氏 名 石田 泰章 博士の専攻分野の名称 博 士 ( 医 学 ) 学 位 記 番 号 医工農博４甲 第 4 号 学 位 授 与 年 月 日 令和 2 年 3 月 19 日 学 位 授 与 の 要 件 学位規則第４条第１項該当 専 攻 名 先進医療科学専攻
学 位 論 文 題 名 Fractionated small cell-free DNA raised possibilities to detect cancer-related gene mutations in advanced colorectal cancer (進行大腸癌患者の血清を用いた腫瘍由来循環 DNA 濃縮による 癌関連遺伝子検出向上の試み) 論 文 審 査 委 員 委員長 教 授 齋藤 正夫 委 員 准教授 中根 貴弥 委 員 講 師 市川 二郎
学位論文内容の要旨
（ 研 究 の目 的 ）Colorectal cancer (CRC) is the second leading global cause of cancer death in men and the third leading cause of cancer in women, respectively. Advanced CRC patients who cannot be completely resected receive systemic chemotherapy. Recent advancements in therapeutic options including molecular targeted therapies and immunotherapies have enabled the prescription of more precise medications in accordance to the molecular profile of the patients’ tumor. In other words, an d for precision medicine to be accurate and efficient, it necessitates the acquisition of tumor tissues that reveal patients’ genetic profiles. However, this process can be a very difficult task in advanced cancer patients with decreased activities of dail y living. Liquid biopsy is a method that can efficiently detect tumor genetic abnormalities from body fluids such as blood and urine. Detection sensitivity and the available number of mutations in cell-free DNA (cfDNA) are limited. In this study, we develop a highly sensitive and comprehensive method to detect mutations from cfDNA by concentrating tumor fractions of small-sized cfDNA in advanced CRCs.
（ 方 法 ）
Biopsied specimens and 37 serum samples were collected from 27 patients with advanced colorectal carcinoma. A serum-extracted cfDNA was divided into enriched fractionated small cfDNA and unfractionated cfDNA. Both cfDNAs were subjected to digital poly merase
chain reaction (PCR) to evaluate their KRAS, BRAF, and TP53 status. Consequently, their mutant allele frequencies (MAFs) were compared and analyzed by next -generation sequencing (NGS) in conjunction with tissue -derived DNA.
（ 結 果 ）
NGS analyses revealed mutations in TP53 (63%), KRAS (63%), APC (30%), and PIK3CA (22%). Digital PCR could detect KRAS mutations in 17 out of 19 samples (89%) of unfractionated cfDNA, a rate that increased to 100% when samples were enriched with fractionated small cell-free (cf) DNA (6.8 vs. 10.7%, p < 0.001). NGS also showed increased MAFs in fractionated small cfDNA compared to unfractionated cfDNA (16.3 vs. 18.8%, p = 0.012), and a tendency to detect a gretaer number of cancer -related genes in fractionated cfDNA.
（ 考 察 ）
In our study, the sensitivity in detecting mutations in cfDNA from serum using dPCR was 84% and 89% when cut-off values of MAFs were set at >0% and >0.1%, respectively. These results are consistent with current literature findings. On the contrary, the sensitivity in detecting cfDNA mutations from the serum was 14% and 25% when cut -off values of MAFs were set at >2% and >1%, respectively. Therefore, NGS sensitivity directly relies on MAFs cut-off. In fact, a great number of sequences with incorrect variants was identified when variants with MAFs below or around 1% are investigated. To improve the sensitivity of cfDNA mutation detection, we enriched fractionated small nucleic acids from cfDNA. This process facilitated a greater number of MAFs of driver mutations by dPCR and NGS, and hence higher possibilities to detect cancer -related gene alterations by NGS. Despite the fact that dPCR is highly sensitive, it can only detect a few targets, whereas although NGS is less sensitive, it facilitates a comprehensive gene analysis. CfDNA from tumor cells has been reported to own altered fragmentation profiles compared to cfDNA from healthy individuals. Moreover, the proportion of small, fragmented DNA in cfDN A has been found to be significantly higher in patients with lung cancer, colorectal cancer, and cholangiocarcinoma. Our results are consistent with these previous reports and demonstrate a distinct possibility to detect a greater number of cancer -related genes that can, in turn, be targeted by related molecular agents.
Multiple clinical implications are fostered by the findin gs of this study. Firstly, our sensitive liquid biopsy can facilitate efficient monitoring of the therapeutic outcomes in a more rapidly and accurate manner compared to ordinary tumor markers such as CEA and CA19-9. In fact, and as shown earlier, conventional tumor marker responses during the systemic therapy in our two cases were very slow despite the fact the change observed in their CT images. On the other hand, very rapid responses
were observed when using liquid biopsy especially in fractionated small cfDNAs. Secondly, efficient mutations detection in KRAS, BRAF, NRAS and PIK3CA by liquid biopsy with our sensitive method can be a resistance marker for molecular targeted drugs which are widely used in conjunction with systemic chemotherapy in CRC. Therefore, and with this method, it is possible to obtain a genetic profile of the tumor even in advanced cancer patients with decreased physical strength. Thirdly, fractionated small-sized cfDNA increased the possibility of detecting cancer -related gene mutations, including actionable gene mutations, which can be a potential a molecular target for drugs.
（ 結 論 ）
Fractionated small cell-free cfDNA increased MAFs of gene mutations, and increases the possibilities to detect cancer-related genes even in advanced cancer patients who are difficult to obtain tissue samples.
論文審査結果の要旨
（博士論文審査の結果の要旨） 近年、担癌患者の血液中の腫瘍細胞やエクソソームなどを検出し、診断や治療効果判定など多面的な応用 が試みられている。学位申請者は、大腸癌患者の血清中の断片化DNA(cfDNA)を分離濃縮し、その中の大 腸癌関連遺伝子群の変異を検討した。その結果、複数の遺伝子の変異を検出し、その一部は腫瘍組織内の 変異とも一致した。また、cfDNA 独自の変異なども新たに検出され、その生理病理学的意義の解明など、 発展性のある研究であった。 本研究発表における審査委員からの質問、ならびに発表者の返答内容を以下に示す。 ＜中根委員＞ １．大腸癌におけるcfDNA の検出に関する本研究の意義と新規性は何か血清由来のcfDNA 短分画を濃縮することにより、通常の cfDNA 分析と比較して遺伝子変異の MAF が上 昇し、遺伝子変異の検出率が向上した。このような操作を用い大腸癌に特化した報告はこれまでになく、 本研究の新規性の高い点である。
２．組織と濃縮cfDNA に mutation の違いがあり、technical error の可能性も考えられるとのことだが、
それを減弱させるための方法はどのようなことを考えているか？
NGS の結果は Phred quality score により管理されているが、0.1-1%程度の頻度でエラーが出現する。これ
を回避する方法として、本研究のようにMAF の最適なカットオフを設定すること以外として、複数回の 解析を行い共通する変異を確認すること、分子バーコード法などが考えられる。 ３．リキッドバイオプシーで検出される遺伝子変異は、腫瘍細胞由来ではなく、clonal hematopoiesis に由 来するのではないかとする最近の報告もあるが、今回の検討ではどのように考えているか。 既報の cfDNA 解析では、組織や白血球の遺伝子変異を同時に解析していない報告も含まれている。その ような研究結果を改善する上で、cfDNA 変異と白血球由来変異の比較が望ましいと考えている。また本研 究では組織の変異を検出する際に腫瘍周辺の正常組織の遺伝子異常との比較を行っており、somatic なら
びにgermline mutation の解析が可能であった。。 ４．組織のbiopsy ではなく、将来 cfDNA を診断や治療のための基準として臨床応用するためには、信頼 性を高める必要性を感じる。そのためには、どのようなことを考えているか？ 腫瘍組織で検出されていない変異がcfDNA から検出された場合には、腫瘍の heterogeneity、他部位に由来 する変異、あるいはシークエンスエラーなのかを判断することは難しいため、今後の検討が必要と考えて いる。現時点では既存のマーカーとともに補助的な手段のひとつと考えている。 ＜市川委員＞ １．P53 や Kras の遺伝子変異が多く検出されているが、PCR のかかりやすさなどの技術的な点は考えら れないか？ TP53 や KRAS の変異は大腸癌で比較的高頻度に認められ、本研究でも高頻度に検出されているが、ステ ージが進行するとより高頻度に検出されることから、cfDNA のコピー数とも関連している可能性がある。 ２．Smad4、BRAF、ATM などは組織からしか発現を認めないが、Detect しやすいもの、逆にしにくい ものなどの差があるのか？ 先の質問と同様に cfDNA のコピー数が関係している可能性がある。しかし遺伝子変異の種類によって検 出しやすさの差があるかもしれない。今後症例数を増やし検討していきたいと考えている。 ３．現在は組織でのmutation 解析は重要だが、今後、本研究を臨床的に発展させるために必要なことは？ 症例数を増やし、組織での遺伝子変異と cfDNA での遺伝子変異との対応をより詳細に解析していきたい と考える。
４．化学療法後に確かに肝転移は縮小しているが、残存している。それなのに、cfDNA で Kras mutation が検出されないのはなぜか？ NGS の検出精度に関連している可能性がある。実際 NGS で KRAS 変異が検出されなかった血清検体で dPCR を行ったところ、MAF が低いながらも変異は検出された。今後、化学療法後での解析症例を増や すとともに、臨床経過などとも比較しながら詳細な検討をしていきたい。 5. Stage I の症例でも解析しているが、本研究では、n 数が少ないので有意差はつかないと思われる。 今後、癌の検出（early stage）に本解析を応用することは可能か？
一般的にearly Stage における cfDNA の異常は advanced Stage に比べると検出率が低いとされる。別の 癌種(膵癌)では、リキッドバイオプシーのみでは early Stage(Stage I, II)の cfDNA での KRAS 変異検出
率は3 割程度だったが、他のマーカーとの組み合わせにより 2/3 まで検出感度が上昇したとの報告がある。 大腸癌においても他のマーカーと組み合わせることで早期診断に応用できる可能性があると考える。 ６．癌腫に加え、heterogenous がさらに強い肉腫でも、このような解析は可能か？ リキッドバイオプシーは組織での遺伝子変異解析に比べ空間的不均一性の影響を受けにくいとされる検 出技術であり、heterogeneity が強い腫瘍でも解析が可能と考える。 ＜斉藤委員長＞ １．cfDNA の半減期が短いとのことだが、再現性はあるのか？ cfDNA の半減期が短いため、採血後速やかに凍結保存や核酸抽出を行うというような注意は必要だが、 適切に処理を行えば同時期に採取した検体についてはほぼ同等の結果が得られており、再現性はあると考 える。
２．倫理的な面を考慮する必要があるが、健常人で本解析をやったこと、もしくはそのような報告はある か？
健常人をコントロールとしてcfDNA 解析を行った報告は散見されるが、健常人においては cfDNA の量が 少なく、遺伝子変異も検出されなかったとする報告が多い。本研究においては健常人での解析は行ってい ないため今後の検討課題としたい。
３．cfDNA は死滅した細胞由来とすると、化学療法後、なぜ、Kras mutation の検出が減ったのか？① 血清中のcfDNA 量が増えているが、Kras mutation が検出できないのであれば、K-ras mutation をもつ 癌細胞のみが残存している可能性がある。②血清中のcfDNA 量が減っているので、Kras mutation も検
出できないのであれば、ネクローシス（ゲノムDNA 断片化が起こらず漏出はない）によって細胞死がお こり、血管内にcfDNA が移行していない可能性がある。そのような解釈で良いか？ 化学療法によって腫瘍周囲の組織が挫滅し、血管内に移行できない可能性等が考えられる。また本研究で 採血のタイミングは薬剤投与後に休薬期間を経て次のクールの薬剤投与が行われる直前であった。また薬 剤投与直後の cfDNA 量の変化は、今回の実験では検討していない。実際肝細胞癌で肝動脈化学塞栓術を 行った直後には一過性に癌由来の cfDNA が増え、変異の MAF も上昇し、さらに数日後には減少したと いう経験もあり、今後このような点を踏まえ詳細に研究を継続したい。
