は 細 胞 壁 の 肥 厚 お よ び 溶 菌 が み ら れ た。B.subtilisで は,菌 体 の 伸 長 化
,球 形 化,溶 菌 像 が 観 察 さ れ,細 胞 壁 の 切 断 像 も 認 め ら れ た 。B .Pagilisで は,菌 体 の 伸 長 化 お よ び ブ レ ッ ブ 様 構 造,外 膜 の 切 断 像,そ し て そ れ に 次 ぐ 溶 菌 像 が 認 め ら れ,キ ノ ロ ン 系 抗 菌 剤 の 強 い 殺 菌 力 が 形 態 変 化 の 面 か ら も 認 め ら れ た 。
Keywords:Levofloxacin(LVFX) ,Staphylococcus aunusの 形 態 変 化,Bacillus subtilisの 形 態 変 化,.Bacteroides加8ilisの 形 態 変 化 Levofloxacin(LVFX)は 第 一 製 薬 株 式 会 社 で 合 成 さ れ た 化 学 療 法 剤 で あ る。 本 物 質 は ラ セ ミ体 で あ るoflo-xacin(OFLX)の 光 学 活 性4体 〔S-(-)-OFLX〕 で あ り, そ の 活 性 の 本 体 と さ れ て い る1)。 す な わ ち ,グ ラム 陽 性 菌 群,グ ラ ム 陰 性 菌 群 に 対 し,DR-3354〔R-(+)-OFLX〕 よ り8∼128倍 優 れ た,OFLXの ほ ぼ2倍 の 抗 菌 力 を 示 す と 報 告 さ れ て い る2)。本 系 統 抗 菌 剤 はDNA 合 成 阻 害 に よ っ て抗 菌 作 用 を示 す と い わ れ て お り,多 くの 研 究 者 に よ っ て 様 々 な 菌 種 か らDNAジ ャ イ レ ー ス が 精 製 され,そ れ に 対 す る 阻 害 活 性 が 明 らか に抗 菌 活 性 と相 関 して い る こ とが 知 られ て い る1,3∼7)。しか し, い わ ゆ る ニ ュ ー キ ノ ロ ン剤 と い わ れ るOFLX ,ciprof-loxacin(CPFX)等 は 対 数 増 殖 期 の み な らず 定 常 期 の 細 菌 に 対 し て も 抗 菌 活 性 を 有 して お り,DNA合 成 阻 害 作 用 以 外 の 第 二 の 作 用 点 の 存 在 が 示 唆 さ れ て い る8)。 今 回 我 々 は,Staphylmccusaureus,Bacilluεsubtilisお よ びBacteroides加8ilisに 対 す る作 用 を 形 態 変 化 の 面 か ら検 討 した の で 報 告 す る 。 1.実 験 材 料 お よ び 方 法 1.使 用 菌 株 お よ び薬 剤 使 用 菌 株 と し て は,S.aureus209-pJC,B .subtilis ATCC6633お よ びB.fra8ilisATCC25285を 用 い,薬 剤 と して は 第 一製 薬 株 式 会 社 よ り分 与 さ れ たLVFXを 用 い た 。 使 用 菌 株 に 対 す るLVFXのMICはS .aureus 209-pJC,B .subtilisATCC6633お よ びB .かa8ilis ATCC25285の 順 に0 .39,0.05,お よ び0.39μg/mlで あ っ た 。 2.透 過 型 電 子 顕 微 鏡 に よ る 形 態 観 察 Tryptosoya broth(TSB;ニ ッス イ)で 前 培 養 した 菌 液 をHeart infusion broth(HIB;ニ ッス イ)に 移 し,対 数 期 中 期 まで 振 盪 培 養 した 。 但 しB.fragilisに つ い て はGAMbroth(ニ ッ ス イ)で 前 培 養 し た 菌 液 を 新 た な GAMbrothに 移 し,対 数 期 中 期 まで 嫌 気 培 養 した 。所 定 の 濃 度 の薬 剤 を 添 加 し,以 後 経 時 的 に 菌 液 を採 取 し, 1.5%glutaraldehydeで 前 固 定 し た 。 遠 心 集 菌 後Kel -lenberger緩 衝 液9)で 洗 浄 し,1%osmiumacidに よ り本 固 定 を行 っ た 。 遠 心 集 菌 し,2%精 製 寒 天 中 に 懸 濁 ・ 固 化 後,約1mmの ブ ロ ッ ク に 切 りわ け た 。0 .5%酢 酸 ウ ラ ン 緩 衝 液 中 で2時 間 ブ ロ ッ ク 染 色 を 行 い,エ タ ノ ー ル 系 列 で 脱 水 し,Luftら の 方 法10)に準 じて エ ポ ン 樹 脂 に 包 埋 ・重 合 した 。 こ の 試 料 の 超 薄 切 片 を作 製 し, 酢 酸 ウ ラ ン飽 和 溶 液 お よ び ク エ ン酸 鉛 溶 液 を 用 い て 二 重 染 色11)し,透 過 型 電 子 顕 微 鏡(JEOL-1200EX)に よ り形 態 観 察 お よ び写 真 撮 影 を行 っ た 。 II.実 験 結 果 お よ び 考 察 S.aums,B.subtilisお よ びB.fmgilisに 対 す るLVFX の 作 用 を 形 態 変 化 の 面 か ら検 討 した 。Fig.1aは 薬 剤 未 処 理 のS.aureus209-pJCの 透 過 電 顕 像 で あ り,中 央 部 に 隔 壁 が 形 成 され1正 常 に 分 裂 ・増 殖 す る 像 が 認 め ら れ た 。LVFX0.10μg/ml(1/4MIC)作 用4時 間 後 に はFig.1bに 示 し た よ う に,正 常 な分裂 が 阻害 され, 隔 壁 形 成 の み 行 わ れ 分 離 不 完 全 の ま ま,次 の 隔 壁 形 成 *〒607京 都 市 山科 区御 陵 中内 町5
a
a. Normal S. aureus cells
b
b. 0.10 ƒÊg/ml, 4h; Abnormal cell division
c. 0.39 ƒÊg/ml, 4h; Lysis and thickening of cell wall
d
d. 0.39 ƒÊg/ml, 2h; Lysis
e
e. 1.56 ƒÊg/ml, lh; Abnormal cell division and thickening of cross wall
f
f. 1.56 ƒÊg/ml, 2h; Lysis
a. Normal B. subtilis cells
b
b. 0.05 ƒÊg/ml, 2h; Filamentous cells
c
c. 0.05 ƒÊg/ml, 4h; Lysis and spherical cells
d. 0.05 ƒÊg/ml, 4h; Lysis of filamentous cells
e
e. 0.20 ƒÊg/ml, lh; Swelling of the cell (bulge)
f
f. 0.20 ƒÊg/mI, lh; Lysis
a
a. Normal B.fragilis cells
b
b. 0.39 ƒÊg/m‚Œ, 4h; Blebｃ
c. 0.39 ƒÊg/ml, 4h; Spherical celld
d. 1.56 ƒÊg/ml, 6h; Spherical celle
e. 1.56 ƒÊg/m1, 4h; Filamentous cells with collapsed outer layer
f
f. 1.56 ƒÊg/ml, 4h; Magnification of outer layer
細 胞 壁 の 切 断 像 が 観 察 さ れ た 。0.20μg/ml(4MIC)作 用1時 間 後 に は,膨 化 した 細 胞 や 溶 菌 像 が み ら れ た (Fig.2e,f)。 Fig.3に,B.fragilis ATCC 25285に 対 す るLVFXの 作 用 を 示 した 。 正 常 なB.fragoilisで は,Fig.3aに 示 し た よ う に 外 膜 ・ペ リプ ラ ズ ム ・内 膜 の 三 層 構 造 が 明 瞭 に 観 察 さ れ,0.10μg/ml(1/4MIC)作 用 後 に は 大 き な 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。0.39μg/ml(1MIC)作 用4時 間 後 に は 桿 菌 状 を保 ち な が ら ブ レ ッブ様 構 造 を 有 す る 細 胞(Fig.3b)と 外 膜 に 切 断 が 生 じ た 球 形 化 した 細 胞 (Fig.3c)が 存 在 した 。0.39μg/ml作 用6時 間 後 に は さ ら に 外 膜 の 切 断 が 進 行 し,伸 長 化 細 胞 も み ら れ た 。 1.56μg/ml(4MIC)作 用 後 に は 伸 長 化,球 形 化(Fig . 3d,e)と と も に 外 膜 の 分 断 像 が み られ た(Fig.3f)。 ま た,細 胞 内 に 小 空 胞 の 形 成 が 認 め られ た 。 ピ リ ドン カ ル ボ ン酸 系 抗 菌 剤 作 用 後 の 形 態 変 化 に つ い て は,こ れ ま でS.aunus,Escherichia coli,Pseudo. mmas aeruginosa等 を 用 い た 報 告 が あ り12∼13) ,S.au-msで は分 裂 異 常,膨 化,そ し て 溶 菌 像 が,グ ラ ム 陰
性 桿 菌 で は 伸 長 化,原 形 質 分 離,細 胞 内 空 胞 等 が 観 察 さ れ て い る 。 我 々 の 結 果 に お い て も 同様 の 変 化 が 認 め ら れ,さ ら に 外 膜 の 切 断 像 も み ら れ た こ と よ り, Smith8)が 提 唱 し たOFLX,CPFXで のDNA合 成 阻 害 以 外 の 第 二 の作 用 機 作 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。
文
献
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6) Hoshino K, Sato K, Une T, and Osada Y: In-hibitory effects of quinolones on DNA gyrase of Escherichia coli and Topoisomerase II of fet-al calf thymus. Antimicrob Agents Chemother 33:1816-1818, 1989
7) Tanaka M, Sato K, Kimura Y , Hayakawa I, Osada Y, and Nishino T: Inhibition by quino-lones of DNA gyrase from Staphylococcus au-reus. Antimicrob Agent Chemother 35: 1489•` 1491, 1991
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10) Luft J H: Improvements in epoxy resin embed-ding methods. J Biophys Biochem Cytol 9: 409
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11) Reynolds E S: The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron mic-roscopy. J Cell Biol 17: 208-212, 1963 12) Voigt W- H: The influence of ciprofloxacin on
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13) Elliot T S, Shelton A, and Greenwood D: The response of Escherichia coli to ciprofloxacin
