細胞機能制御研究室（研究室紹介） 利用統計を見る

著者

清水 範夫

著者別名

Shimizu Norio

雑誌名

生命科学

号

2009

ページ

15-22

発行年

2010-03-31

URL

http://id.nii.ac.jp/1060/00000102/

  細胞機能制御研究室

(第10研究室清水 範夫 教授)

Laboratory of Cell Function Control

はじめに  当研究室は、バイオサイエンスを基礎 として、酵素、微生物、動物細胞などを 用いて新しいバイオ産業分野を開拓して いくことを目標としている。これまで、 遺伝子工学を用いた遺伝子のクローニン グ、組換え蛋白質の効率的な合成、組換 え大腸菌の培養制御技術、分子シャペロ ンを利用した組換え蛋白質の効率的合成 とプロテオーム解析などに取り組んでき た。現在は、ナノ材料であるカーボンナ ノチューブを用いた神経細胞培養、セル チップや再生医療の基礎技術となる機能 性基板上での神経細胞培養と再生医療へ の適用を目指したマウス胚性幹細胞(ES 細胞)や人工多能性幹細胞(iPS細胞)の分 化誘導、爆砕処理した稲わら、もみ殻か らのバイオエタノール生産などの分野の 研究に力を入れている。つぎに、研究の 現状としてこれまでの研究成果を含めた 概略について述べる。 研究の現状 1.神経細胞培養に関する研究  細胞培養、人工臓器や再生医療などの 分野において、細胞の生存と機能の維持、 高次機能の制御が可能な細胞の足場とな る人工基板の開発が求められている。細 胞を効率よく接着させるには人工基板表 面の官能基の選択が重要である。我々は すでにアルカンチオールを用いてパター 研究室紹介 ンを形成させた自己組織化単分子膜  [SAM]の基板において、官能基として アこミノ基のSAMを用いることで神経細 胞の接着と神経線維の伸長を促進できる ことを明らかにした。そこで、ナノテク ノロジーの生命科学分野への適用の一環 として、カーボンナノチューブと微小磁 気ビーズを用いた神経細胞培養について 検討した結果について述べる。 1 −1.カーボンナノチューブを用いた 神経細胞培養  カーボンナノチューブ（CNT）はナノメ ータースケールの直径を有する円筒形の 新規物質であり、物理的に強く、多くの 薬品に対して安定であること、金属的性 質と半導体的性質を併せ持っているとい う特徴かおる。このような特異な性質を 持つCNTを電子材料分野に応用すること が検討されているが、生命科学分野への 適用についてはほとんど検討されていな い。そこで、我々はCNTのバイオ分野へ の適用に関する基礎研究として、神経栄 養因子で修飾したCNTを用いて神経細胞 の神経線維伸長について検討した。  アミノ基で修飾したCNTに神経成長因 子（NGF）を共有結合させてニワトジ8日 胚の脊髄後根神経節（DRG）神経細胞の培 養液に添加レ２日間培養して神経線維を 伸長させた細胞数を計数しか。 NGF を結合 させたCNTは、可溶性NGFを添加した場

合と同様に神経細胞の神経線維を伸長さ せた。このことは、CNTが神経損傷の治療 や、CNTを用いた培養基板の作製、薬剤や 生理活性物質を標的の組織や器官などに 選択的に運搬させるドラッグデリバリー の担体として用いることなどが可能にな ることを示している。  つぎに、アミノ基で修飾したCNTを神 経細胞培養液にNGFと共に添加したとこ ろ、低濃度のCNTの添加により神経細胞 の神経線維の伸長を促進させることが分 かった。そこで、CNTが神経細胞の神経線 維伸長に及ぼす影響を調べたところ、低 濃度(0.85μg/ml)のCNTをNGFと共に神 経細胞培養液中に添加することで、神経 線維を伸長した神経細胞数がCNTを添加 しない場合に比較して、約２倍に増加す ることが分かった。  CNTによる神経線維伸長促進効果は神 経細胞内の分化に関係するERKシグナル 経路の活性化に影響を及ぼしているので はないかと考え、ウェスダンプロッティ ンク法を用いて､ERKの活性化及び細胞生 存に関わるAkもの活性化の割合を調べた。 CNTを0. 85μg/ml添加した場合、CNTを 添加しない場合に比較して、ERKの活性化 が促進された。一方、細胞生存に関わる Aktの活性化はCNT添加に関わらず促進 されなかった。  さらに、CNTがいずれのシグナル経路の どこを刺激しているかについてTrkA､ERK、 PI3-K、Aktの阻害剤で処理した神経細胞 に対するCNTの神経線維伸長への影響を 調べた。 TrkAまたはERKの阻害剤で処理 した神経細胞にCNTを添加した場合では、 神経線維を伸長しか神経細胞数がCNTを 添加しない場合に比較して約２倍に促進 されたのに対し､PI-3KまたはAktの阻害 剤で処理した神経細胞ではCNTの添加に 関わらず、神経線維の伸長は促進されな かった。ERK またはAktの阻害剤で神経細 胞を処理した場合のCNT添加によるERK またはAktの活性化をウェスクンブロツ ティング法で調べたところ､ERKの活性化 は促進されていたのに対し、Aktの活性化 は促進されていなかった。  また、免疫蛍光染色を行い、神経細胞 中のERKまたはAktの活性化への影響を 蛍光観察したところ、ERKの阻害剤で処理 した神経細胞ではCNTの添加によりERK の活性化が観察されたのに対し､Akもの阻 害剤で処理した神経細胞ではCNTの添加 に関わらずAktの活性化が観察されなか った。  このことから、CNTはERKを活性化し、 神経線維伸長を促進する効果かおること が明らかになった。このCNTによる神経 線維伸長の効果は新規の現象であり、CNT を生命科学分野や臨床研究への応用に供 することができるものと考えられる。  また、アミノ基修飾CNT及び神経栄養 因子結合CNTを蛍光色素であるFITCを用 いて蛍光標識し､CNTの細胞内局在を調べ た。その結果、どちらのCNTも細胞内に 取り込まれ、アミノ基修飾CNTは細胞質 に存在していたのに対レ神経栄養因子 結合CNTは細胞質と核内どちらにも存在 していた。このことから、CNTが細胞内に 取り込まれることで細胞内のERKシグナ ル経路を活性化していると考えられる。 今後は、神経細胞のCNT取り込み機構を 検討し､ERKシグナル経路を活性化するメ

カニズムの解明、CNTが神経細胞の生理現 象に及ぼす影響を検討することで、CNT を、損傷した神経の修復、神経細胞培養 基板やドラッグデリバリーの担体として 適用することを考えている。 １−２．微小磁気ビーズを用いた神経細 胞培養  微小磁気ビーズは様々なサイズのビー ズを容易に入手でき、溶液中への懸濁平 回収が簡便であることより、多方面で利 用可能な蛋白質担体として有用と考えら れる。我々は、神経栄養因子で修飾した 微小磁気ビーズ（直径250 nm）を添加し てDRG神経細胞やPC12h細胞を培養する ことにより、微小磁気ビーズの神経細胞 に対する生物活性を検討した。さらに、 神経栄養因子で修飾した微小磁気ビーズ と磁石を用いて機能陛微小領域を形成さ せた培養基板上で、神経細胞を培養する ことで、新しい神経細胞の固定化方法を 検討した。この研究成果は神経細胞の特 定領域での培養や、マイクロ化学分析シ ステムなどに対するセルチップ技術開発 分野に応用可能であると考えられる。  微小磁気ビーズに結合させたNGFまた は脳由来神経栄養因子（BDNF）をDRG神 経細胞の培養液に添加して、微小磁気ビ ーズに結合した神経栄養因子の生物活性 について検討したところ､NGFまたはBDNF で修飾した微小磁気ビーズは、NGF溶液ま たはBDNF溶液を培地に添加した場合と同 様に神経細胞の神経線維を伸長させた。 これにより、微小磁気ビーズに結合した 神経栄養因子は生物活性を有しており、 微小磁気ビーズ上でも蛋白質の構造は変 研究室紹介 化していないと考えられた。  PC12h 細胞は培地にNGFを添加すると 神経線維を伸長させるが、BDNFを添加し てもBDNFレセプターを有していないため に神経線維を伸長させない。そこで、NGF とBDNF両方で修飾した微小磁気ビーズを PC12h細胞の培地に添加し、PC12h細胞が 神経線維を伸長するかどうかを調べた。 その結果、NGFとBDNFで修飾した微小磁 気ビーズはPC12 h細胞の神経線維を伸長 させた。これより、微小磁気ビーズに複 数の蛋白質を修飾しても、神経細胞に分 化刺激を与えられることが分かった。 1 −3.磁石を用いた微小磁気ビーズの パターン化と神経細胞および神経細胞に 分化したマウスES細胞の固定化  ５ｍｍφの永久磁石と神経栄養因子で修 飾した微小磁気ビーズを用いて、特定領 域への神経細胞または神経細胞に分化し たES細胞の固定化を検討した。培養ディ ッシュの裏側に磁石を貼り付け、その上 に神経栄養因子で修飾した微小磁気ビー ズを滴下してビーズを固定レ神経細胞 を培養した。その結果、神経細胞は固定 化した微小磁気ビーズ上に接着し神経線 維を伸長した。培養ディッシュの裏側に 磁石がないところでは、微小磁気ビーズ と神経細胞はほとんど見られなかった。 これより、微小磁気ビーズと磁石を用い ることでパターン化した基板の形成が可 能であり、微小磁気ビーズを神経栄養因 子で修飾することで神経細胞のパターン 化した固定が可能であることが分かった。  さらに、種々の細胞に分化したES細胞 の集団から神経細胞に分化した細胞のみ

を本方法を用いて、特定領域への分離と 固定化が可能かどうかについて検討した。 ES細胞から分化した神経細胞を、5mm φの 永久磁石とNGFで修飾した微小磁気ビー ズを用いて形成させた特定領域を有する 培養シャーレに播種した。培養２日後に は特定領域に神経線維を伸長した神経細 胞が集積し、ネットフーグを形成した。 集積した細胞を免疫蛍光染色しかところ 全て神経細胞であることが分かった。  この方法により、神経細胞をパターン 化した領域上に効率よく固定化できるこ と、さらに、ES細胞から分化した神経細 胞を他の細胞から分離し、固定化できる ことを明らかにした。 １−４．まとめ  本研究において、神経栄養因子で修飾 したCNTおよび微小磁気ビーズは、神経 栄養因子を培養液に添加した場合と同様 に神経細胞の神経線維を伸長させること が分かった。これにより神経細胞培養時 におけるCNTや微小磁気ビーズは、細胞 に影響を与えることなく蛋白質担体とし て利用できる。また、複数の神経栄養因 子を微小磁気ビーズに固定することによ り、さまざまな種類の神経細胞に同時に 生存と機能維持の刺激を与えられる可能 性があることを示した。 さらに、神経栄 養因子で修飾した微小磁気ビーズと磁石 を用いることで、培養基板の特定領域に 神経細胞やES細胞から分化した神経細胞 を固定化することが可能になった。さら に、低濃度のCNTは神経細胞の神経線維 伸長を促進することとその情報伝達には ERKシグナル経路が関係していることを 明らかにした。  今後とも､CNTと神経細胞の相互作用に ついて検討し、CNTの生体材料としての適 用の可能性について明らかにする予定で ある。  (平成21-22年度は、博士研究員の北滓 彩子、博士後期課程学生の松本光太郎、 博士前期課程学生の稲葉智史、三浦和典 および卒論生の幸田裕司、鏡石良太、植 木花梨が担当した) 2.幹細胞に関する研究  ES細胞やiPS 細胞は生体の種々の細胞 に分化することができる多謝吐幹細胞で ある。これらの細胞を目的とする細胞に 効率的に分化させることができれば、再 生医療における臓器移植や、医薬品のス クリーニング、薬剤投与量の検定などに 利用することが可能になる。我々は、マ ウスES細胞またはマウスiPS細胞培養液 に、ニワトリ8 日胚DRGの培養上清液  （DRG-CM）を添加することにより、特定 の細胞、とくに神経細胞と筋肉細胞への 分化誘導について検討した。 ２−１．マウスES細胞の神経細胞への分 化誘導  ES細胞は、培養液中で無限に増殖する ことができ、生体を構成するほぼ全ての 細胞種に分化する能力を持つ細胞株であ る。 しかし、ES細胞から自発的に神経細 胞に分化する細胞の割合は低いので、神 経細胞への分化を促進させる方法の確立 が望まれている。  そこで、ニワトリ８日胚のDRGにNGF を添加すると、DRGの分化が始まり神経線

維の伸長が促進されることから、DRGの培 養液中に神経細胞への分化を誘導させる 物質が分泌されるのではないかと考えら れた。本研究では、DRG-CMを培地中に添 加することによりES細胞を神経細胞に効 率良く分化誘導させる方法について検討 した。  DRG-CMを5%濃度になるように、未分 化状態のES細胞コロニーに添加したとこ ろ、約50%のEs細胞が神経細胞に分化す ることが明らかになった。これにより、 ニワトリ胚DRG-CM中にマウスES細胞を 神経細胞に分化を促進させる化学物質が 存在していることを初めて見出した。さ らに、ES細胞より分化した神経細胞の種 類について各種抗体を用いて検討した。 その結果、神経細胞に分化した細胞の約 50%が運動ニューロンに分化しているこ とが判明した。DRG は感覚ニューロンであ るので、感覚ニューロンの標的細胞にES 細胞が分化したことになる。また、残り の細胞の種類について調べたところ、大 部分が筋肉細胞に分化していた。すなわ ち、DRG神経細胞が培養上清液に分泌した 化学物質がES細胞を運動ニューロンと筋 肉細胞に優先的に分化誘導したことにな る。このことは、Es 細胞を特定の細胞に 分化誘導させる場合、目的の細胞の標的 細胞が培養上清液中に分泌する化学物質 を用いる方法が効果的であることを示唆 するものである。 2−2.マウスiPS細胞の神経細胞への 分化誘導  iPS細胞は、2006年にマウス胚繊維芽 細胞に４つの遺伝子（0ct3,腐Sox2, 研究室紹介 Klf4, c-苛句を導入することで樹立され た。iPS細胞はES細胞に類似した性質と 外見を示し、in vitroにおいて神経細胞 を含む様々な細胞に分化する能力を持っ ている。現在では肝細胞などの成体細胞 からのiPS細胞の樹立が報告されており、 受精卵を用いるES細胞に比べて倫理的な 問題が軽減される。さらに、疾患を持つ ヒトの細胞からiPS細胞を樹立すること で、疾患の原因解明や、創薬開発、再生 医療などに利用可能なツールとなること が期待されている。  iPS細胞の未分化状態維持の検討と DRG-CMに対する分化誘導効果をES細胞 の効果と比較した。その結果、iPS細胞コ ロニーはES細胞コロニーに比べて増殖速 度が早く、分化しやすいことが分かった。 DRG-CMで神経細胞に分化誘導させると、 感覚ニューロンと運動ニューロンに分化 したことから、ES 細胞とは分化した細胞 が異なった。このことは、実験に用いた iPS細胞が皮膚の繊維芽細胞由来である ことから感覚ニューロンに分化しやすい 傾向があったのではないかと考えられる。 今後、iPS 細胞の効率的な分化誘導方法に 関する研究を継続する予定である。  (平成21-22年度は、博士研究員の北年 彩子、博士前期課程学生の岩宮貴紘、原 優里菜、五十嵐恭子、三浦和典および卒 論生の渡辺善仁、上芝原佑が担当した) ３。稲わらともみ殻を用いたバイオエタ ノール生産の研究  草本系バイオマスである稲わらおよび もみ殻からのバイオエタノール生産につ いて検討した。これらの前処理として、

高温･高圧蒸気による蒸煮･爆砕処理法を  Bioeng., 110, 2, 238-241 (2010). 用いることにした。この蒸煮･爆砕処理法 の条件を最適化することにより､酵素分解 処理とエタノール発酵を効率的に行える プロセスを開発し､草本系バイオマスによ るエタノール生産の実用化に向けた研究 を行うことにした。爆砕処理は、本質材 料を高温・高圧蒸気下で、一気に大気圧 に開放して木質を繊維状にする方法であ り、通常のように強酸を使用しないため 環境調和型である。  種々の条件で蒸煮・爆砕処理した稲わ らおよびもみ殻からセルロース、ヘミセ ルロース、リグニンを分離した結果、ヘ ミセルロース分画として30%程度､セルロ ース分画として40-50%が抽出された。セ ルロース分画をセルラーゼ酵素分解した ところ、60-80%の分解率が得られた。今 後、組換え大腸菌などにより効率的なエ タノール生産方法を検討する予定である。  (平成21-22年度は、博士前期課程学生 の金谷直樹および卒論生の高橋逼、吉羽 悠介、小谷野健一が担当した) 4.平成21-22年度の発表論文等 ４−１．原著論文

1)Kotaro Matsumoto, Chie Sato, Yukie Naka, Raymond Whitby and Norio Shimizu:

Stimulation of neuronal neurite outgrowth using functionalized carbon nanotubes, Nanotechnology, 21ユ1,1-8(2010).

2)Ayako Kitazawa, Yukie Naka, Hiroko Yamaguchi and Norio Shimizu: Accumu-lation of neurons differentiated from

mouse embryonic stem cellsin particular areas of culture plate surface, J. Biosci．

４−２．国内学会一国内会議での発表･講 演 1）岩宮貴紘、原優里菜、北拝彩子、清 水範夫:DRG培養上清液添加によるマウス ES細胞から筋肉細胞への分化誘導、日本 農芸化学会2009年度大会、福岡、平成21 年３月29日（日） ２）山口博子、仲祐貴江、清水範夫：機 能性タンパク質で被覆した微小磁気ビー ズによる特定領域への神経細胞の固定化。 日本農芸化学会2009年度大会、福岡、平 成21年３月29日（日） 3）北洋彩子、清水範夫:NGF被覆微小磁 気ビーズによるマウスES細胞から分化し た神経細胞の特定領域への固定化、生命 科学部・理工学部生体医工学科 研究者 交流会、川越、平成21年７月25日（土） 4）松本光太郎、清水範夫：カーボンナ ノチューブと神経細胞との相互作用によ る神経線維伸長促進効果、生命科学部・ 理工学部生体医工学科 研究者交流会、 川越、平成21年７月25日（ﾕﾋ） 5）原優理菜、北拝彩子、岩宮貴紘、清 水範夫：脊髄後根神経節培養上清液によ るマウス胚性幹細胞からの筋肉細胞と神 経細胞への分化、第財回日本生物工学会 2009年度大会、名古屋、平成21年９月 24日（本） 6）松本光太郎、佐藤千恵、Whitby Raymond、 清水範夫：カーボンナノチューブが神経 細胞に及ぼす影響について、日本農芸化 学会2010年度大会、東京、平成22年３ 月29日（月） ７）松本光太郎、鏡石良太、植木花梨、

清水範夫：カーボンナノチューブの神経 細胞への取り込みと神経線維伸長への影 響、第２回生命科学部・理工学部生体医 工学科 研究者交流会、板倉キャンパス、 平成22年７月10 日（土） ８）稲葉智史、松本光太郎、清水範夫： グラファイトおよびカーボンナノチュー ブ含有基板がPC12h細胞の神経分化に及 ぼす影響、第２回生命科学部・理工学部 生体医工学科 研究者交流会、板倉キャ ンパス、平成22年７月10日（土） ９）三浦和典、松本光太郎、北滓彩子、 清水範夫：カーボンナノチューブの添加 によるマウス胚性幹細胞の神経細胞への 分化、第２回生命科学部・理工学部生体 医工学科 研究者交流会、板倉キャンパ ス、平成22年７月10日（土） ＴＯ）北滓彩子、上芝原佑、清水範夫： マウスiPS細胞とマウスES細胞の分化誘 導能の比較、第２回生命科学部・理工学 部生体医工学科 研究者交流会、板倉キ ャンパス、平成22年７月10日（土） 11）原優里菜、北洋彩子、清水範夫： マウス胚性幹細胞からの筋肉細胞への分 化誘導に関する研究､第２回生命科学部・ 理工学部生体医工学科 研究者交流会、 板倉キャンパス、平成22年７月10日（土） 1.2）五十嵐恭子、北滓彩子、松本光太 郎、清水範夫：マウス胚性幹細胞の分化 に及ぼす培養基板の影響、第２回生命科 学部・理工学部生体医工学科 研究者交 流会、板倉キャンパス、平成22年７月10 日（土） ］.3）松本光太郎、鏡石良太､植木花梨、 Raymond L. D. Whitby、清水範夫：カー ボンナノチューブの神経細胞への取り込 研究室紹介 みとERKシグナル経路の活性化、神経発 生研究の現在と未来、板倉キャンパス、 平成22年↓O月↓日（金） 1 4）三浦和典､原優里菜、松本光太郎、 北洋彩子、清水範未：ナノ物質の添加に よるマウス胚性幹細胞の神経細胞への分 化、神経発生研究の現在と未来、板倉キ ャンパス、平成22年10月り ］.5）五十嵐恭子、松本光太郎、北洋彩 子、清水範夫：マウス胚性幹細胞の分化 に及ぼす培養基板の影響、第62回日本生 物工学会2010年度大会、宮崎市、平成22 年10月QQ日（木） 1 6）三浦和典、松本光太郎、原優里菜、 北滓彩子、Raymond Ｌ. D. Whitby、清水 範夫：カーボンナノチューブの添加によ るマウス胚性幹細胞の神経細胞への分化、 第62回日本生物工学会2010年度大会、 宮崎市、平成22年10月28日（木） ４−３．国際学会一国際会議での発表･講 演

l）Ayako Kitazawa, Norio Shimizu: Differentiation of mouse induced pluripotent stem （iPS）cells into neurons, the 14th European Congress on Biotechnology, Barcelona, Spain, September 13-16, 2009.

2）Kotaro Matsumoto, Chie Sato, Raymond L. D. Whitby, Norio Shimizu:

Carbon nanotubes stimulate neurite outgrowths of neurons by activation of /APK/ERK signal transduction, the 14th European Congress on Bio-technology, Barcelona, Spain, Sep-tember 13-16, 2009.

3)Ayako Kitazawa, Norio Shimizu: Differentiation of mouse induced pluripotent stem cellsinto neurons by using DRG conditioned medium, 7thInternational Symposium on Bio-science and Nanotechnology, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan, November 20-21, 2009.

4)Kotaro Matsumoto, Chie Sato, Raymond L. Ｄ. Whitby, Norio Shi-mizu: Carbon nanotubes stimulate neurite outgrowths of neurons and enhance activation of ERK signaling pathway, ？^^ International Sympo' sium on Bioscience and Nanotech-nology, Bunkyo-ku, Tokyo, Japan, November 20-21, 2009.

5)Yurina Hara, Ayako Kitazawa, Takahiro Iwamiya, Norio Shimizu: Proportion of muscle cells and neu-rons differentiated from mouse embryonic stem cells using DRG conditioned medium, 1出 Interna-tional Symposium on Bioscience and Nanotechnology, Bunkyo-ku, 1[hkyo, Japan, November 20-2 1, 2009.

6]Ayako :Kitazawa and Norio Shimizu: Characterization of neurons differen-tiated from mouse iPS cells using conditioned medium of dorsal root ganglion, PACIFICHEM 2010, Hawaii, USA, December 15-20, 2010.

7)Kotaro Matsumoto, Chie Sato, Raymond L. Ｄ. Whitby and Norio

Shimizu: Carbon nanotube uptake of neurons stimulates neurite

out-growth by activation of ERK sig-naling pathway, PACIFICHEM 2010, Hawaii, USA, December 15-20,2010. 8）Yurina Hara, Ayako :Kitazawa and Norio Shimizu: Muscle cells differentiated from mouse embry-onic stem cells using DRG condi-tioned medium, PACIFICHEM 2010, Hawaii, USA, December 15-20,2010.

４−４．受賞

1）Poster Award, the 14* European Congress on Biotechnology, Barcelona, Spain, September 13-16, 2009, "Ayako Kitazawa, Norio Shimizu: Differentiation

of mouse induced pluripotent stem （iPS） cellsinto neurons"