農薬分解細菌をモデルとした環境常在細菌ゲノムの
遺伝的動態と構成原理に関する研究
著者
永田 裕二
農薬分解細菌をモデルとした環境常在細菌ゲノムの
′遺伝的動態と構成原理に関する研究
(研究課題番号16580050)
平成16年度-17年度 科学研究費補助金
(基盤研究(C))研究成果報告書
平成18年5月
研究代表者 永 田 裕 二
東北大学･大学院生命科学研究科･助教授
農薬分解細菌をモデルとした環境常在細菌ゲノムの
′遺伝的動態と構成原理に関する研究
(研究課題番号16580050)
平成16年度-17年度 科学研究費補助金
(基盤研究(C))研究成果報告書
平成18年5月
研究代表者 永 田 裕 二
東北大学･大学院生命科学研究科･助教授
目 次 Ⅰ. はしがき
ⅠⅠ.研究組織
ⅠⅠⅠ.研究経費ⅠⅤ研究発表
(1)学会誌･出版物等
(2)学会発表
V.研究の内容
1.研究の背景
2.研究の目的
3.研究の特色
4.研究の成果
(1) UT26ゲノムの全体像の解明
(2) 7-HCH分解遺伝子の転移能に関する研究
( 3) UT26内在性転移因子ISsplの解析(4 )ツーHCH分解代謝産物の細胞毒性に関する研究
1 1 1 2 2 3 8 8 9 9 9 9 10 1 0 1 0 (5) 7-HCH分解に必須なABCトランスポーター遺伝子の取得と解析………….…… 1 0(6)その他の関連成果
5.総合考察
ⅤⅠ.発表された主要論文
Ⅰ.はしがき
本研究は､平成16年度及び17年度に交付を受けた科学研究費補助金(基盤研究(C)課題番号
16580050)によってなされたもので､本冊子はこの研究の成果をまとめたものである｡ここで述べ ′た成果のうち現時点ではまだ学会誌などに未発表のものも含まれるが､これらについては今後発表
していく予定である｡今回の科学研究費の受領が研究代表者らの行っている研究をさらに進展させる上で多大な援助に
なったことはいうまでもなく､ここに心から感謝の意を表したい｡また､本研究に携わった研究協
力者の諸氏にもこの機会にあわせて謝意を表したい｡
ⅠⅠ.研究組織研究代表者:永田 裕二 (東北大学･大学院生命科学研究科･助教授)
研究分担者:津田 雅孝 (東北大学･大学院生命科学研究科･教授)
研究協力者:大坪 嘉行 (東北大学･大学院生命科学研究科･助手)
遠藤 諒 (東北大学･大学院生命科学研究科･博士課程)宮内 啓介 (長岡技術科学大学･工学部生物系･助手)
ⅠⅠⅠ.研究経費平成16年度
平成17年度
合 計 円 2,700,000 1,100,000 3,800,000IV研究発表
(1)学会誌･出版物等
1･ OakJey, A･ J･, M･氾vana, M･ Otyepka, Y･ Nagata, M･ C･ Wilcel and J･ Damborsky･ Crystral structure of haloalkane dehalogenase Li丘B &om Sphingomonas paucimobilis UT26 at 0.95 A
resolution: dynamics ofcatalytic residues･ Biochemsitry 43: 870-878 (2004)
21 0htsub, Y･, T･ Kudo, M･ Tsuda, atLd Y･ Nagata･ Strategies for bioremediation of polychlorinated
biphenylsI Appl･ Microbiol･ Biotechnol. 65:250-258. (2004)
3･津田雅孝,小松春伸,大坪嘉行,永田裕二環境細菌ゲノムと環境DNA. ∫. En,iron. Bi｡t｡chn｡1.
3: 69-78. (2004)∫
4･ Miyauchi, K, M･ Fukuda, AL T"da, M. TakBLgi, and Y. Nagata. Identification of inse,ti｡n
sequence &om a y-hexachlorocyclohexane degrading bacterium, Sphingomonas paucimobilis UT26. Biosci･ Biotechnol･ Biochem. 69: 2161219 (2005)
5･ Endo, R, M･ Kamakura, K Miyauchi, M･ Fukuda, Y･ OhtsuboI M･ Tsudal and Y･ Nagata.
Identificationand characterization of genes involved inthe downstream degradation pathway of y-hexachlorocyclohexane in Sphingomonas paucimobilis UT26･ J･ Bacteriol･ 187: 847-853 (2005)
6･ Nagata, Y･, Z･ Prokop, Y･ Sato, P･ Jerabek, A･ Kumar, Y･ OhtsuboI M･ Tsudal and J･ Damborsky･
Degradation of β-hexachlorocyclohexane by haloalkane dehalogenaseLinB from Sphingomonas
paucimobilis UT26･ Appl･ Environ･ Microbiol. 71: 2183-21 85 (2005)
7･ Ohtsubo, Y･, H･ Genka, H･ Komatsu , Y･ Nagatal and M･ Tsuda･ High-temperature-induced tranSposition of IS elements in BurkholderT'a multivorans ATCC 17616･ Appl. Environ. Microbiol. 71:
1822-1828 (2005)
8･ Kmunicek, J･, K Hynkova, T･ Jedlicka, Y･ Nagata) A･ Negri) F･ GagoI a C･ Wade, and J. Danborsky･ Quantitativeanalysis of substrate specificity of haloalkane dehalogenase LinB f,om
Sphingomonas paucimobilis UT26･ Biochemistry: 44: 33901340 1 (2005)
9･ Sato, Y･, M･ Monincova, a Chloupkova, Z･ Prokop, Y･ OhtsuboI K MinamisawaI M･ Tsuda, J. Damborsky, and Y･ Nagata･ Two RJlizobial strains, Mesorhizobium loti MAFF303099and
Bradyrhizobium JaPOnicum USDAl 10, encode haloalkane dehalogenases with novel structuresand
substrate specificities･ Appl･ Environ･ Microbiol. 71 :4372-4379 (2005)
lot Nagata, Y･, M･ Matsuda, H･ KomatsuI Y･ ImuraI H･ SawadaI Y･ Ohtsubo, and M. Tsuda.
Organization and localization of the dnaA and dnaK gene regions On the multichromosomal genome of Burkholderia multivorans ATCC 17616･ J･ Biosci･ Bioengl 99: 603-610 (2005)
1 1･ Jesenska, A･, M･ Pavlova, M･ Strouhal, R Chaloupkova, I･ Tesinska, M･ MonincovaI Z･ ProkopI
M･ Bartos, Ⅰ･ Pavlik, I･ Rychlik, It Mobius, Y･ Nagatal and J･ Damborsky･ Mycobacterial
haloalkane dehalogenaSeS: Clonlng, biochemical properties and distribution･ Appl. Environ. Microbiol.
71: 6736-6745 (2005)
12･永田裕二,津田雅孝･メタゲノム的発想に基づいた新規環境汚染物質分解酵素遺伝子-のア
プローチ･化学と生物43:33-42(2005)13.永田裕二,津田雅孝.有機塩素系殺虫剤分解細菌の出現一代謝系の構築と酵素の機能-.蛋白
質核酸酵素10月号50(12): 1511-1518(2005)14･ Naknmura, T･, M･ Zamocky, Z･ Zdrahal! R Chaloupkovag M･ Monincova) Z･ Prokop7 Y･ NagataI and J･ Damborsky･ Expression ofglycosylated haloalkane dehalogenase LinB in Pichia pastoris.
Protein Expressionand Purification 46: 85-91 (2006)
15･ SotaI T･I a YanoI Y･ NagataI Yl 0htsuboI H･ GenkaI H･ AnbutsuI H. Kawasaki, and M. Tsuda.
Functionalanalysis of unique class II insertion sequence IS1071･ Appl･ Environ･ Microbiol･ 72:
291-297 (2006)
16･ Nagata, Y･, M･ EAtnakura, a Endo, A. Miyazaki, Y. Ohtsubo,一and M. Tsuda. Distribution of
y-hexachlorocycldhexane-degrading genes on three replicons in Sphingobium JaPOnicum UT26.
FEMS Microbiol. Lett. 256: 1 12-1 18 (2006)
17･ Endo, R, Y･ OhtsuboI M･ TsudAI and Y･ Nagata･ Growth inhibition by metabolites of
y-hexachlorocyclohexane in Sphingobium japonicum UT26. Biosci. Biotechnol. Biochem. 70:
1029-1032 (2006) 18.永田裕二. (2006) メタゲノムは宝の山か? (バイオミディア)日本生物工学会誌2月号84(2):73 (2)学会発表 宮崎亮,小野玲,源河浩之,大坪嘉行,永田裕二 津田雅孝
接合伝達能を利用して土壌環境から取得したナフタレン分解酵素遺伝子の解析
環境バイオテクノロジー学会第22回シンポジウム(2004, 7月6日 東京)MAsahiro Sota, Yuji Nagata, Yoshiyuki Ohtsubo, Haruhikoぬwasaki, and Masataka Tsuda
Functional analysis of unique class II inserton sequence ISI 07 1
loth Intemational Symposium on Microbial Ecology (August 22-27, 2004Cancum, Mexico)
佐藤優花里,池田和香子,大坪嘉行,永田裕二, JiriDamborsky,南滞究,津田雅孝
ダイズ根粒菌Bradyrhizobiumjaponicum USDAllO株由来ハロアルカン脱ハロゲン酵素DbjAの構造
と基質特異性に関する解析
日本生物工学会大会(2004,9月21-23日,名古屋)
Masataka Tsuda, Yuji Nagata, Yoshiyuki Ohtsubo, and Masahiro Sota Mobile xenobiotic-degrading genes and their mobility in soil bacteria
OBC2 (Okazaki BiologyCoference#2) (2004, 9月26-30日,伊勢志摩) 津田雅孝,永田裕二,大坪嘉行,曽田匡洋
環境浄化能を司る遺伝子を担う細菌可動遺伝因子のダイナミズム
日本微生物生態学会大会シンポジウム(2004,11月21-23日,仙台)
宮崎亮,小野玲,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝
可動性遺伝因子を利用して土壌環境から取得したナフタレン分解酵素遺伝子の解析
日本微生物生態学会大会(2004,11月21-23日,仙台)伊藤通浩,小野玲,宮崎亮,大坪嘉行,永田裕二津田雅孝
汚染土壌からのgamma-HCH分解酵素遺伝子の取得と解析 日本微生物生態学会大会(2004,11月21-23月,仙台) 遠藤諒,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 gamma-Hexachlorocyclohexane (gamma-HCH)分解菌におけるgamma-HCH分解中間代謝産物による生育阻害効果
日本微生物生態学会大会(2004,11月21-23日,仙台) 永田裕二,佐藤優花里,大坪嘉行,千田俊哉, JiriDamborsky,南津究,津田雅孝ゲノム情報を利用した新規ハロアルカン脱ハロゲン酵素の取得と解析
第7回ワークショップ｢微生物ゲノム研究のフロンティア｣ (2005, 3月5-6日,木更津)矢野大和,曽田匡洋,源河浩之,大坪嘉行,永田裕二津田雅孝
トルエン分解プラスミドpww53上の可動性遺伝因子の解析
日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 永田裕二･ ZbynekProkop,佐藤優花里,大坪嘉行, JiriDamborsky,津田雅孝Haloalkane dehlagonease LinBによるbeta-hexachlorocyclohexaneの分解
日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 小野玲,宮崎亮,伊藤通浩,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝
土壌メタゲノムライブラリーから取得したナフタレン分解酵素遺伝子の解析
日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 伊藤通浩,小野玲,宮崎亮,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝土壌および集積培養由来メタゲノムライブラリーからのgamma-HCH分解酵素遺伝子の取得と解
析 日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 跡連諭美,大坪嘉行,永田裕二 津田雅孝 Acidovorax sp･ KKSIO2株のPCB/biphenyl代謝遺伝子群(bph遺伝子群)の水平伝播に関する研究 日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 佐藤優花里,夏目亮･千田美紀,大坪嘉行･南滞究, Jiri Damborsky,永田裕二津田雅孝,千田俊哉
Bradyrhizobiumjapanicum USDAllO由来ハロアルカン脱ハロゲン酵素DbjAの結晶構造解析 日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 後藤裕治,大坪和香子,佐藤優花里,大坪嘉行,永田裕二,南滞究,津田雅孝 原始環境由来2,4-D分解菌からの新規ハロアルカン脱ハロゲン酵素遺伝子の取得と解析 日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 西山依里,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 4環境細菌Burkholderia multivorans ATCC17616株を宿主としたIVET系の構築 日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 遠藤諒,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 gamma-Hexachlorohexane (HCH)分解によってコロニー周辺に生じるクリアゾーンの形成因子の解 析 ー 日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 宮崎亮,佐藤優花里,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 可動性遺伝因子を利用した土壌環境からのgamma-HCH分解に関与する酵素遺伝子の取得と解析 日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌) 田端理朗,遠藤諒,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝
インドHCH汚染土壌から単離されたHCH分解菌pseudomonas aeruginosa ITRC-5の解析
日本農芸化学会大会(2005,3月29-30日,札幌)
佐藤優花里,夏目亮,千田美紀,大坪嘉行,南滞究, JiriDamborsky,永田裕二,津田雅孝,千田
俊哉
Bradyrhizobiumjaponicum USDAl lO由来ハロアルカン脱-ロゲン酵素: DbjAの構造と基質特異性の
解析
第5回日本蛋白質科学会(2005, 6月30日-7月2日,福岡)
YukariSatoa'Ryo Natsume, Zbynek Prokop, Miki SeJlda, JiriDamborsky, Yuji Nagata, MasatakA
Tsuda and Toshiya Senda
Crystal structure of the Haloalkane Dehalogenase DbjA
XX Congress of the Intemational Union ofCrystallography (August 23-31 2005, Florence, Italy)
Ohtsubo Y, Goto H, Nagata Y, Kudo T, and Tsuda
Catabolite control of bph operon by twoICOmpOnent regulatory system in Acidovorax sp･ KXS 1 02
Pseudomonas 2005: loth Intemational Conference of Pseudomonas (27-31thAugust, 2005, Marseille,
France)
Ryo MiyazAki, Akira Oho, Masahiro Sota, Yoshiyukj Ohtsubo, Yuji Nagata, MasataknTsuda
Direct recovery of naphthalene-degrading genes from soil by exogenous plasmid isolation technique
Pseudomonas 2005: loth Intemational Conference of Pseudomonas (27-31th August, 2005, Marseille,
France) 伊藤通浩,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 有機塩素系農薬gamma-HCHの新規資化細菌による高度♯分解性物質beta-HCHの分解代謝 日本微生物生態学会大会(2005,10月30-11月2日,福岡) 遠藤諒,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 Sphingomonaspaucimobilis UT26のgamma-HCH資化に関与するABCトランスポーター遺伝子の単
離と解析
日本生物工学会大会(2005,11月15-17日,つくば) 津田雅孝,西山依里,須藤理絵,大坪嘉行,永田裕二土壌環境での細菌ゲノム情報発現
5第28回日本分子生物学会年会ワークショップ｢環境ゲノムとしての千差万別微生物の横断研究一微
生物ゲノムの新たな潮流｣ (2005, 12月7-10日,福岡)矢野大和,曽田匡洋,大坪嘉行,永田裕二津田雅孝
IncP-7トルエン分解プラスミドpww53の全塩基配列 第28回日本分子生物学会年会(2005, 12月7,-･10日,福岡)若瀬紫帆,源河浩之,欠野大和,大坪嘉行,永田裕二津田雅孝
Tn4651亜群トランスポゾンTn4661の部位特異的組換え機構に関する研究 第28回日本分子生物学会年会(2005, 12月7-10日,福岡)A･ Oho, R Miyaヱaki, M･ Itoh, G･ Fuchu, AL Sota, R･ Endo, H･ YanoI.YI OhtsuboI Y･ Nagatal and M.
Tsud&
Direct isolation of bacterial genes and plasmids involved in the degradation of environmental pollutants
lntemational Workshop onthe Genomes ofEnvironmental Bacteria (2006, 1月27日,長岡)
津田雅孝,山下教士,黒川顕,永田裕二大坪嘉行,服部正平
多重染色体構造を備えるセパシア菌Burkholde,ia multivo,ansのゲノム 第8回ワークショップ｢微生物ゲノム研究のフロンティア｣ (2006, 3月卜4日,木更津) 永田裕二,佐藤優花里,伊藤通浩･大坪嘉行･南滞究,千田俊哉, JiriDamborsky,津田雅孝 ハロアルカンデハロゲナ-ゼの構造と機能 日本農芸化学会大会シンポジウム(2006,3月28日,京都) 後藤宏行,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝Burkholderia multivorans ATCC17616のカタボライト調節
日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 大坪嘉行,後藤宏行,永田裕二 工藤俊章,津田雅孝 Acidovoraxsp･ KKSIO2株のカタボライト調節メカニズムの解明 日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 伊藤通浩,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 新規gamma-HCH資化細菌のHCH異性体分解代謝に関する研究 日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都)
古屋佑磨,宮崎亮,遠藤諒,大坪嘉行,永田裕二津田雅孝
Sphingobium japonicum UT26のgamma-HCH分解遺伝子群を利用した新規gamma-HCH分解細菌の
構築
日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 遠藤諒,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 Sphingobiumjaponicum UT26のgamma-HCH資化に関与するABCトランスポーター遺伝子の解析 日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 小野玲,渡辺洋平,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝モデル汚染土壌を用いたメタゲノムアプローチによる多環芳香族系環境汚染物質分解に関与する
6遺伝子解析
日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都)府中玄樹,大坪嘉行,永田裕二津田雅孝
土壌環境中でIS6100に担われる遺伝子のメタゲノム的手法による取得と解析
日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都)後藤裕治,大坪和香子,佐藤優花里･大坪嘉行,永田裕二南津究,津田雅孝
2･4-D分解菌Bradyrhizobium sp･ HWK12由来のハロアルカン脱-ロゲン酵素DbhAの解析 日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 佐藤優花里,夏目亮･千田美紀,南滞究･ JiriDamborsky,永田裕二,津田雅孝,千田俊哉新規基質特異性を有するハロアルカン脱ハロゲン酵素DbjAの立体構造解析
日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都)MartinaPavlova, Pavel Banas,永田裕二大坪嘉行,津田雅孝, JiriDamborsky
スロット部の改変によるハロアルカン脱ハロゲン酵素DhaAの1,2,3-trichloropropane分解活性の強 化 日本農芸化学会大会(2006,3月26-3月28日,京都)
津田雅孝･山下教士,黒川顕,永田裕二大坪嘉行,服部正平
セパシア菌群細菌Burkholderia multivoransのゲノム構造 日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 西山依里,須藤理絵,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝IVET法を用いた環境細菌Burkholderia multivorans ATCC 1 7616株の土壌特異的発現遺伝子の同定
日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都)
須藤理絵,西山依里,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝
Signature-tagged mutagenesis法を用いたBurkholderia multivoransの土壌中での生存に必須な遺伝子
の同定
日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 矢野大和,曽田匡洋,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝 トルエン分解プラスミドpww53の全塩基配列 日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都) 宮崎亮,佐藤優花里,大坪嘉行,永田裕二,津田雅孝接合伝達により土壌環境から直接取得した農薬gamma-HcH分解に関与するプラスミドpLBlの解
析 日本農芸化学会大会(2006,3月26-28日,京都)中村卓･ Marcel Zamocky, Zbynek Zdrahal･ Radka Chaloupkova, Mama Monincova, Zbynek Prokop,永田 裕二, Jiri Damborsky
酵母pichiapastrisにおけるハロアルカンデハロゲナ-ゼLinBの大量発現の試み 日本農芸化学会本会(2006,3月26-28日,京都)
V.研究の内容 1.研究の背景
環境変動に対する細菌のゲノム再編成を伴う適応進化機構は生物学上の大きな興味のひとつであ
るo人間が化学工業で作り出した様々な化学物質に対する分解能の獲得という細菌の適応機構もこ
のような観点から捉えることが出来る｡すなわち､細菌の中には人為起源の化学物質を唯一の炭素
源･エネルギー源として分解資化できるものが存在するが､このような能力は人間が化学物質を大
量に環境-放出した後の比較的短期間でゲノムの再編成を伴い獲得されたものと考えられている｡
こうした基礎生物学的興味とバイオレメディェ-ション-の応用を念頭に置いた難分解性環境汚
染物質の微生物分解の研究は､数多くなされ､分解遺伝子も多数獲得されている｡その結果､迅速
な分解能の獲得には接合伝達性プラスミドやトランスポゾンのような可動遺伝因子が関与してい
ることが明らかになった｡しかし､その反面､ 1)対象となった化学物質が芳香族化合物を中心とした環境汚染物質の中で
も比較的易分解性のものが大多数であること､ 2)分解微生物ならびに分解遺伝子の獲得方法がほ
ぼ画一的であること､などの問題により､獲得された分解遺伝子群の多くは互いに極めて類似性が
高く､オペロンを形成し発現制御機構を備えるまでに確立されたものであり､細菌の新規化合物に
対する適応進化機構の解明という観点からは､限られた知見しか得られていない｡これに対して､
申請者はこれまでの研究で､高度に難分解性の人工化合物である有機塩素系農薬
7-hexachlorocyclohexane (†-HCH､ツーBHC)を分解資化するグラム陰性細菌sphingomonaspaucimobilis UT26株を研究対象とし､分解代謝遺伝子群の獲得と解析を行った｡その結果､ 1 )いわゆるdead_end産物を生じるなど代謝経路が効率的でない､ 2) G+C含量や発現様式などの特徴の異なる複数の
遺伝子が分解に関与している､ 3)これらの遺伝子群はひとまとまりのオペロンを形成せず､互い
に離れてゲノム上に存在する､ 4)その多くが遺伝的に不安定である､などの点が明らかになり､
UT26の7-HCH分解経路は､効率的な分解経路が確立されていく進化の途上である可能性が考えられた｡さらに､予備的実験により､本菌株は2本の染色体を含むゲノム構造を有していることが明
らかになっている｡以上の結果､およびSphingomonas属細菌は環境常在細菌であることを考慮すると､ uT26株は｢標準的な環境常在細菌が特殊能力を獲得する過程｣を追跡するには最適な研究
対象であると見なすことができる｡すなわち､ uT26株のゲノムの構成原理､およびゲノム動態の機構を明らかにすることは､環境常在細菌の迅速な新規能力獲得機構の解明に直接繋がるものであ
ると期待される｡ 82.研究の目的
以上のような背景を踏まえ､本研究では､ UT26株のゲノム構造の全体像を把握するために､物
理的地図の作製による本菌株のゲノムの基本骨格を解明し､7-HCH分解遺伝子群のゲノム内分布を 5■明らかにすることを第一の目的とする｡さらに､遺伝的に不安定な7-HCH分解遺伝子群の構造的
動態の解明､ 7-HCH分解遺伝子群の転移能の検討､未だ機構がほとんど未知である複数の染色体からなるゲノムの構成原理についても解析を行ない､得られた実験結果を総合して､最終的には､複
数染色体からなる柔軟なゲノム構造と新規能力獲得機構の相関関係に関するモデルを提案するこ
とを目標とする｡3.本研究の特色
近年のゲノムプロジェクトの進展により､ 1)複数の巨大なレプリコンを有する環境常在細菌は
希でないこと､ 2)可動遺伝因子がゲノムの大規模な再編成に関与した痕跡があること､が明らか
になり･当初考えられていたよりも複雑な細菌ゲノム構造の進化･維持機構に注目が集まっている｡
また､可塑性に富んだゲノムの構成原理と迅速な新規能力獲得との関連性が議論されているが､こ
れらの研究は､いずれも塩基配列情報からの推測の域を出ておらず､実験的な検証はなされていな
い0本研究は､これらについて実験的検証を試みる点に特色がある｡
4.研究の成果
(1) UT26ゲノムの全体像の解明(詳細は発表論文16_を参照) パルスフィールドゲル電気泳動法およびサザン解析などを用いて､ UT26株のゲノムが3.6Mbと 660 kbのrRNA遺伝子が存在する2種の染色体(chr I, Chr IIと命名)と､ 185 kbのプラスミド (pcHqlと命名)､および約30kbと5kbのプラスミドから構成されることが明らかになった｡chrIには細菌の染色体の複製開始に必要なDnaAをコードするdnaA遺伝子が存在していたため､本レ
プリコンが主染色体であると考えられたoさらに､ HCH分解代謝に必要な遺伝子群IinA, linB, Zinc
はChr Iに､ IinREDオペロンはpCHQlに､ IinFはChr IIにそれぞれ存在すること､を明らかにし
た｡
(2) 7-HCH分解遺伝子の転移能に関する研究(詳細は発表論文16を参照) linREDオペロンを担うpcHQlの接合伝達能について検討したところ､本プラスミドは､低頻度
ながら､少なくとも近縁種に接合伝達可能であることが明らかとなった｡
′ (3) UT26内在性転移因子ISsplの解析(詳細は発表論文4を参照)TnJ変異導入実験で得られた7-HCH下流代謝経路の変異株の解析を行ったところ､これらの変
異はTn5挿入ではなく､内在性の転移因子ISsplの転移によるものであることが明らかになった0本転移因子は､ TnJ変異導入実験の過程で転移したと推定され､比較的容易に転移することから､
UT26株のゲノムの再編成に関与している可能性もあると考えられる｡
(4) 7-HCH分解代謝産物の細胞毒性に関する研究(詳細は発表論文17を参照)UT26株の栄養培地上での生育は7-HCHを添加することによって阻害される｡この阻害効果は
LinAあるいはLinBの変異株では観察されなかった○このことから､ 7-HCH自身ではなく､代謝産 物に生育阻害効果があると推定されたo実際､ 7-HCH代謝産物の2,51dichlorohydroquinoneと 2,5-dichlorophenolがUT26株および類縁菌株に細胞毒性を示したが､ 7-HCHを分解代謝する過程で dead-end産物として蓄積する2,5-dichlorophenolが生育阻害を引き起こす要因であると考えられた｡ (5) 7-HCH分解に必須なABCトランスポーター遺伝子の取得と解析(未発表データ) プラスポゾンpTnMod-OKmによって得られたUT26の7-HCH分解資化能に欠損を持つ変異株(畳表論文5-参照)のうち､既知のツーHCH分解酵素遺伝子以外にトランスポゾンが挿入された株を解
析した結果､ 7-HCHを単一炭素源として生育するのに必須なABCトランスポーター遺伝子を同定したo細菌の難分解性環境汚染物質分解のこれまでの研究では､主に直接の分解酵素のみが注目さ
れてきたが､細胞として分解資化能力を発揮するには､これら直接の分解酵素以外の因子も重要で
あるという重要な知見を得た｡
(6)その他の関連成果(詳細は発表論文を参照)
その他､ UT26株由来の7-HCH分解関与酵素群､ UT26類縁菌株のゲノム解析などにおいて本研究と密接に関連する成果を得た｡
105.総合考察
本研究により､重要な環境汚染物質である7-HCH分解細菌UT26株のゲノムの構造を明らかに
すると共に､そのゲノム上に7-HCH分解に係わるIin遺伝子群が散在することを明確に示すことが
′ できたoさらに､ Iin遺伝子群の一部が存在するプラスミドが､少なくとも近縁種に接合伝達可能 であることを明らかにした0 -方､ γ-HCHの中間代謝産物が細胞毒性を示すこと､および､ UT26 樵のY-HCH分解資化に必須なABCトランスポーターの存在を明らかにし､ UT26株の†-HCH分解資化能獲得を論じる際には､これら直接の分解酵素以外の因子につY､ても考慮しなければならない
という重要な知見を得た｡
以上､当初の目標のひとつであった複数染色体からなるゲノム構造の構成原理の解明には至らな
かったものの､ゲノム構造に基づいた環境細菌の迅速な新規能力獲得機構の解明ための基盤の構築
は達成できたと考えている｡
EfIⅥ.発表された主要論文と講演要旨
TOUR ： Tohoku University Repository コメント・シート 本報告書収録の学術雑誌等発表論文は本ファイルに登録しておりません。なお、このうち東北大学 在籍の研究者の論文で、かつ、出版社等から著作権の許諾が得られた論文は、個別にTOUR に登録 しております。 TOUR http://ir.library.tohoku.ac.jp/
