無細胞液体培地における鼠癩菌の増菌 第10報 培養材料の検討

Multiplication of Mycobacterium lepraemurium in Cell-free Liquid Medium

10. Factors Involved in the Starting Material of M, lepraemurium for the Growth in vitro and in vivo

MASAHIRO NAKAMURA

(Department of Microbiology, Kurume University School of Medicine)

Factors involved in the inoculum of M. lepraemurium for the growth in NC-5 medium as well as in mice were studied and the results obtained are as follows :

1. Significant multiplications of M. lepraemurium obtained from infected subcutaneous

tissue, liver, and spleen in NC-5 medium were observed. Therefore, it is obvious that the growth of bacilli in NC-5 medium is independent from the sourses of the materials used. The multiplication ability of the bacilli in NC-5 medium is kept for 2 months at

-20•Ž(in a freezer) _.

2. No effects of treatments with 0.1% trypsin, 0.2% pronase, and 0.1%

late at 37•Ž for 60min on the potentiality of the growth in NC-5 medium were cognized. The treatment with petroleum ether somewhat destroyed the ability.

3. The growth rate of purified bacilli was superior than that of crude material.

4. The potentialities of the growth of M. lepraemurium in NC-5 medium as much as in mice were completely destroyed by the treatment with below pH 6 at 37•Ž for 60 min and by heating at 50•Ž for 30min. On the other hand, a complete destruction

of the growth potentiality of bacilli in NC-5 medium was resulted by UV irradiation

for 2.5min, whereas the leproma producing ability in mice was maintained even by irradiation for 60min.

無 細 胞 液 体 培 地 に お け る 鼠 癩 菌 の 増 菌

第10報

培 養 材 料 の検 討

中

村 昌

弘

(久留米大学医学部微生物学教室細菌学講座)

(受付 1976年4月5日)

前 報1)に お い て鼠 癩 菌 のNG5培 地 で の 増 菌 に影 響 を 与 え る 因子 につ い て 簡 単 な 記 述 を行 った が,本 報 に お い て は特 に培 養 材 料 と して 用 い られ る鼠 癩 菌 そ の もの の性 状 がNC-5培 地 で の 増 菌 に 如 何 に左 右 され るか を詳述 す る。 勿 論,新 鮮 材 料 を用 い るの が 一 般 に最 良 の増 菌 を来 す で あ ろ う こ とは容 易 に想 像 され るが,鼠 癩 菌 の 場 合 は 本 来,ネ ズ ミの 体 内 で増 殖 した もの で あ る の で ネ ズ ミの 組 織 の 混 在 がin vitroの 増 菌 に 影 響 を与 え るで あ ろ う 203

こ と も考 え られ うる。 ま たin vivoの 状 態 に比 す れ ば in vitroの 条 件 は 甚 し く 増 菌 に不 適 の 状 態 で あ る の で 培 養 材 料 の活 性 の 程 度 がNC-5培 地 で の 増 菌 に 鋭 敏 に 反 映 され る こ と も考 察 を加 える予 定 で あ る 。 材 料 と方法 供 試 菌:教 室 にお い てC3Hマ ウス皮 下接 種 に よ り継 代 され て い る鼠癩 菌ハ ワイ株(M-54,56,57,58)お よ び 熊 本 株(M-39)を 用 い た 。 無 菌 的 に レプ ロー ム を 採 取,ハ サ ミで細 切,滅 菌蒸 溜水(Aq)に 浮 游,静 置, そ の 上清 を出 発 材 料 と した 。 特 に断 わ らな い 限 り鼠 癩 菌 乳 剤 とは 皮 下 レプ ロ ー ム よ り作 製 した も の をい う。 そ の ほ か ハ ワイ 株 感 染 マ ウ ス の肝 お よび 脾 を と り出 し,レ プ ロー ムの 場 合 と同 様,そ れ らよ り菌 液 を作 製 した場 合 も あ る。 酵 素 処 理:出 発 材 料 に1%プ ロナ ー ゼ(科 研 化 学)液 を1/10量 加 え,最 終 濃 度 を0.1%に して37℃60分 処 理, た だ ち に2,500rpm30分 遠 心,上 清 をす て,沈 渣 をAq に再 浮 游 した もの を プ ロナ ー ゼ処 理 菌 液 と した。 トリプ シ ン処 理 菌 液 の作 製 法 もプ ロナ ー ゼ の場 合 と同様 で あ る が2%ト リプ シ ン(1:250Difco)液 を用 い た(最 終 濃 度0.2%)。 デ オ キ シ コー ル酸 処 理:出 発材 料 に1%デ オ キ シ コー ル酸 ソー ダ(DOC)を1/10量 加 え37℃60分 処 理,遠 心,沈 渣 をAqで 再 浮 游 した 。 こ の さい 用 い たDOC は生 理 食 塩 水 で作 製,autoclavingに よ り滅 菌 した。 石 油 工一 テ ル 処 理:5m1の 出 発材 料 に8m1の 石 油 工 一 テ ル(和 光 純 薬)を 加 え,よ くpipetting,冷 蔵 庫 に静 置,30分 後,下 層 の約1/9を 無菌 的 にピ ペ ッ トで採 取,こ れ を処 理 菌 液 と した 。 酸,ア ル カ リ 処 理:pH3よ りpH5ま で はM/5 Na2HPO4とM/10ク エ ン酸 の組 合 せ,pH6よ りpH8 ま で はM/15 Na2HPO4とM/15 KH2PO4の 組 合 せ, pH9はM/10 KH2PO4とM/20 Na2B407・10H2Oの 組 合 せ でbufferを 作 製,autoclavingに よ りそれ ぞ れ ・滅菌 。Buffer4.5m1に 出 発 材 料 菌 液0.5m1を 混 和, 37℃ 処 理,遠 心(沈 澱 操 作 を含 め て60分 間),沈 渣 を2 mlの0.1%牛 アル ブ ミ ンV液(Armour)に 再 浮 游 し, これ を処 理 菌 液 と した 。 紫 外 線 処 理:径6cmの フ ラ ッ ト ・シ ャー レ に 出 発 材 料 の菌 液1m1を 注 ぎ,15cmの 距 離 よ り紫 外 線(UV 10W)照 射 を行 っ た。 照 射 の間,た えず 軽 く水 平 に動 か してUVの 効 果 が 均 一 にな る よ う努 めた 。 増 菌 判 定 法:ス ライ ド培 養 法2)と 菌 数 計 算 法3)4)に よ って 増 菌 を判 定 した 。 前 者 の 場 合 に は 特 に菌 液 に0.1% の割 に牛 アル ブ ミンV液 を加 え シ リコ ン ・ス ライ ドへ の 附 着 を完 全 に した 。 培 養 に はNG5培 地5)を 用 い,30℃ で 培 養 した。 成 績 1. 増 殖 母 地 を異 に した鼠 癩 菌 の増 菌 増 殖 母 地 と して通 常 用 い る皮 下 組 織 お よび 静 脈 内 接 種 に よっ て感 染 させ た マ ウス の肝 な らび に脾 にお い て 増 殖 した 鼠 癩 菌(M-57,58)を 用 い て,NC-5培 地 で の 増 菌 能 を 比較 した 。感 染肝 お よび 脾 を無 菌 的 に採 取,皮 下 鼠 癩 腫 と同 様,ハ サ ミで 細切,0.1%牛 アル ブ ミンv-蒸 溜水 で 乳剤 を作製,ス ライ ド法 に よっ て培 養 した。 そ の 結 果,通 常 え られ る増 菌 パ ター ン と異 る こ とな く,3 種 類 の鼠 癩 菌 共,よ く増菌 し相 互 の 問 に 差 が な か っ た。 2. 保 存 菌 液 の増 菌 能 維 持期 間 鼠 癩 菌 乳 剤 を フ リーザ(freezer,一20℃)に 保 存 した 場 合,ど の く らい の期 間,増 殖 能 を維持 し う るか を ス ラ イ ド法 を用 い て検 討 した。 こ の さい 増 殖 能 有 無 の 判定 の 確 実 を期 す る た め1カ 月 毎 に新 鮮NG-5培 地 ヘ ス ラ イ ドをtransferし,結 局2回 のtransferを 行 っ て 全 培 養 期 間3カ 月後 の所 見 に よ っ た。 そ の結 果,表1の とお りで,2カ 月 間 は確 実 にNC-5培 地 で増 殖 す る 能 力 を 保 有 して い た。3カ 月 に な る と急 に増 殖 能 が 落 ち,そ れ 以 上 の保 存 で は全 く増 菌 しな か っ た。

Table 1 Maintenance of the growth ntiality of M.lepraemurium in

-20•Ž

* by the slide culture method.

3. 鼠癩 菌乳 剤 に施 され た種 々 な る処 理 の影 響 実験 方 法 の項 に の べ た方 法 に従 っ て,ト リプ シ ン,プ ロす 一 ゼ,石 油 工 一 テ ル お よ び デ ゾキ シ コール 酸 ソ ー ダ で鼠 癩 菌 乳 剤 を処 理 した場 合 のNC-5培 地 で の 増 殖 能 に及 ぼす 影 響 を ス ライ ド培 養 法 に よっ て検 討 した。 そ の 結 果 表2に 示 す 通 りで 石 油 工 一 テ ル 処 理 に よ り 影 響 を

Table 2 Effects of pretreatments of M.

lepraemurium on the growth

potentiality

* by the slide culture method _.

うけた 以 外 は 無 処 理 と同 程度 の増 菌 能 が維 持 さ れ て い た 。 また 興 味 あ る こ とは プ ロナ ー ゼ処 理 は無 処 理 材 料 よ りむ し ろ増 殖 能 が 優 れ て い た(写 真1)。 4. 菌 液 の塗 抹 量 の増 菌 に及 ぼ す影 響 ス ライ ド培 養 法 で 鼠 癩 菌 を培 養 す る場合,シ リ コ ン ・ ス ライ ドへ の菌 液 の塗 抹 量 の増 菌 に及 ぼ す影 響 の検 討 を 行 った 。 菌 液 をガ ー ゼ2枚 で濾 過 し,そ の濾 液 を原 液 と して, これ を0.1%牛 アル ブ ミンV液 で5,10,50,100倍 に 希 釈 し,そ の一 滴 を ス ライ ドへ 塗 抹 して培 養 した 。 そ の 結 果,原 液 で は増 菌 度 が非 常 に悪 か っ た の に反 して,50倍

Photo. 1 Growth patterns of M. lepraemuriurn.

Photo. 2 Effect of inoculum size.

A: Non-diluted, B: 5 •~diluted, C: 10 •~ diluted, D : 100 •~diluted. お よび100倍 希 釈 菌 液 で は ミク ロ コ ロニ ー の形 成 も良 く, 増 菌 も良 好 で あっ た。 これ らの所 見 を写 真 に よ っ て示 す (写真2)。 そ の さ い の菌 量 は 下記 の とお りで あ る。 原 液=8.16×107/m1 5倍 希 釈=1.6×107/ml 10倍 希釈=8.16×106/m1 50倍 希 釈=1.6×106/ml 100倍 希 釈=8.16×105/ml 菌 量 は 計算 上,上 記 の とお りで あ るが,ス ライ ドに 実 際 に 附 着 した 量 は不 明 で あ る。 な ぜ な ら,一 滴 の菌 液 を ス ライ ドへ 滴 下 して30分 後,こ れ を注 射 器 で吸 い取 り, 塗抹 を乾 燥 して 培 養 す るか らで あ る。 5. 部 分 精 製 鼠 癩 菌 の増 殖 鼠 癩 菌 液 に ミ リポ ア フ ィル タ ー で濾 過 滅 菌 した1%プ ロナ ー ゼ 液 を1/10量 加 え(最 終 濃 度0.1%),37℃,30 分(water bath)処 理,直 ち に遠 心 沈 澱2,500rpm 30 分,上 清 をす て沈 渣 を蒸 溜 水 で再 浮游,こ れ に 等量 の1 %NaOHを 加 え,遠 心(2,500rpm,30分),沈 渣 を0.1 %牛 アル ブ ミ ンV液 に 再 浮 游 した も の を 部分 精 製 鼠 癩 菌6)7)と した。 こ の よ うに して作 製 した菌 液 と無 処 理 菌 液 との増 菌 パ タ ー ン を ス ラ イ ド培 養 法 で 検 討 した 。 そ の 結 果,部 分 精 製 菌 が無 処 理 菌 に比 して増 菌 が 極 め て 著 明 で あ る こ とが 分 っ た。 こ の所 見 はプ ロナ ー ゼ単 独 処 理 よ りも更 に著 明 で あ っ た。 一 方,無 処 理 菌 と部 分 精 製 菌 の増 殖 曲線 を菌 数 カ ウ ン ト法 に よ っ て検 討 して み る と,図1の 如 き もの が 得 られ た 。即 ち,接 種 菌 数 が 多 い と無 処 理 菌 で も部 分 精 製 菌 で も増 殖 曲線 に差 が な く,不 均 一 で あ って ス ムー ス な 曲線 を と らな い が,菌 数 を1/10に 減 ら した 量 の 接 種 菌 数 の

Table 3 Potentiality of

lication, and leproma production

* treated at 37•Ž: 60min

Table 4 Potentiality of elongation and multiplication

Fig. 1 Growth curves of crude (-•œ-) and purified (-•›-) M. lepraemuriurn in NC-5 medium. 場 合 は部 分 精 製 菌 は ス ムー スな 曲線 を もっ て増 菌 す る の に反 し,無 処 理 菌 の そ れ は 不 整 い で あ っ た 。 しか し,最 終 増 菌 数 に は差 は な か っ た。 6. 酸,ア ル カ リ処 理菌 実 験 方 法 の項 に述 べ た 方 法 で 菌 液 を酸 また は ア ル カ リ で処 理 した も の を ス ライ ド培 養 法 で そ の 増殖 能 を検 討 す る と表3に 示 す 如 き成 績 が え られ た 。 な お 同 時 に処 理 材 料 をマ ウ ス皮 下 に接 種 して レプ ロー ム形 成 能 の有 無 も検 べ た 。 NC-5培 地 で の増 殖 能 はpH3-5の 処 理 で 完全 に, pH6で 不完 全 に喪 失 した 。 pH8で の処 理 は 無 影 響 で, pH9で は や や 不活 化 され た。 な お マ ウ スで の レプ ロー ム形 成 能 もほ ぼ これ と平行 した。 こ こで 興 味 あ る こ とはNG-5培 地 で の 増 殖 能 と 菌 体 のelongationと が別 の現 象 と して 把 握 され た こ とで あ って,elongationはpH3の 処 理 で も起 きた 。 7. 加 熱 処 理 菌 NC・5培 地 で の 増殖 能 は40℃ お よび45℃,30分 の処 理 で殆 ん ど失 われ たが,真 の不 活 化 は50℃ 以 上 の処 理 で あ る こ とが レプ ロー ム形 成 能 か らで も判 断 され た(表 * 30min 4)。 こ こで も前項 と同様elongationと 増 殖 能 とが 明 か に 別 の現 象 と して分 離 した。 即 ち,45℃,30分 の加 熱 の場 合,顕 著 なelongationは 起 るが,こ れ が増 殖 に は 繋 ら ず,そ の ま ま の形 で終 了 した。50℃,30分 加 熱 処 理 の 場 合 も著 明 で は な い が,elongationは 起 る が 増 菌 は な か っ た(写 真3)。 8. UV照 射 菌 UV照 射 のNC-5培 地 で の増 菌 能 に及 ぼ す 影 響 の 成 績 は 表5に 示 す 。2分30秒 のUV照 射 で 増 菌 能 は 完 全 に喪 失 した 。 この 現 象 はelongation現 象 と も一 致 し, elongationも 全 く起 き な か っ た。 しか し,マ ウ ス皮 下 で の レプ ロー ム形 成 能 は60分 照 射 で も維 持 され て い た。 考 察 NG-5培 地 が 鼠 癩 菌 のprimary multiplicationの た

め の培 地 と して使 用 で き る こ とはDhople & Hanks8)

に よ っ て追 試 確 認 され て い る。 しか し未 だ 生 体 に近 い ほ どの能 力 に は欠 け て い る とい うこ とが 出来 るが,本 報 で

Photo. 3 Growth patterns of M. lepraernurium.

upper : Nontreated, lower: Heated at 45•Ž, 30min.

は一 応,NC-5培 地 を用 い て鼠 癩 菌 が 増 殖 す る さい の 菌 側 の条 件 につ い て 検 討 した 。 しか し,同 時 に 同一 材 料 を マ ウ ス皮 下 に 接 種 して レプ ロー ム形成 能 も調 べ た 。本 報 の実 験 目的 は 鼠 癩 菌 の 生 物 学 的 性 状 の 検 討 と同時 にin vitro増 殖 の た め の至 適 条 件 を 探 索 しよ うと した と こ ろ に もあ った 。 生 物 学 的性 状 は 感受 性 の 最 も高 い マ ウス に 接 種 して判 定 す るの が正 しい こ とは 勿 論 で あ るが1imi-ted conditionに お け る増 殖 能 を知 る こ とは 鼠 癩 菌 の 生 物 活 性 の上 限 を知 る こ とに もな る。 は じめ にNG-5培 地 が 鼠 癩 菌 そ の も の の 増 殖 を 許 す 培 地 であ る こ と を増 殖 母 地 を 異 に す る鼠 癩 菌 を用 い て確 か め た。 次 に この 増殖 能 が 一20℃ で2カ 月間 保 存 し う る こ と を知 っ た 。 この さい は しか しマ ウス皮 下接 種 を試 み て い な い の で,マ ウス皮 下接 種 法 で検 討 すれ ば それ 以 上 の 保 存 が 出来 そ うで あ る。 皮 下 レプ ロー ム よ りえた 鼠 癩 菌 の 中 に は皮 下組 織 の混 在 が あ る こ とは 当然 で あ るが,こ れ を除去 す るた め の酵 素 お よび そ の他 の処 理 でNC-5培 地 で の 増 殖 は 極 め て 良 好 にな っ た 。 一 方,無 処理 菌 乳剤 を希 釈 して ス ラ イ ド培 養 法 で増 菌

Table 5 Potentiality of

lication, and leproma production

* Distance : 15cm パ ター ン をみ る と希 釈 す る こ とに よ り増 菌 像 は濃 厚 菌液 よ りす ぐれ た。 以 上 の こ とか ら皮 下 レプ ロー ム の 中 に は NC-5培 地 で の増 菌 を阻 止 す る物 質 の 存 在 が 示 唆 され た が こ のinhibitorが 感 染皮 下組 織 そ の もの な の か菌 の増 殖 中 に産 生 され た で あ ろ う代謝 産 物(蛋 白)な の か又 は NG-5培 地 で 増 殖 す る場 合 に鼠 癩 菌 相互 のinteraction が 増 菌 を阻 止 現 象 に 導 くの か は不 明 で あ る。 増 菌 に及 ぼ す 菌 液 の希 釈 効 果 を検 討 す る さい 部分 精製 菌 を 出 発材 料 にす れ ば若 干 そ の点 が解 明 され る か も しれ ない 。 酸,ア ル カ リ 処 理 と 熱 処 理 に よ る 鼠 癩 菌 の 不 活 化 は in vivoで の判 定 とNC-5培 地 で の 判 定 成 績 と一 致 し た が,UV照 射 の結 果 は 全 く 異 りNC-5培 地 で は2分 30秒 照 射 菌 の増 菌 は完 全 に認 め られ な か っ た。 こ の こ と

はin vivoで はDNA repairが 容 易 に行 わ れ るの に

反 してNC-5培 地 で は 困 難 で あ る こ とを 示 して い る の かNG-5培 地 の 不 完 全 さ を 示 して い るか で あ ろ う。 抗 酸 菌 に対 す るUV照 射 の影 響 をみ たDavid9)の 研 究 に よれ ばUV照 射 のresponseは 菌 の ゲ ノム ・サ イ ズ に 依 存 して い る とい う。 それ な ら ば 鼠 癩 菌 のgenome sizeは 比 較 的 小 さい もの とい うこ とが 出来 よ う。 ま た

将 来,McCarthy & Schaefer10)に 従 っ てUV照 射 後

の鼠 癩 菌 のphoto-reactivating repair systemの 有 無

も検 討 す る必 要 が あ ろ う。 な お,こ の研 究 中 に 見 出 した興 味 あ る こ と はNG-5 培 地 にお け る鼠 癩 菌 のelongationと 増 菌 とが別 個 の現 象 で は な い か とい う事 実 で あ っ た。 鼠 癩 菌 を45℃30分 処 理 す る と増 菌 は軽 度 しか 起 らぬ の に 著 明 なelonga-t ionが 認 め られ た。 同 様 に50℃30分 処 理 で も増 菌 は 全 く起 らぬ の にelongationは 起 っ た。 こ とに45℃30分 の 場 合 の現 象 は 明 瞭 で あ っ た。 これ に反 してUV照 射 の さい はelongationも 増 菌 も全 く起 き な か った 。 こ の こ とはUVの 効 果 が 核 酸 に及 ぶ の に,加 熱 の 場 合 は菌 体 表 面 の 蛋 白変 性 か ら菌 の 不活 化 が 始 ま る作 用 機 序 の差 異 の結 果 で あ ろ う。 こ の こ とに よ っ てelongation現 象 が 直 ち に増 菌 に連 結 す るの で は な く,elongationは 退 行 性 変 性 の一 現 象 で あ る とい う一 般 常 識 に帰 着 しそ うで あ る。 そ してelongation は 細胞 質 内 のprogressive processを 伴 わ な い 細 胞 壁 の変 性 の み の 現 象 で あ る ら し い。 結 論 NC-5培 地 に お け る鼠 癩 菌 の増 殖 に 及 ぼ す 因子 の うち で,本 報 で は 接 種 され る 材 料 側 の条 件 に つ い て 検 討 し た 。 そ の結 果,次 の 成 績 を え た。 1. マ ウ スの 皮 下 組 織,肝,脾 で増 殖 した 鼠 癩 菌 の増 殖 能 の間 に差 は な く,い ず れ も よ くNG-5培 地 で 増 菌 した 。 2. 出 発 材料 は2カ 月 間,フ リ ーザー(20℃)で 保 存 で き る。 3. 0.1%ト リプ シ ン,0.2%プ ロナ ー ゼ,お よび0.1 %デ ゾキ シ コール 酸 ソー ダ の37℃,60分 処 理 で も 増 殖 能 に影 響 を 与 えな い。 石 油 工 一 テ ル の 処 理 は 障 害 を与 え た。 4. 部 分 精 製 菌 の方 が 無 処 理 菌 よ り増 殖 率 は 良 好 で あ っ た。 5. pH6以 下 の処 理(37℃,60分)お よ び50℃30 分 加 熱 で,NC-5培 地 で の増 殖 能 もマ ウス で の増 殖 能 も 同 程 度 に失 わ れ た 。 6. 2分30秒 の紫 外線 照 射 でNC-5培 地 で の 増 殖 能 は完 全 に喪 失 した 。 しか し,マ ウ ス皮 下接 種 で の増 殖 能 は60分 照 射 で も保 有 され て い た。 謝 辞 本 研 究 は笹 川 記 念 保 健 協 力 財 団 研 究 費 な ら び に 日米 医 学 協 力 研 究 会 らい 専 門 部 会 研 究 費 の援 助 に よ っ た。 文 献 1) 中 村 昌 弘:鼠 癩 菌 の無 細胞 液 体 培 地 で の 培 養, 日細菌 誌,29,517-525,1974. 2) 大 岩 弘 治:代 謝 活 性 無 細 胞 培養 液 を用 い て の 鼠 らい菌 培 養 の試 み,レ プ ラ,36,170-178,1967. 3) 森 竜 男,高 坂 健 二,岸 良 治,亀 井 征 子,西 村 真 二:実 験 動 物 の 皮 膚 と四 肢 お よ び 内臓 に お け る

抗 酸 菌 の 分 布,レ プ ラ,35,28-32,1966. 4) 中 村 昌 弘:無 細 胞 液 体 培 地 に お け る 鼠 癩 菌 の 増 菌,第2報NC培 地 に お け る 鼠 癩 菌 の 増 殖 曲 線 と 増 菌 し た 菌 の 病 原 性,レ プ ラ,42,52-55, 1973. 5) 中 村 昌 弘:無 細 胞 液 体 培 地 に お け る 鼠 癩 菌 の 増 菌,第5報NC-5培 地 の 開 発,レ プ ラ,42, 205-209,1973. 6) 森 竜 男,高 坂 健 二,伊 藤 利 根 太 郎,西 村 真 二: 鼠 癩 菌 の 集 菌 法,日 細 菌 誌,16,808-813,1961. 7) 中 村 昌 弘,上 野 由 恵:鼠 癩 菌 の 簡 便 か つ 無 菌 的 集 菌 法,日 細 菌 誌18,75-79,1963. 8) Dhople,A.M.and

Hanks,J.H.:Valida-tion ofNakamura's system for the micros-copic growth of Mycobacterium lepraemu-。 rium,Leprosy Scientific Memoranda,Memo L-531,February1974.

9)David,H.L::Response of Mycobacteria to ultraviolet light radiation,Amer.Rev.Resp.

Dis.108,1175-1185,1973.

10)McCarthy,C.M.and Schaefer,J.O.: Response of Mycobacterium avium to ultra-violet irradiation,Applied Microbiol.,28, 151-153,1974.