タイムゲート法と光変換型蛍光タンパク質とを組み合わせた細胞内タンパク質局在過程の追跡

© 2020 The Japanese Society of Plant Morphology 27 はじめに

青色光受容体フォトトロピン（Phot）は，2つの青色光受 容ドメインと1つのキナーゼドメインを持つタンパク質で あり，光屈性や気孔開口，葉緑体定位運動などの光合成に 関わる現象を制御する（Huala et al. 1997 , Jarillo et al. 2001, Kagawa et al. 2001, Kinoshita et al. 2001, Sakai et al. 2001）． Photは主に細胞膜に局在し，細胞質やゴルジ体にも局在 することが報告されている．例えば，シロイヌナズナは2 種類の Phot（Atphot1 と Atphot2） を持っており，Atphot1 と Atphot2 は主に暗所で細胞膜に局在している．また， 青色光が照射された細胞では，細胞膜への局在以外に， Atphot1は細胞質で，Atphot2 はゴルジ体でも局在が確認 されている（Sakamoto and Briggs 2002, Kong et al. 2006 ）． さらに，シロイヌナズナの葉肉細胞では，Atphot1 と Atphot2が葉緑体外胞膜に局在することも観察されている （Kong et al. 2013）．Phot が細胞内の複数の場所に局在す ることは，シロイヌナズナだけでなく，他の植物種（エン ドウやトウモロコシ，ゼニゴケなど） においても報告され ているが（Gallagher et al. 1988, Knieb et al. 2004 , Kodama 2016 ），局在化の過程は不明のままであった．これを明ら かにするため，最近，著者らは，苔類ゼニゴケ（Marchantia polymorpha）を用いて，Phot（Mpphot）の細胞内局在に関す る詳細なイメージング解析を行った．黄色蛍光タンパク質 Citrineを用いたイメージングでは，無性芽の培養状態に よってMpphotの細胞内局在が変化することを明らかにし た．また，光変換型蛍光タンパク質Dendra2を用いたイメ ージングによって，Mpphotが細胞内を移動していること がわかった．さらに，時間分光法（タイムゲート法） を用 いて葉緑体の自家蛍光を回避することで，葉緑体周囲の蛍 光を正確に測定し，細胞内局在に関する新しい定量方法も 確立した．本稿では，タイムゲート法を用いた実験の一例 として，Mpphotの細胞内局在および細胞内移動に関する 研究を紹介する．なお，原著論文（Sakata et al. 2019）も参 照されたい． タイムゲート法を用いた葉緑体自家蛍光の完全回避 植物の葉緑体は光合成を行う重要な細胞小器官である． 葉緑体には光合成に関わる色素であるクロロフィルが含ま れており，それが高輝度の赤色自家蛍光を発するため，蛍 光タンパク質イメージング解析などを行う際の妨げになっ

PLANT MORPHOLOGY vol. 32 pp. 27-30 INVITED REVIEW

タイムゲート

_{法と光変換型蛍光タンパク質とを組み合わせた細胞内タンパク質局在}

過程の追跡

坂田桃子1, 2_，児玉豊1, 2 1_{宇都宮大学バイオサイエンス教育研究センター 〒321-8505 栃木県宇都宮市峰町350} 2_{東京農工大学大学院連合農学研究科 〒183-8509 東京都府中市幸町3-5-8} 要旨：葉緑体に含まれるクロロフィルは高輝度の自家蛍光を発するため，植物細胞において蛍光タンパク質などの外 来蛍光物質を観察する際の妨げになる．著者らは以前，タイムゲート法によって葉緑体の自家蛍光を完全に回避す ることで蛍光タンパク質イメージングが明瞭にできることを報告した．最近では，タイムゲート法を利用できる共 焦点レーザー顕微鏡と光変換型蛍光タンパク質を組み合わせて，苔類ゼニゴケにおいて青色光受容体フォトトロピン （Phot）_{が葉緑体周囲に局在する過程の追跡に成功した．本稿では，タイムゲート法を用いた研究の一例として，ゼニ} ゴケPhotの細胞内局在と細胞内移動に関する研究を紹介したい．

Tracking the subcellular protein localization process by combining the time-gated

method and photoconvertible fluorescence protein

Momoko Sakata1, 2, Yutaka Kodama1, 2

1 _{Center for Bioscience Research and Education, Utsunomiya University, Tochigi 321-8505, Japan}

2 _{United Graduate School of Agricultural Science, Tokyo University of Agriculture and Technology, Tokyo 183-8509, Japan}

Author for correspondence: kodama@cc.utsunomiya-u.ac.jp

Summary: hlorophyll within chloroplast emits high intensity auto uorescence, which interferes with the observation of exogenous uorescent substance such as uorescent protein in the plant cell. e previously reported that clear uorescence observation can be done by using the time gated method that eliminates the auto uorescence. ecently, we succeeded in tracking the subcellular localization process of the blue-light photoreceptor phototropin (Phot) to the chloroplast periphery in the liverwort Marchantia polymorpha by a combination of the confocal laser microscopy for the time-gated method and a photoconvertible uorescent protein. ere, as an example of the time gated uorescence imaging, we introduce a study about intracellular localization and movement of Phot in M. polymorpha.

© 2020 The Japanese Society of Plant Morphology 28 てしまう．そのため，植物の蛍光イメージング解析では， この自家蛍光をいかに回避するかが重要となる．以前，著 者らは，タイムゲート法を用いることで，ゼニゴケの葉緑 体の自家蛍光を完全に回避して蛍光タンパク質イメージン グができることを報告した（Kodama 2016 ）．タイムゲート 法は，ゼニゴケだけでなく，シロイヌナズナやタバコ，オ オカナダモなどの植物およびクラミドモナスなどの藻類 で蛍光観察する際に利用されている（Kodama 2016 , Osaki and Kodama 2017 , Atkins and Cross 2018, Yoshizumi et al. 2018）．タイムゲート法を用いた自家蛍光の完全回避の詳 細については，誌面の都合上，本稿では割愛するため，原 著論文（Kodama 2016 ）および和文解説（児玉 2019 ）を参照 していただきたい． ゼニゴケ無性芽の培養によるMpphotの細胞内局在変化 ゼニゴケ細胞において Mpphot の細胞内局在を詳細に イメージング解析するため，著者らは，黄色蛍光タンパ ク質 Citrine を融合した Mpphot（Mpphot-Citrine） をゼニ ゴケに形質転換した．Mpphot-Citrine の観察には，タイ ムゲート法が使用可能な共焦点レーザー顕微鏡（Leica 社 SP8X）を用いた．Mpphot-Citrine を発現しているゼニゴ ケの杯状体から採取した直後（0日齢） の無性芽細胞では， Mpphot-Citrineは細胞膜と細胞質に局在することが観察 された（図1A）．一方，杯状体から採取した後に寒天培地 上に播き，蛍光灯下で1日間培養した無性芽（1日齢）では， Mpphot-Citrineは細胞膜と葉緑体周囲に局在することが 確認された（図 1B）．Mpphot-Citrine の局在変化（細胞質 局在および葉緑体周囲局在） を定量するために，Cyt/CP ratioと名付けた定量方法を開発した（図2）．Cyt/CP ratio の算出には，細胞質（Cyt） と葉緑体周囲（CP） のCitrine蛍 光強度を測定し，Cyt蛍光とCP蛍光の比を計算する（図2）． タイムゲート法によって葉緑体の自家蛍光を完全に回避で きるようになったため，葉緑体周囲のCitrine蛍光強度の 測定は高精度である．理論的には，Mpphot-Citrineが細胞 質だけに局在していれば，Cyt 蛍光と CP 蛍光の値が同程 度となり，Cyt/CP ratioの値が約1となる（図2）．一方で， 葉緑体周囲に局在すると，Cyt 蛍光の値が CP 蛍光に対し て小さくなるため，Cyt/CP ratio の値が 1 以下となる（図 2）．もし，Mpphot-Citrine が細胞質から消失して葉緑体 周囲だけに局在すれば，Cyt蛍光の値が0となり，Cyt/CP ratioの値は0となる．計測の結果，未培養の無性芽におけ るCyt/CP ratioの値は1に近いのに対して，培養した無性 芽における値は0 に近くなった．この定量結果によって， Mpphot-Citrineは，未培養の無性芽では細胞質に局在し， 培養した無性芽では葉緑体周囲に局在することが示された． Cyt/CP ratioを用いて，局在性が細胞質から葉緑体周囲に 変化する時間やMpphotの青色光受容ドメインやキナーゼ ドメインの関与についても定量的な解析を行うことができ た．Mpphotの局在変化は，暗黒で1日培養しても起こるが， 青色光照射下で促進し，その促進にはMpphotの青色光受 容やキナーゼ活性が関与することがわかった． 光変換型蛍光タンパク質 タイムゲート法と Citrine蛍光タンパク質を用いた実験 から，無性芽の培養の前後でMpphot の細胞内局在が 細 胞質と細胞膜 から 葉緑体周囲と細胞膜 に変化すること が明らかになった．しかし，単色の蛍光タンパク質（Citrine） を用いたイメージングでは，無性芽の培養後にMpphotが 細胞質や細胞膜から移動して葉緑体周囲に局在しているの か，それとも培養後に新規に翻訳されたMpphotが葉緑体 周囲に局在するのか，を区別できなかった．そこで著者ら は，光変換型蛍光タンパク質を使用することにした．刺激 図1 共焦点レーザー顕微鏡によるゼニゴケ無性芽細胞の蛍光画像． （A）未培養の無性芽細胞（0日齢），（B）培養した無性芽細胞（1日齢）， Bars = 10 µm． 〰 図2 Cyt/CP ratio の測定方法．四角内の平均蛍光強度を細胞質 （Cyt）の値とし，赤線上で計測した蛍光強度から葉緑体周囲（CP） の値を得た．Cyt/CP ratioを用いると，グラフのように，細胞質 局在は値が1に近くなり，葉緑体周囲局在では0に近くなる． 〰〰 〰〰〰〰〰〰

© 2020 The Japanese Society of Plant Morphology 29 によって蛍光特性の変化する蛍光タンパク質には，ある特 定波長の光を照射することによって，蛍光が現れる光活 性型蛍光タンパク質（例：PA-GFP） や色が変化する光変換 型蛍光タンパク質（例：EosFP, Dendra2）などがある．著者 らは，細胞内におけるMpphotの局在過程を追跡するため に，紫外線や青色光を照射すると蛍光が緑色から赤色に不 可逆的に変換するDendra2（Gurskaya et al. 2006 ）を用いる ことにした（図3 ）．Dendra2は哺乳類の培養細胞でよく用 いられており，例えば， −アクチンや −チューブリンに Dendra2を融合し，培養細胞内での挙動が時空間的に追跡 されている（Baker et al. 2010， Dovas et al. 2011）．植物で も使用例があり，オーキシントランスポーターのPIN2タ ンパク質にDendra2を融合し，シロイヌナズナの根におけ る PIN2 のターンオーバーについて解析されている（Jásik et al. 2013 ）． Mpphotの細胞内移動 葉緑体周囲へのMpphotの局在過程を追跡するため，光 変換型蛍光タンパク質Dendra2とMpphotの融合タンパク 質（Mpphot-Dendra2） をゼニゴケで発現させた．まず，0 日齢の無性芽で細胞質に局在しているMpphotの挙動を調 べるため，Mpphot-Dendra2を発現しているゼニゴケの無 性芽を採取した直後に観察を始めた．0日齢の無性芽にお けるMpphot-Dendra2は光変換されていないため，緑色蛍 光（以後，緑色Dendra2） が細胞質と細胞膜に観察された． 細胞質の一部分に共焦点レーザー顕微鏡で紫外線を照射 し（図4A），Mpphot-Dendra2（緑色Dendra2）の緑色蛍光を 赤色蛍光（以後，赤色Dendra2）に変換しながら，次々に生 産される赤色Dendra2をタイムラプス観察で追跡した（図 4B, C）．細胞質への紫外線照射を始めてから10分後，赤 色Dendra2の蛍光が細胞膜で増加した（図4D）．これらの 結果から，細胞質に局在しているMpphot-Dendra2は，細 胞膜に移動することがわかった．次に，細胞膜に局在す る Mpphot の挙動を調べることにした．Mpphot-Dendra2 を発現しているゼニゴケの無性芽を杯状体から採取 し，寒天培地上に播いた後，蛍光灯下で 1 日間培養した （_{図 5A）．蛍光灯には青色光が含まれているため，緑色} Dendra2は赤色 Dendra2 に変換され，1 日間の培養後には Mpphot-Dendra2 （赤色Dendra2） が葉緑体周囲と細胞膜に 局在していた（図5B）．その後，暗黒下で培養しながら赤 色Dendra2の蛍光をタイムラプス観察で追跡した（図5C）． 暗黒下では，新規の赤色Dendra2は生産されない．培養を 始めてから2時間後，細胞膜の赤色Dendra2の蛍光が低下 し，葉緑体周囲の赤色Dendra2の蛍光が増加した（図5D）． 図3  光変換型蛍光タンパク質Dendra2の光変換に関する模式図． 紫外線や青色光が照射されたDendra2は，不可逆的に，緑色から 赤色に変換される． 図4 細胞質に局在するMpphot-Dendra2の追跡実験．（A） 細胞質 の点線内に紫外線を照射した．（B） 紫外線照射によって，細胞質 の一部分の緑色Dendra2が赤色Dendra2に変換された．（C）共焦点 レーザー顕微鏡でタイムラプス観察を行い，赤色Dendra2を追跡 した．（D）観察後，細胞膜に赤色Dendra2が観察された． 図5 細胞膜に局在するMpphotの追跡実験．（A） 青色光を含む蛍 光灯下で無性芽細胞を1日間培養した．（B） 青色光照射によって， 細胞膜と葉緑体周囲に赤色 Dendra2が観察された．（C） 暗黒下で 培養することで，新たな赤色Dendra2を生産できないようにした． （D） 2時間の培養後，細胞膜の赤色Dendra2は減少し，葉緑体周囲 の赤色Dendra2が増加した．

© 2020 The Japanese Society of Plant Morphology 30 細胞膜の一部に紫外線を照射した後にMpphot-Dendra2（赤 色Dendra2）を追跡した場合でも，同じ結論を得ている（未 発表データ）．まとめると，ゼニゴケの無性芽細胞では， Mpphotが細胞質から細胞膜に移動し，その後，細胞膜 から葉緑体周囲へと移動していることが明らかとなった． Dendra2蛍光の観察でもタイムゲート法を用いており，葉 緑体の自家蛍光を完全に回避することによって，葉緑体周 囲のMpphot-Dendra2（赤色Dendra2） の蛍光を高精度に解 析する事ができた． おわりに 本稿では，タイムゲート法を用いた実験の具体例として， Photの細胞内移動に関する研究を紹介した（Sakata et al. 2019 ）．これまで，Photの細胞内局在については多くの研 究が行われてきたが，著者らの研究によって，葉緑体周囲 への局在が細胞内移動によるものであることが初めて明ら かとなった．技術的に大きく飛躍した点は，タイムゲート 法を用いることで葉緑体の自家蛍光を完全に回避し，葉緑 体周囲の蛍光を正確に検出して測定することができたこと である．タイムゲート法による葉緑体自家蛍光の回避技術 は，植物蛍光イメージングを高精度化するものであり，植 物研究にとって極めて強力な実験ツールと思われる．本稿 の研究では，タイムゲート法と光変換型蛍光タンパク質を 組み合わせることで，Mpphotが葉緑体周囲に局在する過 程を明らかにできた．しかし，移動の分子メカニズムにつ いては不明なままであるため，今後は，タイムゲート法を 駆使しながら，分子メカニズムを詳細に解析していきたい． 引用文献

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