〔 技 術 資 料 〕
狂 犬 病 組 織 培 養 不 活 化 ワ ク チ ン の 力 価 試 験 用 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト
No.4 の
有 効 性 確 認
田 村 直 也 、 飯 田 将 行 、 堀 内 雅 之 、 荒 尾 恵 、 石 丸 雅 敏 、 安 田 博 美 1 （ 平 成 27 年 8 月 11 日 受 付 、 平 成 27 年 11 月 27 日 受 理 ） 1 株 式 会 社 微 生 物 化 学 研 究 所 〔TECNICAL REPORT〕Validity of Reference Vaccine(Lot No. 4) for Potency Test of Tissue Culture Inactivated
Rabies Vaccine
Naoya TAMURA, Masayuki IIDA, Noriyuki HORIUCH, Megumi ARAO, Masatosihi ISHIMARU, Hiromi YASUDA1
National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, 1-15-1 Tokura, Kokubunji-Shi, Tokyo,185-8511 Japan
(Received: 11th August 2015, Accepted: 27th November 2015) 1 Kyoto Biken Laboratories,Inc.
Abstract
A reference vaccine for a potency test of a tissue culture inactivated rabies vaccine was used as an index for measuring the effective antigen concentration of test vaccines using the sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). In this study, the efficacy of different concentrations of the new reference vaccine was examined.
All test concentrations of the new reference vaccine induced neutralizing antibody titers that exceeded 1:10 three months after immunization of dogs. In mice, the effective dose and international unit in NIH potency test of the new reference vaccine ,dissolved in 8.0 ml, were 162.5 ED50and 3.08 IU/ml, respectively. As a result of comparing the titer with the present reference vaccine by ELISA using the sample which dissolved the new reference vaccine to become 1 IU/ml from the results of the the National Institutes of Health(NIH) potency test, the relative titer of this sample was approximately 1:1.
These results indicate that the new reference vaccine will induce sufficient neutralizing antibody titers in dogs to protect them against rabies for up to 1 year. In addition, the results showed that the new reference vaccine should be diluted 3.08 times after dissolution in 8.0 ml to give an antigen value equivalent to the present reference vaccine.
要 旨
狂 犬 病 組 織 培 養 不 活 化 ワ ク チ ン の 力 価 試 験 用 参 照 ワ ク チ ン （ 参 照 ワ ク チ ン ） は 、 サ ン ド イ ッ チ ELISA に よ り 被 検 狂 犬 病 ワ ク チ ン 中 の 有 効 抗 原 量 を 相 対 的 に 測 定 す る 際 の 指 標 と し
て 用 い ら れ て い る 。 今 回 、 新 た に 製 造 し た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 の 有 効 性 を 検 討 し た 。 犬 に お け る 接 種 後 3 ヶ 月 目 の 全 て の 試 験 群 で 10 倍 以 上 の 中 和 抗 体 価 が 認 め ら れ た 。8.0 ml に 溶 解 し た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 の マ ウ ス に お け る 有 効 量 は 162.5 ED で あ り 、 NIH 法 に50
よ る 力 価 は 3.08 IU/ml で あ っ た 。 NIH 法 で 得 ら れ た 成 績 か ら 1 IU/ml と な る よ う に 調 整 し た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 の 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 3 に 対 す る ELISA に よ る 相 対 力 価 は お よ そ 1 で あ っ た 。 以 上 の 試 験 に よ り 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 は 、 犬 に 対 し て 1 年 間 の 感 染 防 御 が 可 能 な 抗 体 を 賦 与 で き る も の と 推 察 さ れ た 。 ま た 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 を 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 3 と 同 等 の 抗 原 量 に 調 整 す る に は 、 8.0 ml で 調 整 後 、 3.08 倍 希 釈 す る こ と が 適 当 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 緒 言 狂 犬 病 組 織 培 養 不 活 化 ワ ク チ ン （ 狂 犬 病 ワ ク チ ン ） の 力 価 試 験 用 参 照 ワ ク チ ン （ 参 照 ワ ク チ ン ） は 、 動 物 用 生 物 学 的 製 剤 基 準 （ 動 生 剤 基 準 ）（ 農 林 水 産 省 2002） に 規 定 さ れ た サ ン ド イ ッ チ ELISA（ ELISA） に よ り 被 検 狂 犬 病 ワ ク チ ン 中 の 有 効 抗 原 量 を 相 対 的 に 測 定 す る 際 の 指 標 と し て 用 い ら れ る 。 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 は 、 財 団 法 人 化 学 及 血 清 療 法 研 究 所 （ 化 血 研 ）が 平 成 14 年 6 月 に 製 造 し た も の で 、狂 犬 病 ワ ク チ ン と し て の 有 効 性 に つ い て は 、 犬 に 対 し て 少 な く と も 1 年 間 の 感 染 防 御 が 可 能 な 抗 体 価 を 賦 与 で き る も の で あ る こ と 、 モ ル モ ッ ト を 用 い た 力 価 試 験 法 （ モ ル モ ッ ト 法 ） で 試 験 群 の 耐 過 率 70 ％ 以 上 で あ る こ と 及 び マ ウ ス を 用 い た 力 価 試 験 （NIH 法 ） で 2.81 国 際 単 位 （ IU） を 示 す こ と に よ り 確 認 さ れ て い る （ 小 林 ら 2003）。 こ れ ま で 凍 結 乾 燥 品 で あ る 参 照 ワ ク チ ン の 保 存 安 定 性 に つ い て は 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 を 用 い て 経 時 的 な 確 認 を 行 い 製 造 後 10 年 ま で は 安 定 で あ る こ と が 確 認 さ れ て い る 。 し か し な が ら 、 参 照 ワ ク チ ン の 最 終 的 な 有 効 期 間 は 不 明 で あ り 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 の 保 存 年 数 が 9 年 を 超 え た こ と か ら 、 品 質 の 確 か な 参 照 ワ ク チ ン を 供 給 す る 目 的 で 化 血 研 が 平 成 23 年 5 月 に 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 を 製 造 し た 。 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 に つ い て 、 犬 に お け る 抗 体 応 答 試 験 及 び NIH 法 に よ り 狂 犬 病 ワ ク チ ン と し て の 有 効 性 確 認 を 行 っ た 。 ま た 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 と 同 等 な 抗 原 量 と な る 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 の 溶 解 量 の 確 認 に は 、ELISA を 用 い た 相 対 力 価 試 験 を 行 っ た 。 Ⅰ 犬 に お け る 抗 体 応 答 試 験 対 象 動 物 で あ る 犬 に お け る 免 疫 応 答 が 確 実 に 起 こ っ て い る こ と 、 ま た 、 そ の 反 応 の 程 度 を 確 認 す る こ と に よ り 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 の 狂 犬 病 ワ ク チ ン と し て の 有 効 性 を 検 討 す る た め 犬 に お け る 抗 体 応 答 試 験 を 行 っ た 。 １ 試 験 材 料 １ ） 供 試 ワ ク チ ン 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 を 滅 菌 精 製 水 2.4 ml で 溶 解 後 、1.6 ml の リ ン 酸 緩 衝 食 塩 液（ PBS） を 加 え て 全 量 4.0 ml と し た も の を 原 液 と し て 用 い た 。 ２ ） 試 験 動 物 狂 犬 病 ウ イ ル ス 抗 体 陰 性 の 約 6 ヶ 月 齢 ビ ー グ ル 犬 9 頭 （ 雄 5 頭 、 雌 4 頭 ） を 用 い た 。 ２ 試 験 方 法 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 の 原 液 、 PBS で 2 倍 及 び 4 倍 に 希 釈 し た も の を そ れ ぞ れ 3 頭 に 1
ml ず つ 皮 下 注 射 し た 。 接 種 前 、 接 種 後 1 ヶ 月 目 及 び 3 ヶ 月 目 に 採 血 し 、 中 和 用 ウ イ ル ス と し て RC・ HL 株 を 用 い た 間 接 イ ム ノ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 法 を 応 用 し た 試 験 法 （ Hirayama ら 1990） に よ り 狂 犬 病 ウ イ ル ス に 対 す る 血 清 中 和 抗 体 価 を 測 定 し た 。 ３ 結 果 及 び 考 察 抗 体 応 答 は 全 て の 個 体 で 認 め ら れ 、 中 和 抗 体 価 は 幾 何 平 均 値 （GM） で 接 種 後 1 ヶ 月 目 で 原 液 群 が 512 倍 、 2 倍 希 釈 液 群 が 406 倍 、 4 倍 希 釈 液 群 が 128 倍 に 上 昇 し た 。 接 種 後 3 ヶ 月 目 に は 、 原 液 群 が 161 倍 、 2 倍 希 釈 液 群 が 81 倍 、 4 倍 希 釈 液 群 が 128 倍 に な り 、 中 和 抗 体 価 は や や 低 下 し た が 、 各 群 全 て の 個 体 が 感 染 防 御 に 有 効 と さ れ る 10 倍 以 上 （ 石 川 ら 1989） を 有 し て い た （Table1）。 1.55 IU/ml に 調 整 し た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 2 の 接 種 後 3 ヶ 月 目 の 中 和 抗 体 価 は 51 倍 （ 金 井 ら 1997）、 2.248 IU/ml 及 び 1.124 IU/ml に 調 整 し た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 3 は 72 倍 及 び 43 倍 で あ り（ 小 林 ら 2003）、1.54 IU/ml に 調 整 し た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 は 128 倍 で あ る こ と か ら 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 は 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 2 及 び 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 3 と 同 等 以 上 の 抗 体 価 を 賦 与 で き る も の と 考 え ら れ る 。 ま た 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 2 及 び 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 3 は 、 概 ね 1 年 間 10 倍 以 上 の 中 和 抗 体 価 が 持 続 さ れ る 傾 向 に あ る（ 金 井 ら 1997、Gamoh ら 2003）。こ れ ら の こ と よ り 、参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 は 犬 に 対 し て 1 年 間 の 感 染 防 御 が 可 能 な 抗 体 価 を 賦 与 で き る も の と 推 察 さ れ た 。 Ⅱ NIH 法 NIH 法 は 、 試 験 ご と の 成 績 の ば ら つ き が 大 き い が （ Barth ら 1988）、 世 界 的 に 広 く 採 用 さ れ て い る 狂 犬 病 ワ ク チ ン の 力 価 試 験 法 で あ る こ と か ら （Seligmann 1973）、 NIH 法 に よ り 求 め た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 4 の 力 価 （ 国 際 単 位 ） と 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト № 3 の 力 価 を 比 較 す る こ と に よ り 有 効 性 を 確 認 し た 。 １ 試 験 材 料 １ ） 供 試 ワ ク チ ン 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 を 滅 菌 精 製 水 2.4 ml で 溶 解 後 、5.6 ml の PBS を 加 え て 全 量 を 8.0 ml と し た も の を 用 い た 。WHO か ら 入 手 し た 第 6 次 国 際 標 準 狂 犬 病 ワ ク チ ン （ The sixth international standard for Rabies vaccine） に つ い て は 、 滅 菌 精 製 水 1.0 ml で 溶 解 後 、 3.0 ml の PBS を 加 え て 全 量 を 2 IU/ml と し た も の を 用 い た 。 ２ ） 試 験 動 物 4 週 齢 ddy 系 雌 マ ウ ス を 用 い た 。 ３ ） 攻 撃 ウ イ ル ス 狂 犬 病 ウ イ ル ス CVS 株 の マ ウ ス 感 染 脳 乳 剤 を 2 ％ 馬 血 清 加 生 理 食 塩 液 で 25 LD /0.03 ml を50 目 安 に 調 整 し た も の を 用 い た 。 ２ 試 験 方 法 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 及 び 国 際 標 準 ワ ク チ ン を そ れ ぞ れ PBS で 5 倍 、 25 倍 、 125 倍 及 び 625 倍 に 希 釈 し 、 そ れ ぞ れ 16 匹 の マ ウ ス の 腹 腔 内 に 0.5ml ず つ 1 週 間 隔 で 2 回 注 射 し た 。 初 回 免 疫 後 、14 日 目 に 免 疫 群 の マ ウ ス に 、 攻 撃 ウ イ ル ス を 0.03 ml ず つ 脳 内 接 種 し 、 14 日 間 観 察 し た 。 観 察 期 間 中 、 神 経 症 状 を 伴 う 異 常 及 び 死 亡 し た 個 体 数 か ら 各 ワ ク チ ン の 50 ％ 有 効 量 （ED50） を 算 出 し 、 次 式 に よ り 国 際 単 位 を 求 め た 。 参 照 ワ ク チ ン IU ＝ 参 照 ワ ク チ ン ED50/国 際 標 準 ワ ク チ ン ED50× 2 ３ 結 果 及 び 考 察 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 の ED50 は 162.5、国 際 標 準 ワ ク チ ン の そ れ は 105.4 で あ っ た（ Table
2）。 ま た 、 攻 撃 ウ イ ル ス 量 は 10 LD50で あ り 、 規 格 と さ れ て い る 10 ～ 100 LD50に 適 合 し て い た 。 参 照 ワ ク チ ン No.4 の 力 価 は 3.08 IU/ml で あ り 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 の 成 績 で あ る 2.81 IU/ml（ 小 林 ら 2003） と 近 似 の 値 を 示 し た 。 な お 、 WHO に お い て 推 奨 さ れ て い る 動 物 用 狂 犬 病 不 活 化 ワ ク チ ン に 必 要 な 力 価 は 、1 ド ー ズ 当 た り 1 IU 以 上 で あ り 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 は 十 分 な 力 価 を 有 し て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 Ⅲ ELISA に よ る 相 対 力 価 定 量 試 験 ELISA は 、 狂 犬 病 ワ ク チ ン 中 の 抗 原 量 を 直 接 定 量 す る 試 験 法 で 、 平 成 8 年 度 か ら 動 生 剤 基 準 に 力 価 試 験 法 と し て 採 用 さ れ て い る 。NIH 法 で 得 ら れ た 成 績 か ら 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 及 び 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 を そ れ ぞ れ 1 IU/ml と な る よ う に 調 整 し た 試 料 に つ い て ELISA に よ る 力 価 試 験 を 行 い 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 の 調 整 量 の 妥 当 性 を 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 と 比 較 す る こ と に よ り 確 認 し た 。
１ 試 験 材 料
NIH 法 で 得 ら れ た 成 績 か ら 1 IU/ml と な る よ う に 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 は 、 2.4 ml の 滅 菌 精 製 水 で 溶 解 後 、PBS を 5.6 ml 加 え て 全 量 8 ml と し た も の に 、 更 に 抗 原 希 釈 液 を 加 え て 3.08 倍 に 希 釈 し た も の を 原 液 と し た 。 同 様 に 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 は 、 2.4 ml の 滅 菌 精 製 水 で 溶 解 後 、PBS を 0.8 ml 加 え て 全 量 3.2 ml と し た も の に 、 更 に 抗 原 希 釈 液 を 加 え て 2.81 倍 希 釈 し た も の を 原 液 と し た 。 ２ 試 験 方 法 試 験 は 、 動 生 剤 基 準 の 狂 犬 病 ワ ク チ ン 力 価 試 験 法 （ 農 林 水 産 省 2002） に 準 じ て 行 っ た 。 供 試 ワ ク チ ン の 原 液 を 規 定 さ れ た 処 理 後 、 そ の 4 ml に つ い て 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ り 第 1 分 画 の ピ ー ク を 採 取 し 、 ELISA 試 料 の 原 液 と し た 。 こ の ELISA 試 料 の 原 液 及 び 抗 原 希 釈 液 で 更 に 2 倍 、 4 倍 に 希 釈 も の を そ れ ぞ れ ELISA に よ り OD 値 を 測 定 し 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 に 対 す る 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 の 相 対 力 価 を 算 出 し た 。 ３ 結 果 及 び 考 察
NIH 法 の 成 績 か ら 1 IU/ml と な る よ う 調 整 し た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 の 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 に 対 す る 相 対 力 価 は 、 1.091（ Table3） で あ り 、 1 に 近 い 値 と な っ た こ と か ら 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 を 力 価 試 験 に 用 い る 場 合 の 調 整 量 に つ い て は 、 8.0 ml を 3.08 倍 希 釈 し て す る こ と が 妥 当 と 考 え ら れ た 。 Ⅳ ま と め 以 上 の 試 験 に よ り 、 今 回 新 た に 製 造 さ れ た 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 は 、 犬 に 対 し て 1 年 間 の 感 染 防 御 が 可 能 な 抗 体 を 賦 与 で き る も の と 推 察 さ れ 、 狂 犬 病 ワ ク チ ン と し て の 有 効 性 が 確 認 さ れ た 。 ま た 、 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 と 同 等 の 抗 原 量 を 含 有 す る に は 、 NIH 法 の 成 績 、ELISA に よ る 相 対 力 価 試 験 成 績 か ら 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.4 を 8.0 ml で 調 整 後 、 更 に 3.08 倍 希 釈 し 、 力 価 試 験 に 供 す る こ と が 適 当 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 引 用 文 献
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石 川 義 久 、 鮫 島 都 郷 、 野 村 吉 利 、 本 橋 常 正 、 田 坂 邦 安 (1989)細 胞 培 養 順 化 狂 犬 病 ウ イ ル ス RC･HL 株 か ら 調 整 し た 不 活 化 ワ ク チ ン の 免 疫 原 性. 日 本 獣 医 師 会 雑 誌 42, 715-720. 金 井 洋 子 、 蒲 生 恒 一 郎 、 千 田 恵 、 伊 藤 治 、 銀 永 明 弘 (1997)狂 犬 病 組 織 培 養 不 活 化 ワ ク チ ン の 力 価 試 験 用 参 照 ワ ク チ ン の 更 新. 動 物 医 薬 品 検 査 所 年 報 34, 55-58. 小 林 理 絵 子 、 蒲 生 恒 一 郎 、 千 田 恵 、 井 上 剛 光 、 伊 藤 治 、 江 副 伸 介 、 銀 永 明 弘 (2003)狂 犬 病 組 織 培 養 不 活 化 ワ ク チ ン の 力 価 試 験 用 参 照 ワ ク チ ン ロ ッ ト No.3 の 有 効 性 確 認 . 動 物 医 薬 品 検 査 所 年 報 40, 25-28.
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Seligmann, E. B.(1973)The NIH test for potency. In Laboratory Techniques in Rabies. 3rd edn. Eds. Kalpan, M. M. ＆ Koprowski, H. pp. 279-285. World Health Organization, Genova.
Months post inoculation Vacccine dilution Dog No. Pre. １ ３
Undiluted １ ＜８ 512 256 ２ ＜８ 512 256 ３ ＜８ 512 64 GM ＊ ＜８ 512 161 2-fold dilution ４ ＜８ 512 32 ５ ＜８ 256 64 ６ ＜８ 512 256 GM ＜８ 406 81 4-fold dilution ７ ＜８ 32 32 ８ ＜８ 512 256 ９ ＜８ 128 256 GM ＜８ 128 128 ＊GM：Geometric mean 166
Table 2. Potency of new reference vaccine by NIH potency test
New reference International Potency of the Potency of the vaccine standard new reference challenge virus
vaccine ＊ vaccine
（ED50） （ED50） （IU/ml） （LD50/0.03ml）
162.5 105.4 3.08 10
＊The sixth international standard for rabies vaccine（2IU/ml）
167
Table3. Relative potency of the new reference vaccine Test No. Relative potency
1 1.0735
2 1.0283
3 1.1749
Geometric mean 1.0905
