第 10 回国際交流奨励賞（橋本賞）受賞者論文
論文種目：技術
リン酸化プロテオミクス情報を活用した Phos-tag SDS-PAGE による
MEK1
リン酸化種の解析
木下英司 *・木下恵美子・小池 透
広島大学大学院医歯薬保健学研究科医薬分子機能科学研究室 （受付 2016 年 12 月 8 日，受理 2017 年 1 月 10 日）SUMMARY
MEK1, a chief component of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, is phosphorylated during acti-vation of the pathway; 12 phosphorylation sites have been identified in human MEK1 by MS-based phosphoproteom-ic methods. By using Phos-tag SDS-PAGE, we found that multiple variants of MEK1 with different phosphorylation states are constitutively present in typical human cell lines. The Phos-tag-based strategy, which makes effective use of existing information on the location of phosphorylation sites (phosphoproteomic data), permits quantitative time-course profiling of MEK1 phosphospecies in their respective phosphorylation states. By subsequent immuno-blotting with an anti-HaloTag antibody, we analyzed a HaloTag-fused MEK1 protein and 12 potential phosphoryla-tion-site-directed mutants of the protein transiently expressed in HEK 293 cells. This strategy revealed that MEK1 is constitutively and mainly phosphorylated at the Thr-292, Ser-298, Thr-386, and Thr-388 residues in vivo, and that combinations of phosphorylations at these four residues produce at least six phosphorylated variants of MEK1. Like the levels of phosphorylation of the Ser-218 and Ser-222 residues by RAF1, which have been well studied, the phosphorylation statuses of Thr-292, Ser-298, Thr-386, and Thr-388 residues vary widely during activation and deactivation of the MAPK pathway. The Phos-tag-based strategy, which effectively uses phosphoproteomic data, per-mits qualitative and quantitative time-course profiling of intact MEK1 phosphospecies molecules in their respective phosphorylation states without loss of information about the molecular masses of the protein species. This combined study involving a Phos-tag-gel-based approach and existing phosphoproteomic data previously obtained by MS-based phosphoproteomic methods has shed new light on the phosphorylation dynamics of MEK1.
Key words: HaloTag, MAPK pathway, MEK1, PhosphoSitePlus, Phos-tag SDS-PAGE
序 論 タンパク質のリン酸化反応は重要な翻訳後修飾であり， これによりその活性は時空間的に厳密に制御される．この 制御が破綻すると，ヒトにおいては癌や神経変性疾患等の 多くの疾病が発症することがよく知られている．よって， タンパク質のリン酸化状態を解析し，その機能を理解する ことは，疾病の原因究明，治療薬の開発，個別化治療に とって極めて重要である．近年，プロテオミクスの進展に 伴って，質量分析によって得られた多くのタンパク質翻訳 後修飾に関する情報が蓄積されてきている1）．それらの情 報は膨大で網羅的ではあるが，個々のタンパク質の生体内 での修飾状態を完全にフォローするものではない．本研究 では，プロテオミクス的手法によって明らかにされたタン パク質のリン酸化部位が，生細胞ではどのような状態にお いてどのくらいの割合でリン酸化しているのかを解析する ことを目的とした． 私たちは，リン酸基を特異的に捕捉する分子，Phos-tag を用いたリン酸親和電気泳動法，Phos-tag SDS-PAGE を利 用して，細胞内の情報伝達に関わるタンパク質のリン酸化 状態を解析している2–5）．本電気泳動法により細胞抽出液 を分離し，特定のタンパク質のウェスタン解析を行うと，
Phos-tag SDS-PAGE methodology that effectively uses phosphoproteomic data for profiling the phosphorylation dynamics of MEK1 Eiji Kinoshita, Emiko Kinoshita-Kikuta, Tohru Koike
Department of Functional Molecular Science, Institute of Biomedical and Health Sciences, Hiroshima University
* Corresponding author: Eiji Kinoshita; Department of Functional Molecular Science, Institute of Biomedical and Health Sciences, Hiroshima University, Kasumi 1-2-3, Hiroshima 734-8553, Japan
E-mail: kinoeiji@hiroshima-u.ac.jp
4．HaloTag MEK1 の HEK293 細胞における発現とその
リン酸化状態の解析
pFN21AE0668及 び そ の 塩 基 置 換 プ ラ ス ミ ド は， Promega 社 の FuGENE HD Transfection reagent を 用 い て HEK293 細胞にトランスフェクションした．24 時間 後に SDS-PAGE 用サンプル溶解液を用いて細胞を溶解 し，SDS-PAGE とその後の抗 HaloTag 抗体を用いたウェス タン解析によって，HaloTag MEK1 の一過性発現を確認し た．その細胞溶解液を Phos-tag SDS-PAGE とウェスタン 解析により分離検出し，HaloTag MEK1 リン酸化種の解析 を行った． 結 果 1．細胞内在性 MEK1 のリン酸化状態の解析 A431，HeLa，HEK293 各 細 胞 株 の 内 在 性 MEK1 は 通 常状態で Phos-tag SDS-PAGE で検出される泳動バンドは 複数あり，複数のリン酸化状態下にあるリン酸化種が少 なくとも 6 つ存在することがわかった（Fig. 1A 左，レー ン 0 min，#1–7 のバンド）．EGF 刺激により S218/S222 が 同時にリン酸化され，活性型 MEK1 になることが知られ ているが7, 8），EGF 刺激後において #8 と 9 で示した位置 に新たなバンドが現れた．これらのバンドは抗 pMEK1/2 （S218/S222）抗体と交差性を示した（Fig. 1A 右）．また， 通常状態（レーン 0 min）で検出されたバンドの強度比も EGF刺激後に変動した．このことから，MEK1 活性化・ 脱活性化の過程において S218/S222 のリン酸化状態だけ でなく，他の複数のリン酸化部位のリン酸化状態も変動 し，それに伴って生じる複数のリン酸化種の存在比もその 過程で大きく変動していることがわかった．抗体が市販さ れ，既によく研究されているリン酸化部位に関しては，部 位特異的な抗リン酸化抗体を用いることで，そのリン酸化 状態の変動を追跡することは容易である．しかしながら， 抗リン酸化抗体を用いた従来の方法では，標的とするタン パク質分子全体のリン酸化状態を一度に捉えることができ ない．この実験結果は，Phos-tag SDS-PAGE が標的タンパ ク質の経時的リン酸化ダイナミクスのプロファイリングを 可能にすることを示している．一方，Phos-tag を使用しな い従来の SDS-PAGE（Phos-tag-free SDS-PAGE）において は，EGF 刺激前後において，MEK1 のバンドシフトは全 く見られず，いずれのレーンにおいてもほぼ同一の密度の MEK1バンドが確認できた（Fig. 1B）． した．既に明らかにされ，データベース（PhosphoSitePlus, http://www.phosphosite. org/homeAction.do）に登録されて いる MEK1 の 12 箇所のリン酸化部位をアラニン置換した 変異体を作製し，Phos-tag SDS-PAGE によるそれらの分離 パターンを野生型のそれと比較解析を行った．これにより， あるリン酸化状態下にあるリン酸化種，並びにそのリン酸 化種に含まれるリン酸化部位を同定することができる．本 研究は，プロテオミクス情報を個々のタンパク質の解析に 活用することで，プロテオミクスのみでは得られない情報 を得ようとする試みである6）． 方 法 1．Phos-tag SDS-PAGE とブロッティング Phos-tag SDS-PAGEに お け る 分 離 ゲ ル の 組 成 は， 357 mM Bis-Tris–HCl（pH 6.8），6 ％（w/v） ポ リ ア ク リ ルアミド，25 μM Phos-tag アクリルアミド，50 μM ZnCl2 とし，濃縮ゲルの組成は 357 mM Bis-Tris–HCl（pH 6.8）， 4％（w/v）ポリアクリルアミドとした．それぞれのゲルは TEMEDと過硫酸アンモニウムを添加して重合した．泳動 緩衝液は 100 mM Tris，100 mM MOPS，0.1％（w/v）SDS， 5 mM NaHSO3とした．1 レーンあたり約 20 μg のタンパ ク質量になるようにアプライして，ゲル 1 枚当たり 40 mA の定電流で 85 分電気泳動を行った．PVDF 膜へのブロッ ティングはタンク式のブロッティング装置を用いた． 2．細胞内在性 MEK1 のリン酸化状態の解析 A431，HeLa，HEK293 各細胞株の通常状態のもの，あ るいは上皮増殖因子（EGF, 100 ng/mL）の刺激を与えたも のを SDS-PAGE 用サンプル溶解液を用いて溶解した．溶 解液は Phos-tag SDS-PAGE で分離し，抗 MEK1 抗体，あ るいは抗 pMEK1/2（S218/S222），pMEK1（pT292, pS298, pT386）抗体（部位特異的抗リン酸化抗体）を用いてウェ スタン解析を行った．
3．Flexi HaloTag ベクターにクローニングされた MEK1
遺伝子上の部位特異的塩基置換
Flexi HaloTagベクターにヒト MEK1 遺伝子がクロー ニ ン グ さ れ た プ ラ ス ミ ド pFN21AE0668 を Promega 社 よ り 購 入 し た．Cell Signaling Technology（CST） 社 の PhosphoSitePlusを参照し，MEK1 のセリン，スレオニン 及びチロシンのリン酸化部位 12 カ所（S72，S212，S218， S222，S231，T286，T292，S298，Y300，S385，T386， T388）について，pFN21AE0668 を鋳型とし，変異導入用
ニン置換し，Phos-tag SDS-PAGE における泳動バンドの 分離パターンを調べた．ゲノム上の塩基置換は煩雑なた め，ヒト MEK1 が HaloTag 融合タンパク質として細胞内 で一過性発現するようにクローニングされたプラスミド pFN21AE0668を用い，抗 HaloTag 抗体によって検出した． HaloTag MEK1は 7 本のバンドとして検出され（Fig. 2A， WT）， そ の バ ン ド パ タ ー ン は 内 在 性 MEK1 と 類 似 し 2．HaloTag MEK1（野生型）とその変異体を用いた MEK1 リン酸化種の解析 細胞内 MEK1 のリン酸化状態に寄与するリン酸化部位 を同定した．CST 社の PhosphoSitePlus では，種々のタ ンパク質のリン酸化部位情報が提供されており，ヒトの MEK1では 12 カ所のセリン，スレオニン及びチロシン がリン酸化部位とされている．これらのそれぞれをアラ
Fig. 1 Endogenous MEK1 phosphorylation in A431, HeLa, or HEK293 cells stimulated with EGF, analyzed by using Phos-tag SDS-PAGE or conventional (Phos-tag-free) SDS-SDS-PAGE followed by immunoblotting. (A) The time course of MEK1 phosphorylation after stimulation with EGF (100 ng/mL) for 0–300 min was analyzed by using Zn2+–Phos-tag SDS-PAGE (6.0% w/v polyacrylamide
and 25 μM Zn2+–Phos-tag) followed by immunoblotting with anti-MEK1 antibody (left panels) or anti-pMEK1/2 (Ser-218/Ser-222)
antibody (right panels). (B) The same samples were analyzed by using Phos-tag-free SDS-PAGE followed by immunoblotting with anti-MEK1 antibody. Reprinted with permission from Ref. 6 © (2016) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.
ンドパターンと非常に類似していた．この結果から，内在 性 MEK1 についても T292，S298，T386，T388 の 4 つの アミノ酸が恒常的にリン酸化し，それらのリン酸化残基の 組み合わせによって少なくとも 6 つのリン酸化種が細胞内 において恒常的に存在することが予想された．このことを 確認するため，上記の 4 つのアミノ酸のうち市販化され ている 3 つの部位特異的抗リン酸化 MEK1 抗体（pT292, pS298, pT386）を用いて Phos-tag SDS-PAGE による分離後 の内在性 MEK1 リン酸化種の解析を行った（Fig. 3 上段）． その結果，pT292 抗体と交差性を示した内在性 MEK1 リ ン酸化種のバンドは #3，4，7 であり，これは HaloTag MEK1を用いた解析で同定したリン酸化種とすべて一致し た．同様に，pS298 抗体と交差性を示した内在性リン酸化 種のバンドは #5，6，7 であり，pT386 抗体と交差性を示 した内在性リン酸化種のバンドは #2，4，6 であった．こ れらの結果は HaloTag MEK1 を用いた解析結果とすべて同 じであった．以上のことから，内在性 MEK1 においても た（Fig. 1A 左，レーン 0 min を参照）．T292A，S298A，
T386A，T388A の各変異体以外は WT と同様に 7 本のバ ンドが検出されたが，それら 4 種の変異体では，矢印で示 したバンドが消失した．このことから，MEK1 の恒常的 なリン酸化に寄与するのはそれら 4 つのアミノ酸（T292， S298，T386，T388）であると考えた．4 つのアミノ酸の うち複数のアミノ酸を同時にアラニン置換した 11 種の変 異体のバンドパターン（Fig. 2A，下段）の結果も合わせて， 6本のシフトアップバンド（#2–7）のそれぞれのリン酸 化種がどのリン酸化アミノ酸を含んでいるのかを決定した （Fig. 2B）． 3．部位特異的抗リン酸化抗体を用いた細胞内在性 MEK1 リン酸化種の評価 上述したように，Phos-tag SDS-PAGE によって，細胞内 に発現させた野生型の HaloTag MEK1 は 7 本のバンドと して検出され，そのバンドパターンは内在性 MEK1 のバ
Fig. 2 Profiling of HaloTag-fused MEK1 phosphorylation expressed in HEK 293 cells using Phos-tag SDS-PAGE followed by immuno-blotting. (A) A HaloTag-fused MEK1 protein (WT) and 23 mutants expressed in HEK 293 cells were analyzed by using Zn2+
–Phos-tag SDS-PAGE (5.5% polyacrylamide w/v and 25 μM Zn2+–Phos-tag) followed by immunoblotting with anti-HaloTag antibody. (B)
Phosphorylation sites responsible for each band are summarized. Reprinted with permission from Ref. 6 © (2016) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.
分以内），やがて消失する．これは以前の報告と矛盾しな い3）．また，#5 のバンドに相当する S298 残基がリン酸化 されたモノリン酸化種は，活性型リン酸化種の出現に伴い， その存在比がいずれの細胞株においても劇的に減少する． S298残基のリン酸化は MEK1 の活性化に必須であると報 告されている9, 10）．したがって，#5 のモノリン酸化種は 活性型リン酸化種を産生するために MEK1 の上流シグナ ル分子である RAF1 の基質として優先的に使用される可能 性が示唆された．これに対して，リン酸化 T386 を含むリ ン酸化種（特に #2 のバンド）は，活性型リン酸化種の出 現に伴い，その存在比がいずれの細胞株においても増大 する．T386 残基のリン酸化は，T292 残基のリン酸化と共 に，MEK1 の活性化を抑制するための ERK によるフィー ドバック制御に関係しているとの報告があり11, 12），今回の MEK1リン酸化ダイナミクスのプロファイリングの結果 はそれと矛盾しない．さらには，EGF 刺激前後の過程に おいて，#3 のバンドに相当する T292 残基がリン酸化さ れたモノリン酸化種は，いずれの細胞株においてもほとん ど変動しなかった．これについても，MEK1 の活性化を 調節するためのフィードバック制御機構の 1 つとしての可 能性が示唆され，大変興味深い．これら各リン酸化種の機 能については，今後のさらなる研究展開が期待される． 考 察 これまでに MEK1 の活性化型において S218/S222 がリ ン酸化されることはよく知られていたが，Phos-tag SDS-PAGEによって，それらの部位以外のアミノ酸が恒常的に T292，S298，T386，T388 の 4 つの主なアミノ酸が恒常的 にリン酸化し，それらのリン酸化残基の組み合わせによっ て少なくとも 6 つのリン酸化種が細胞内において恒常的に 存在することが証明された．なお，いずれの部位特異的抗 リン酸化抗体においても活性型リン酸化種である #8 と 9 のバンドが交差性を示すことから，これらの 2 つの活性型 リン酸化種は少なくとも T292，S298，T386 の 3 つのリン 酸化部位を含んでいることが示唆された．また，以上の結 果から，EGF 刺激前後の MEK1 活性化・脱活性化の過程 において S218/S222 のリン酸化状態だけでなく，他の複数 のリン酸化部位のリン酸化状態も変動し，それに伴って生 じる 6 つのリン酸化種の存在比もその過程で大きく変動し ていることが証明された．一方，Phos-tag を使用しない従 来 の SDS-PAGE（Fig. 3 下 段，Phos-tag-free SDS-PAGE） においても，EGF 刺激前後において，MEK1 のバンドの 密度に差は見られたが，それぞれのリン酸化アミノ酸が含 まれるリン酸化種に関する情報については得ることはでき なかった． 4．細胞内在性 MEK1 のリン酸化ダイナミクス 上記のように，細胞内において恒常的に存在する 6 つ の MEK1 リン酸化種と 2 つの活性型リン酸化種を同定す ることに成功した．最後に，Fig. 1A で示された EGF 刺激 前後の過程における 9 つの MEK1 泳動バンドの存在比の 変動を各細胞株においてデンシトメトリーにより分析した （Fig. 4）．その結果，いずれの細胞株においても，2 つの 活性型リン酸化種は EGF 刺激後の早い段階に出現し（10
Fig. 3 Mapping of phosphorylation sites in the respective upshifted migration bands of endogenous MEK1 by immunoblotting with site-specific phosphorylated MEK1 antibodies. The time course of MEK1 phosphorylation in HEK 293 cells after stimulation with EGF (100 ng/mL) for 0–10 min was analyzed by using Zn2+–Phos-tag SDS-PAGE (6.0% w/v polyacrylamide and 25 μM Zn2+
–Phos-tag) followed by immunoblotting with the anti-MEK1 antibody and site-specific phosphorylated MEK1 antibodies against the phosphorylated Thr-292 residue (pT292), phosphorylated Ser-298 residue (pS298), and phosphorylated Thr-386 residue (pT386). We also confirmed that changes occurred in the phosphorylation levels of the three residues of MEK1 in the same samples by using Phos-tag-free SDS-PAGE followed by immunoblotting with the three site-specific phosphorylated MEK1 antibodies. Reprinted with permission from Ref. 6 © (2016) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.
Fig. 4 Changes in relative abundance ratios of multiple endogenous MEK1 species before and after EGF stimulation. Densitometric analyses of migration bands #1 to #9 shown in Fig. 1 were performed. The ratios (%) of bands at given incubation times are rep-resented as averages of three independent experiments using the same sample. Reprinted with permission from Ref. 6 © (2016) Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.
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リン酸化されていることを明らかにした．さらには，恒常 的に存在する MEK1 リン酸化種がその活性化・脱活性化 に伴ってダイナミックに変動することもわかった．また， Phos-tag SDS-PAGEだけでは，恒常的なリン酸化に寄与す るアミノ酸を特定できないが，プロテオミクス情報を活用 して候補アミノ酸をアラニン置換し，それらを同定するこ とができた．個々のタンパク質の生化学的な研究は，プロ テオミクスとは対極にあるように考えられるが，互いに活 用しあって新たな知見を得たことは非常に有意義である． 今後，多くのタンパク質について蓄積されたプロテオミク ス情報を活用して Phos-tag SDS-PAGE による解析を行い， 新たな情報を得たいと考えている． 謝 辞 本研究を通して，東京大学医科学研究所の武川睦寛先生， 久保田裕二先生には有意義なご助言をいただきましたこと， 深く感謝申し上げます．本研究の一部は，東京大学医科学 研究所共同利用・共同研究拠点，平成 28 年度共同研究助 成をいただいて実施しました． 本論文に関して開示すべき利益相反状態は無い． 文 献
1) Kimura Y, Toda T, Hirano H. ModProt: a database for inte-grating laboratory and literature data about protein post- translational modifications. J Electrophoresis. 2016;60:1–4. 2) Kinoshita E, Kinoshita-Kikuta E, Takiyama K, et al.
Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol Cell Proteomics. 2006;5:749–757.
