細胞周期制御分子を介する滑膜増殖の制御

炎 症VOL.20 NO.6 NOVEMBER 2000 649

細 胞 周 期 制 御 分 子 を介 す る滑 膜 増 殖 の 制御

上 阪 等*

JAPANESE JOURNAL OF INFLAMMATION

Cell cycle control of rheumatoid synovial cells

Pathology of rheumatoid arthritis is characterized by lymphocyte and macrophage infiltration and subsequent proliferation of synovial fibroblasts. The proliferative synovial tissue is called pannus, which destroys cartilage and bones of the affected joints. Most of the previous studies to develop new therapeutic approaches addressed how the synovial lymphocytes and macrophages are activated _{. We attempted to}

reveal abnormality of cell cycle control of the synovial cells and found that cyclin-dependent kinase inhibitors p16INK4a and p21Cip1 are readily inducible in the rheumatoid synovial fibroblasts. These inhibitors negatively regulate cell cycle of the mature cells, and actually suppressed proliferation of the synovial fibroblasts when their genes were adenovirally transferred. In vivo gene delivery of these genes into the joints of animals affected with experimental RA models suppressed pathol-ogy of the arthritis. The results showed that induction of CDKI in the synovial tissues could be a new therapeutic approach to treatment of rheumatoid arthritis.

Rec. 10/5/2000, pp 649•`655 Hitoshi Kohsaka* key words: rheumatoid arthritis, cyclin-dependent kinase inhibitors,

gene therapy, cell cycle

慢 性 関 節 リ ウ マ チ(RA)は,な ん らか の 外 的 因 子 と遺 伝 因 子 が 重 な っ て 発 症 す る 自己 免 疫 性 の 関 節 炎 と考 え られ て い る.し か し,他 の 自己 免 疫 疾 患 が 標 的 臓 器 の 破 壊 を 特 徴 とす る の に 対 し て, RAで は,炎 症 の主 体 で あ る滑 膜 が 著 し く増 生 し, そ の 結 果,周 囲 の 骨 や 関 節 が 破 壊 さ れ る. 増 生 滑 膜 に お け る主 な病 態 は,炎 症 性 細 胞 の浸 潤 と滑 膜 線 維 芽 細 胞 の 増 殖 で あ る.炎 症 性 細 胞 の 浸 潤 は 未 知 の 自 己 抗 原 に反 応 す るTリ ンパ 球 が 引 き起 こす もの と考 え られ て い るが,い っ た ん炎 症 が 起 きた 後 は,マ ク ロ フ ァー ジ系 の細 胞 の 活 性

化 が 主 に な り,腫 瘍 壊 死 因 子(tumor necrosis fac -tor:TNF)-α や イ ン タ ー ロ イ キ ン(interleu-kin:IL)-1,6な ど炎 症 性 サ イ トカ イ ン が 大 量 に 滑 膜 内 に分 泌 され る.滑 膜 線 維 芽 細 胞 は,こ の 炎 症 性 サ イ トカ イ ン に反 応 して 増 殖 しパ ンヌ ス組 織 を形 成 す る.パ ンヌ ス組 織 は 蛋 白分 解 酵 素 を分 泌 し,ま た これ らの 炎 症 性 サ イ トカ イ ンな どが 破 骨 細 胞 を活 性 化 さ せ る こ とに よ り,骨 ・軟 骨 を破 壊 して罹 患 関 節 に不 可 逆 的 障 害 を もた らす.こ の よ う に,RAの 病 理 は,炎 症,滑 膜 増 生,関 節 破 壊 の 三 つ の段 階 に分 け て 考 え る こ とが で き る. い う まで も な く,RA治 療 の 最 終 目標 は関 節 破 壊 の 阻 止 で あ る.し か し,従 来 の 治 療 は主 に 炎症 の 是 正 を 目的 と し て きた.新 た に試 され よ う と し て い る抗T細 胞 療 法(シ ク ロ ス ポ リ ン,FK506な ど)や 抗 サ イ トカ イ ン療 法 な ど も同 様 で あ る.と こ ろ が,炎 症 に は多 数 の 因子 が 関 与 し,一 つ の 経 路

* Department of Bioregulatory Medicine and Rheumatology, Graduate School, Tokyo Medical and Dental University東 京 医 科 歯 科 大 学 大 学 院 生 体 応 答 調

節 学(第 一 内 科)

Offprint requests to: Hitoshi Kohsaka, Department of Bioregulatory Medicine and Rheumatology, Graduate School, Tokyo Medical and Dental University, 1-5-45 Yushima, Bunkyo-ku Tokyo, 113-8519 Japan

650 炎 症VOL.20 NO.6 NOVEMBER 2000 図1細 胞 周 期 とサ イ ク リ ン ・CDK複 合 体 G1,S,G2,M期 を繰 り返 す細 胞 周期 にお い て,サ イ ク リン・CDK複 合体 は特 定 の 時期 に活 性 化 され る. の 抑 制 が 他 の 経 路 の活 性 化 を促 す た め か,治 療 薬 剤 の 効 果 が長 続 き しな い こ とが あ る.そ の た め, 従 来 の治 療 法 で は最 終 的 に関 節 破 壊 を阻 止 で き な い こ とが 危 惧 さ れ る.そ こ で,筆 者 らは,滑 膜 線 維 芽 細 胞 の 増 殖 機構 を調 べ,炎 症 の抑 制 に よ らず, 滑 膜 線 維 芽 細 胞 の細 胞 周 期 を直 接 抑 制 して そ の 増 殖 を抑 え る こ とで,効 果 的 に 関 節 破 壊 を 阻 止 で き な い か と考 え た. 細 胞 周 期 細 胞 周 期 は真 核 生 物 の細 胞 が 増 殖 ・分 裂 す る と き に 経 る過 程 で あ る.分 裂 前 の 細 胞 が 染 色 体 DNAを 複 製 す る時 期 は,S(DNA synthesis)期 と

よ ばれ,2倍 に な っ た 染 色 体 を分 裂 後 の細 胞 に 配 分 す る の はM(mitosis)期 と よ ば れ る.細 胞 は こ の 二 つ を繰 り返 して増 殖 す るが,真 核 生 物 で は, S期,M期 の 前 に そ れ ぞ れ の準 備 状 態 が 存 在 し, G1期,G2期 とよ ば れ る.細 胞 は,こ のG1→S →G2→M→G1と い うサ イ ク ル を 厳 密 に繰 り 返 して 決 し て逆 も ど り しな い.な か で も,G1→S の移 行 が 起 き る と細 胞 は必 ず,G2,M期 に進 行 し 再 びG1期 に帰 って く るの で,こ の移 行 は細 胞 周 期 に とっ て 大 事 な ポ イ ン ト で あ り,特 にR (restriction)点 と も よ ばれ る.な お,G1期 の細 胞 は,S期 に進 む 他 に静 止 期(GO期)に 入 る 道 が あ り,ま た分 化,老 化,細 胞 死 へ の 決 断 も この細 胞 期 に な さ れ る. G1/Sの 制 御 に重 要 な 役 割 を 演 じ るの が,癌 抑 制 遺 伝 子 とし て有 名 なp53で あ る.p53は 分 子 量 53kDaの 転 写 因子 で,放 射 線 照 射 や 化 学 物 質 な ど に よ りDNA鎖 が 損 傷 を 受 け る と 発 現 誘 導 さ れ, か つ リ ン 酸 化 を 受 け て 活 性 化 さ れ る.活 性 化 さ れ たp53は,サ イ ク リ ン 依 存 性 キ ナ ー ゼ 阻 害 分 子 (cyclin-dependent kinase inhibitors:CDKI)の ひ と つp21Ciplの 発 現 を 誘 導 す る.p21Ciplは,サ イ ク リ ン と サ イ ク リ ン 依 存 性 キ ナ ー ゼ(CDK)の 複 合 体 に 結 合 し て そ の 活 性 を 抑 制 す る.サ イ ク リ ン ・CDK複 合 体 は 細 胞 周 期 の 特 定 の 時 期 に 活 性 化 さ れ,細 胞 周 期 を 押 し 進 め る こ とが 知 ら れ て い る (図1).p21Cip1の 標 的 と な る も の は,す べ て の サ イ ク リ ン/CDK複 合 体 で あ る が,特 に サ イ ク リ ン D1/CDK4を 阻 害 す る と 網 膜 芽 細 胞 腫Rb蛋 白 の リ ン 酸 化 を 抑 制 しS期 の 遺 伝 子 転 写 に 重 要 な E2Fが 機 能 す る の を 抑 制 す る.こ のp21Ciplは, DNAポ リ メ ラ ー ゼ の 複 製 活 性 を 促 進 す る PCNA(proliferating cell nuclear antigen)も 抑 制 す る.さ ら に,や は りPCNAに 結 合 し て 機 能 を 抑 制 す るGadd45の 転 写 も 促 し,こ れ ら が 相 乗 的 にG1期 停 止 の 誘 導 に 役 立 っ て い る も の と 考 え ら れ る.こ の ほ か,p53は 細 胞 を ア ポ トー シ ス に 導 くBax遺 伝 子 も誘 導 す る.な お,P21Cip1は,特 殊 な 状 況 下 で は サ イ ク リ ン/CDK複 合 体 の 形 成 を 助 け て キ ナ ー ゼ 活 性 を 上 昇 さ せ る 場 合 が あ り,ま た, 特 定 の 細 胞 で は ア ポ トー シ ス に よ る細 胞 死 を 引 き 起 こ す こ と も 知 ら れ て い る1∼3). G1期 で の 細 胞 周 期 制 御 に 重 要 な も う 一 つ の 分 子 がCDKIp16INK4aで あ る.こ の 分 子 は サ イ ク リ ンD1/CDK4,6と 結 合 し て,p21Cip1と 同 じ よ う にG1期 へ の 進 行 を 阻 止 す る.こ の 遺 伝 子 の 異 常 は,数 多 く の ヒ ト悪 性 腫 瘍 細 胞 で 見 い だ さ れ て い

炎 症VOL.20 NO.6 NOVEMBER 2000 651

図2滑 膜 組 織 と増 殖 抑 制 し たRA滑 膜 線 維 芽 細 胞 お よ び そ の 他 の ヒ ト線 維 芽 細 胞 に お け るCDKIの 発 現

A:3検 体 のRA滑 膜 と 正 常 滑 膜 に お け るCDKIお よ び CDK4の 発 現 を 検 討 した.P27Kiplは す べ て の 滑 膜 で 発 現 し て い た が,p15INKJb,PIVINK4a,p21ciPlは 発 現 を 認 め な か っ た.B: 滑 膜 線 維 芽 細 胞,正 常 皮 膚 線 維 芽 細 胞 と ヒ ト胎 児 肺 線 維 芽 細 胞 で あ るWI-38に お け るCDKIの 発 現 を 示 し た .対 数 増 殖 期 (10g),放 射 線 照 射(IR),高 密 度 培 養(HD),低 濃 度 血 清 培 地 に よ る 培 養(LS),老 化 静 止(SN)細 胞 か ら取 り 出 し た 蛋 白 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト法 で 解 析 し た .す べ て の 線 維 芽 細 胞 で 増 殖 抑 制 に よ りp21Ciplの 発 現 が 誘 導 さ れ,p27Kiplの 発 現 が 増 加 し た . p16INK4aの 発 現 はRA滑 膜 線 維 芽 細 胞 だ け に 認 め ら れ た. p15INK4bの 発 現 は ど の 細 胞 で も認 め ら れ な か っ た. る こ と か ら,p53と 並 ん で 細 胞 周 期 の コ ン トロ ー ル に き わ め て 重 要 な も の と 考 え ら れ る4,5).し か も,こ の 遺 伝 子 は,こ れ 以 上 分 裂 し な い 終 末 分 化 し た 細 胞 や 老 化 し た 細 胞 で 発 現 す る こ と が 知 ら れ,“ 老 化 遺 伝 子 ” と も よ ば れ て い る . 一 方_{,G2/M期 の 制 御 は,cdc2キ ナ ー ゼ 活 性 を} 通 じ て 行 わ れ る.こ の 酵 素 は サ イ ク リ ンBと 結 合 し て 活 性 化 さ れ る が,こ の サ イ ク リ ンBの 発 現 は G2/Mに 最 大 と な る.し か し,ふ だ んcdc2キ ナ ー ゼ は,Mik 1やWee 1と よ ば れ る キ ナ ー ゼ に よ る リ ン 酸 化 に よ り不 活 化 さ れ て い る .そ の た め, S期 へ の 進 行 に はcdc25ホ ス フ ァ タ ー ゼ に よ る 脱 リ ン 酸 化 も 必 要 で あ る.さ ら に,活 性 化 に は Wee 1キ ナ ー ゼ な ど が リ ン 酸 化 す る 部 位 と は 別 の 部 位 がCAK(cdc 2 activating kinase)に よ り

リ ン 酸 化 さ れ る こ と が 必 要 で あ る.し た が っ て, こ れ ら の ホ ス フ ァ タ ー ゼ や キ ナ ー ゼ の 活 性 化 も M期 _{進 行 に 必 要 で あ る .} この 他 に も,さ ま ざ ま な 分 子 が 細 胞 周 期 制 御 に 関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る.p15INK4bやp27Kpl と よ ば れ るCDKIも あ り,そ れ ぞ れ,p16INK4aや 21Ciplと 同 様 のCDKを _{抑 制 す る .一 般 に 細 胞 は,} 分 裂 を 秩 序 立 て て 行 い な が ら も,DNA損 傷 な ど の危 機 に際 して は これ を 次世 代 の 細 胞 に引 き継 が な い よ う に分 裂 前 に修 復 しな くて は な らず,細 胞 周 期 を制 御 す る分 子 が 幾 重 に も作 用 しあ っ て い る 原 因 と考 え られ る. 筆 者 ら は,増 殖 す るRA滑 膜 細 胞 の細 胞 周 期 制 御 の 異 常 を検 討 し,RAの 新 た な 治 療 を模 索 し て きて い る6,7). RA滑 膜 に お け る細 胞 周 期 制 御 蛋 白発 現 異 常 (1)正 常 お よ びRA滑 膜 に お け るCDKIの 発 現 RA滑 膜 細 胞 の 効 果 的 な 増 殖 抑 制 方 法 を さ ぐ る こ と を 目 的 と し,活 動 性 の 高 いRA患 者 の 滑 膜 組 織 と関 節 に 外 傷 を 受 け た 患 者 の 膝 関 節 由 来 の 正 常 滑 膜 組 織 に お け るCDKIp15IN14b,pl6INK4a, p21CiP1,P27Kipl蛋 白 の 発 現 を 検 討 し た.こ れ ら の CDKIは,成 熟 し た 細 胞 に お い て 細 胞 周 期 を 制 御 し て い る も の で あ る.そ の 結 果,す べ て の 組 織 で, 27Kiplが発 現 し,p15INK4b,p161NK4a,p21CiPlは 発 現 し て い な か っ た.こ の 発 現 パ タ ー ン は 変 形 性 骨 関 節 症(OA)に お か さ れ た 滑 膜 組 織 で も 同 じ だ っ た(図2A).RA滑 膜 で,特 定 のCDKIの 発 現 が 減 弱 し て い れ ば,こ れ が 増 殖 の 一 因 と考 え る こ と が で き る が,RAの 病 態 に か か る 単 純 な 図 式 は あ て

652 炎症 VOL.20 NO.6 VOVEMBER 2000 図3 A:LacZ遺 伝 子 を も つ 組 換 え ア デ ノ ウ イ ル ス 感 染 に よ る ラ ッ ト罹 患 滑 膜 に お け る べー タ ー ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ の 発 現 ア ジ ュ バ ン ト関 節 炎 を 発 症 さ せ た ラ ッ ト膝 関 節 にAxCALacZを 注 射 し た.滑 膜 を 取 り 出 し,そ の 切 片 を べ 一 タ ー ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ 基 質 で あ るX-galで 染 色 し た.B:ア ジュ バ ン ト関 節 炎 を 発 症 さ せ た ラ ッ トの 膝 関 節 を ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー で 遺 伝 子 治 療 し た.右 膝 に はp16INK4aを,左 膝 に はLacZを 導 入 した.C,D:治 療 し た ラ ッ トの 膝 関 節,滑 膜 の 増 殖 が わ か る よ う に 周 囲 組 織 を除 去し た 標 本 の 前 而(C)と そ の 割 面(D)を 示 し た. は ま ら な い こ とが 明 らか と な った. (2)増 殖 抑 制 刺 激 下 に お け る滑 膜 線 維 芽 細 胞 のCDKI発 現 CDKIは 細 胞 周 期 の進 行 を抑 制 して い る分 子 で あ り,細 胞 増 殖 が 止 ま るべ き状 況 で 発 現 誘 導 され る,こ の誘 導 に異 常 が あ っ て も無 秩 序 な増 殖 は起 き る はず で あ る.そ こで 筆 者 らは,滑 膜 か ら線 維 芽 細 胞 を単 離 培 養 し,い くつ か の 方 法 で増 殖 を 抑 制 して,CDKIの 発 現 の 変 化 を検 討 して み た. まず,RA滑 膜 由 来 の 滑膜 線 維 芽 細 胞 を,放 射 線 照 射,高 密 度 培 養,低 濃 度 血 清 培 地 に よ る培 養, 老 化 静 止 す る ま で の継 代 の繰 り返 し に よ りその 細 胞 増 殖 を 抑 制 し,各 細 胞 か ら得 られ た 蛋 白 にお け るp15INK4b,p16INK4a,pCiplci,p27Kiplの 発 現 を 解 析 し た.そ の 結 果,対 数 増 殖 期 に あ り増 殖 抑 制 を 受 け て い な い 細 胞 は,滑 膜 組 織 と 同 じCDKIを 発 現 し て い た が,細 胞 が 老 化 す る とP27Kiplの 発 現 は 増 加 し,p16INK4a,p21Cilpの 発 現 が 誘 導 さ れ る こ とが わ か っ た.し か し,放 射 線 照 射,高 密 度 培 養, 低 濃 度 血 清 培 地 に よ る 培 養 で 増 殖 を 抑 制 し た 滑 膜 線 維 芽 細 胞 で も,同 様 にp16INK4aとp21Ciplの 発 現 誘 導 が 認 め ら れ た.な お,p15INK4bの 発 現 は ど の 条 件 で も認 め な か っ た. 正 常 滑 膜 な い し皮 膚 由 来 の ヒ ト皮 膚 線 維 芽 細 胞 と ヒ ト胎 児 肺 線 維 芽 細 胞 で あ るWI-38を 放 射 線 照 射 高 密 度 培 養,低 濃 度 血 清 培 地 に よ る培 養 で 処 理 し た と こ ろ,p21Cipl,p27Kipl発 現 は 誘 導 さ れ た も の のp16INK4aは 誘 導 さ れ な か っ た.こ の よ う

炎 症VOL.20.NO.6 NOVEMBER 2000 653 図4ア ジ ュ バ ン ト関 節 炎 に 対 す るp16INK4a遺 伝 子 治 療 の 病 理 組 織 学 的 治 療 効 果.膝 蓋 骨 周 囲 の 滑 膜 A:正 常 ラ ッ ト(p;膝 蓋 骨,s;滑 膜,t;膝 蓋 骨 腱,f;大 腿 骨 顆).B:生 理 食 塩 水 を 注 射 し た ア ジ ュバ ン ト 関 節 炎 発 症 ラ ッ ト(A,Bヘ マ トキ シ リ ン,エ オ ジ ン 染 色).C,E:AxCALacZを 注 射 し た ア ジ ュ バ ン ト関 節 炎 発 症 ラ ッ ト(C;ヘ マ トキ シ リ ン,エ オ ジ ン 染 色,E;ア ル シ ア ン ブ ル ー 染 色).D,F:AxCAp16を 注 射 し た ア ジ ュバ ン ト関 節 炎 発 症 ラ ッ ト(D;ヘ マ トキ シ リ ン,エ オ ジ ン 染 色,F;ア ル シ ア ン ブ ル ー 染 色) . にRA滑 膜 線 維 芽 細 胞 で 認 め られ る増 殖 抑 制 に よ るp16INK4aの 発 現 誘 導 は,他 の細 胞 に は認 め ら れ な か っ た.RA滑 膜 線 維 芽 細 胞 で は,CDKI誘 導 の低 下 が 認 め られ ず,む しろCDKIの ひ とつ が誘 導 され や す い こ とが 明 らか とな った(図2B). (3)増 殖 抑 制 した 滑膜 線 維 芽 細 胞 の 再 刺 激 次 に,誘 導 され たp16INK4aの 機 能 を検 討 す る た め に 滑膜 線 維 芽 細 胞 を低 血 清 培 地 や放 射 線 照 射 で 増 殖 抑 制 し た後,再 び 高 濃 度 血 清 培 地 で 培 養 した. そ の 結 果,ト リチ ウ ムサ イ ミジ ン の取 り込 み を認 め ず,p16INK4aを 発 現 し た細 胞 は 再 刺 激 に反 応 し な い こ とが わ か った. p16INK4aを 発 現 しな か っ た 正 常 皮 膚 線 維 芽 細 胞 とWI-38肺 線 維 芽 細 胞 を 同 じ 方 法 で 処 理 した と

654 炎 症VOL.20 NO.6 NOVEMBER 2000

図5CIAの 進 行 に お け るp16INK4aま た はp21Cipl遺 伝 子 治 療 の 効 果 AxCAp16(黒 丸),AxCAp21(白 三 角),AxCALacZ(白 菱 形)ま た は 生 理 食 塩 水(黒 四 角)を 二 度 注 入(矢 印,21日 目 と31日 目)(A,BとC)あ る い は 関 節 炎 の 発 症 後 に 一 度 注 入(矢 印, 31日 目)(D,EとF)す る こ と に よ り,CIAマ ウ ス を 治 療 し た.足 関 節 の 横 径(AとD),後 足 の 横 径(BとE)お よ び 関 節 炎 ス コ ア ー(CとF)は,グ ラ フ 上 に 記 し た 日 に 測 定 し た.グ ラ フ 中 の 値 は,一 群7匹 に お け る 平 均 値 と標 準 誤 差 を 示 し て い る.*p<0.05,**p<0.01,*** p<0.001(AxCAp16治 療 群vs.生 理 食 塩 水 治 療 群);#p<0.05,##p<0.01,###p< 0.001(AxCAp21治 療 群vs.生 理 食 塩 水 治 療 群) こ ろ,再 刺 激 に よ り トリチ ウム サ イ ミジ ン の取 り 込 み が 増 加 した.こ れ らか ら,滑 膜 線 維 芽 細 胞 に 誘 導 さ れ たp16INK4aはp21Ciplと 異 な り恒 久 的 に 細 胞 増 殖 を抑 制 す る こ とが わ か る. CDKI発 現 誘 導 を 目指 す 滑 膜 炎 の遺 伝 子 治 療 (1)p16INK4a発 現誘 導 に よ る治 療 p16INK4aの 発 現 誘 導 が 滑 膜 線 維 芽 細 胞 に特 徴 的 で あ る こ とか ら,薬 物 な ど を用 い て人 為 的 に滑 膜 線 維 芽 細 胞 にp16INK4a遺 伝 子 の発 現 を誘 導 し う る 可 能 性 が あ る.そ こで,p16INK4aに よ る細 胞 増 殖 抑 制 が 真 に関 節 炎 治 療 に有 効 か ど うか を検 討 す る た め に,ヒ トp16INK4a遺 伝 子 を もつ組 換 え ア デ ノ ウ イ ル ス(AxCAp16)を ア ジ ュバ ン ト関 節 炎 を 発 症 さ せ た ラ ッ トの 関 節 内 に注 入 し てp16INK4a遺 伝 子 治 療 を試 み た. 治 療 は,ラ ッ トを ア ジ ュバ ン トで 免 疫 し て, AxCAp16ベ ク タ ー を右 関 節 に,同 量 の β ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ 組 換 え ア デ ノ ウ イ ル ス(AxCALacZ) を 同 じ個 体 の左 関 節 内 に注 射 す る こ とで行 った. 遺 伝 子 発 現 は,表 層 の 滑 膜 細 胞 と一 部 の 間 質 滑 膜 細 胞 に認 め られ,注 射 後14日 続 い た(図3A).そ こ

炎 症VOL.20 NO.6 NOVEMBER 2000 655 で,遺 伝 子 導 入 は1週 ご と に3回 繰 り返 し た.別 途,2匹 の ラ ッ トの 関 節 に 生 理 食 塩 水 を 繰 り返 し 注 射 し,す べ て ラ ッ トの 関 節 を4週 間 後 に 評 価 し た. そ の 結 果,AxCAp16治 療 側 で は,明 ら か に 腫 脹 が 抑 え ら れ て い た(図3B∼D).組 織 学 的 検 討 で も,p16INK4a遺 伝 子 を 導 入 し た 関 節 で は 滑 膜 の 肥 厚 が 明 ら か に 抑 え ら れ て い た(図4A∼D).軟 骨 の 非 薄 化 や 硝 子 化 と 単 核 球 の 浸 潤,パ ン ヌ ス の 形 成 も抑 え ら れ て い た.軟 骨 の プ ロ テ オ グ リ カ ン を ア ル シ ア ン ブ ル ー 染 色 し た 結 果 で も,AxCALacZ で 治 療 し た 側 と は 対 照 的 に,p16INK4a治 療 側 で は プ ロ テ オ グ リ カ ン が よ く保 存 さ れ て い た(図4E, F), (2)p211NK4a発 現 誘 導 に よ る 治 療 次 に,RA滑 膜 細 胞 に 誘 導 で き る も う 一 つ の CDKIで あ るp211NK4aに よ る 細 胞 増 殖 抑 制 も 行 っ て み た.前 述 の ご と く,p211NK4aは,一 般 に 多 種 の サ イ ク リ ン/CDK複 合 体 キ ナ ー ゼ 活 性 を 抑 制 し, PCNAも 抑 制 す る が,時 に,キ ナ ー ゼ 活 性 を 増 強 し た り,ア ポ トー シ ス を 招 い た りす る.そ こ で, 滑 膜 でp21INK4aを 誘 導 す る こ とが 関 節 炎 に 及 ぼ す 効 果 は,p16INK4aの 効 果 と異 な る 可 能 性 が あ る.一 方 で,p21INK4aは,p16INK4aと 異 な り,す で に さ ま ざ ま な 薬 剤 で 発 現 誘 導 で き る こ と が 知 ら れ て い る.そ の た め,p16INK4aと 同 様 の 効 果 が 得 ら れ る と す れ ば,RA滑 膜 にP21INK4a発 現 を 誘 導 さ せ る 薬 剤 の 開 発 は よ り容 易 か も し れ な い. そ こ で,AxCAp16ベ ク タ ー な い しp21INK4aを 組 み 込 ん だAxCAp21ベ ク タ ー で,ヒ トRA滑 膜 細 胞 にp16INK4aな い し21INK4a遺 伝 子 を 導 入 し た と こ ろ,両 者 と も 滑 膜 細 胞 の 増 殖 を 阻 止 し た.こ の 際 に は,と も に ア ポ トー シ ス 誘 導 を 認 め ず,増 殖 抑 制 の 機 序 は 両 者 で 類 似 し て い た.さ ら に,マ ウ ス をII型 コ ラ ー ゲ ン で 免 疫 し て 得 ら れ る コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 の 治 療 をAxCAp16ベ ク タ ー な い しAxCAp21ベ ク タ ー で し た.そ の 結 果,CDKI 遺 伝 子 治 療 群 は,生 理 的 食 塩 水 やAxCALacZで 治 療 し た 群 と 比 し て,関 節 炎 が 著 明 に 抑 制 さ れ て い た(図5) _. ア ジ ュ バ ン ト関 節 炎,コ ラ ー ゲ ン誘 導 関 節 炎 と い う 二 つ のRA動 物 実 験 モ デ ル で,CDKI遺 伝 子 療 法 が 有 効 で あ っ た わ け で あ る. 活 動 性 のRA滑 膜 か ら 得 ら れ た 線 維 芽 細 胞 は, in vitroの 増 殖 抑 制 に よ っ てp16INK4aやp21INK4 aを 発 現 し や す い.こ の う ち,P16INK4a発 現 はRA湘

膜 線 維 芽 細 胞 に 特 徴 的 で あ っ た.さ ら に,ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー に よ りin vivoに 導 入 さ れ た P16INK4a遺 伝 子 やP21INK4a遺 伝 子 は,RA動 物 モ テ ル の 関 節 炎 を 効 果 的 に 改 善 さ せ た. RA滑 膜 で 誘 導 さ れ や す いCDKI遺 伝 子 発 現 を 人 為 的 に 誘 導 す る こ と がRAモ デ ル の 治 療 に 役 立 つ と い う 知 見 は,今 後 の 治 療 法 の 開 発 に 大 い に 役 立 つ も の と思 わ れ る. 文 献

1) LaBaer J, Garrett MD, Stevenson LF et al.: New functional activities for the p 21 family of CDK inhibitors. Genes Dev 11:847-862, 1997.

2) Li R, Waga S, Hannon GJ, Beach D, Stillman B : Differential effects by the p 21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair. Nature 371:534-537, 1994.

3) Sheikh MS, Rochefort H, Garcia M : Overexpres-sion of p 21WAF 1/CIP1 induces growth arrest, giant cell formation and apoptosis in human breast carcinoma cell lines. Oncogene 11:1899-1905, 1995.

4) Nobori T, Miura K, Wu DJ et al.: Deletions of the cyclin-dependent kinase-4inhibitor gene in multi-ple human cancers. Nature 368 : 753-756, 1994. 5) Kamb A, Gruis NA, Weaver, Feldhaus J et al.: A

cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Science 264:436-440, 1994. 6) Taniguchi K, Kohsaka H, Inoue N et al.: Induction

of p 16INK4a senescence gene as a new therapeutic strategy for the treatment of rheumatoid arthritis. Nature Medicine 5:760-767, 1999.

7) Nasu K, Kohsaka K, Nonomura K et al.: Adenoviral transfer of cyclin-dependent kinase inhibitor genes suppresses collagen induced arthri-tis in mice. J Immunol (in press).