Title
Hepatocyte growth factor promotes neuronal differentiation of
neural stem cells derived from embryonic stem cells( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
加藤, 雅康
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）乙 第1389号
Issue Date
2004-03-10
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14883
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氏 名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 加 藤 雅 康(愛知県) 博 士(医学) 乙第 1389 号 平成16 年 3 月10 日 学位規則第4条第2項該当
HepatocYte grOWth factor promotes neuronaldifferentiation of neural
Stem Ce‖s derived from embryonic stem celts
(主査)教授 坂 井 昇 (副査)教授 囲 貞 隆 弘 教授 犬 塚 論文内容の要旨 中枢神経系細胞の再生･移植において,胚性幹細胞(ES細胞)からneurosphereを誘導し,より多くのneuron を分化させることは今日大きな課題である｡マウス胎児性神経幹細胞を用いたneurosphere及びneuronの作成･ 制御について,hepatocytegrowthfactor(HGF)が関わっていることが報告されているが,マウスES細胞由 来の◆神経幹細胞に関するHGFの作用については,これまでに報告されていない｡申請者はマウスES細胞を用い て誘導されたneurosphereと分化に対するHGFの作用に関して研究を行った｡ 方法 1)ES細胞由来のneurosphere形成時におけるHGFの作用 マウスES細胞(EScelllineD)をfeeder細胞であるPA6細胞上で10日間共培養することによりES細胞は増殖,
分化してコロニーを形成する｡このコロニーをpapainによりsingle cellに分離し,fibroblast growth
factor-2(FGF-2)(20ng/ml),epidermalgrowth factor(EGF)(20ng/ml)を含む無血清培養液中で7 日間浮遊培養するとsingle cellはそれぞれ増殖して神経幹細胞を含む細胞塊(neurosphere)を形成する｡ この過程において,培養液中に段階的に濃度を変化させたHGF(0-40ng/ml)を加.え,neurOSphereの形 成に及ぼす影響を検討した｡ 2)neurosphereの免疫染色 HGF(20ng/ml)を加えた,または加えない培養液中で7日間浮遊培養したneurosphereをMAP-2,GFAP で染色し,neurOSphereに含まれる神経幹細胞に対するHGFの効果を検討した｡ 3)neurosphereの分化誘導 HGF(20ng/ml)を加えた,または加えない培養液による浮遊培養で得られたneurosphereをpoly-D-1ysine でコーティングした培養プレート上で5日間分化誘導し,MAP-2,GFAPで免疫染色を行って,それぞれの 陽性細胞の比率を求めた｡また,分化誘導の際に分化培養液中にHGFを加えた,加えないことにより得ら れた5日目の細胞についてMAP-2,GFAP陽性細胞の比率を求めた｡ 結果 1)浮遊培養液中にHGFを加えない場合,1.5×106個の細胞から形成されるneurosphereの数は114･0±24･8個で あったが,HGFを加えることにより形成されるneurosphereの数はHGFが10ng/mlで59.3±11.4個,20ng/ml
で26.0±16.5個と濃度依存性に減少を示した｡またHGFの濃度が20ng/ml以上の場合,neurOSphereの数に有 意な増減はなかった｡
2)HGF(20ng/ml)を加えた浮遊培養液中で形成さ叫たneurosphereはHGFを加えない培養液中で形成された
neurosphereと比較してMAP-2陽性細胞が明らかに多く存在していることが確認された｡ 3)HGFを加えない浮遊培養液中で形成されたneurosphereをHGFを加えない分化培養液中で分化誘導したMAP-2陽性細胞とGFAP陽性細胞の比率は11.2±3.2%,48.8±11.5%,HGF(20ng/ml)を浮遊培養液中に加えて形成 されたneurosphereを分化誘導した場合の各々の比率は18.2±2.9%,38.3±8.8%であり,MAP-2陽性細胞の比率 は前者に比べて後者が有意に増加した(P<0.05)｡また,浮遊培養液中にHGFを加えず,分化培養液中にHGF (20ng/ml)を加えたneurosphere分化誘導時のMAP-2陽性細胞とGFAP陽性細胞の比率は19.2±3.0%,30.4±5･6, 浮遊培養液と分化培養液の両方にHGF(20ng/ml)を加えた場合のMAP-2陽性細胞とGFAP陽性細胞の比率は 25.9±4.6%,22.1±7.4であり,MAP-2陽性細胞の比率は前者に比べ後者が有意に増加した(P<0.05)｡ 考察 ES細胞由来の神経幹細胞からneurosphereを形成する際に,増殖(浮遊)培養液中にHGFを加えることにより, 形成されるneurosphereの数が減少したが,neurOSphereにはMAP.-2陽性細胞がより多く存在した｡これはHGF がES細胞由来の神経幹細胞に対して自己複製よりも神経前駆細胞への分化を促進したためと考えられた｡HGF を含んだ分化培養液中でneurosphereを分化誘導すると神経細胞の比率が増加したことから分化誘導時において もHGFは神経への分化促進作用を有していた｡さらに,増殖および分化培養にHGFを加えることによってより 多くの神経細胞が得られた｡これらの結果から,HGFはES細胞由来の神経幹細胞に対して増殖および分化のい ずれにおいても神経前駆細胞への分化を促進することが示唆された｡今後,ES細胞を用いた神経移植医療にお いてHGFがより多くの神経細胞を得るために重要な増殖因子となる可能性が示された｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 加藤雅康は,マウスES細胞由来の神経幹細胞に対するHGFの作用を検討し,HGFが神経細胞 (neuron)への分化促進作用を有することを明らかにした｡本研究の成果は,脳神経外科学,神経再生医学の発 展に少なからず寄与するものと認める｡ [主論文公表誌]Hepatocyte growth factor promotes neuronaldifferentiation of neuralstem cells derived from embryonic stem cells
Neuroreport15,5-8(2004).
