesjö BK: Models for studying long-term recovery fol-. ─ 160 ─. emia/reperfusion injury. Ann N Y Acad Sci 1047: 248– 258, 2005.

(7) 虚血性脳障害とミトコンドリア機能不全. damage following transient forebrain ischaemia in the rat.. 12） Halestrap AP: The mitochondrial permeability transition:. Acta Physiol Scand 155: 469–471, 1995. its molecular mechanism and role in reperfusion injury.. 15） Morota S, Månsson R, Hansson MJ, Kasuya K, Shimazu M,. Biochem Soc Symp 66: 181–203, 1999 13） Sharkey J, Butcher SP: Immunophilins mediate the neuro-. Hasegawa E, Yanagi S, Omi A, Uchino H, Elmér E: Eval-. protective effects of FK506 in focal cerebral ischaemia.. uation of putative inhibitors of mitochondrial permeability. Nature 371: 336–339, 1994. transition for brain disorders̶speciﬁcity vs. toxicity. Exp. 14） Uchino H, Elmér E, Uchino K, Lindvall O, Siesjö BK:. Neurol 218: 353–362, 2009. Cyclosporin A dramatically ameliorates CA1 hippocampal. Abstract Ischemic brain damage and mitochodrial dysfunction Hiroyuki Uchino, Naomi Hara, Yuhsuke Ishida, Fumiaki Nagashima, Ryota Nishiyama, Saki Kamata, Ami Kodaira, Kazuhiro Shirasawa, and Yukihiko Ogihara Department of Anesthesiology, Tokyo Medical University, Tokyo, Japan How can we reduce the cerebrospinal damage subsequent to postcardiac arrest syndrome (PCAS) is depending on whether we could inhibit the progress of the negative spiral cascade to induce cerebral damage and improve the functional recovery. On behalf of the improvement of the BLS (Basic Life Support) and ACLS (Advanced Life Support) at the cardiopulmonary resuscitation and the progress of the blood flow interventinal therapy at cerebral infarction and combination of the brain-oriented intensive care came to be able to find the light, however brain has few reserve forces for ischmeic events and brain does not have enough defense mechanisms for ischemic events. Also, therapeutic window for the treatment is still very narrow because of its complicate mechanisms and difficult all patients to come back to normal life. To progress the brain protection and discover new treatment and drugs, it is important to investigate the mechanisms of ischemic brain damage and its pathophysiology. Especially, to analyze the mechanisms of ischemic brain damage and innovate new drugs focusing on the mitochondrial dyfunction may open new avenue. In this review, we referred to PCAS and referred a mechanism of the ischemic brain damage based on the mitochondria dysfunction and the importance of calcineurin- immunophilin signal transduction pathway to be associated with cell death. Key words: postcardiac arrest syndrome, brain damage, mitochondrial dysfunction, mitochondrial permeability transition (mpt), brain protection. ─ 161 ─.

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