Measurement of antibodies to double-stranded and single-stranded DNA using bacterio phage Ď DNA as the antigen \ Avidity of antibodies to DNA in pati

日 腎 会 誌  36(10):1103-1112,1994 1103

BacteriophageλDNAを

抗 原 と した 抗 二 本 鎖 お よ び

抗 一 本 鎖DNA抗

体 の 測 定

―ル ー フ.ス腎 炎 患 者 に お け る抗DNA抗

体 と そ の親 和 性 の 検 討―

斉 藤

元 章,植 地

泰 之,中 林

公 正,長 澤

俊 彦

Measurement of antibodies to double-stranded and single-stranded DNA using bacterio phage ƒÉ DNA as the antigen•\

Avidity of antibodies to DNA in patients with lupus nephritis•\

M0T0AKI SAIT0, YASUYUKI UECHI, KIMIMASA NAKABAYASHI and TOSHIHIK0 NAGASAWA The 1st Department of Internal Medicine, Kyorin University School of Medicine, Tokyo, Japan

Key words : bacteriophage ă DNA, IgG anti-dsDNA antibodies, IgG anti-ssDNA antibodies, high avidity, lupus nephritis

IgG-class antibodies to double-stranded (ds) and single-stranded (ss) DNA in patients with collagen disease were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using bacteriophage ă DNA as the antigen. Moreover, avidity of IgG-class antibodies to both dsDNA and ssDNA in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) was evaluated by ELISA as salt-dependent binding activities. The results are as follows:1) Elevated IgG-class antibodies to dsDNA were largely restricted to patients with active SLE. Furthermore, the levels of IgG-class antibodies to dsDNA correlated with the disease activity of SLE. 2) Lupus nephritis (LN) patients with nephrotic syndrome (NS) or diffuse proliferative LN as deter mined by renal biopsy had high levels of IgG-class antibodies to both dsDNA and ssDNA. 3) LN patients with NS showed the highest means of avidity index of IgG-class antibodies to both dsDNA and ssDNA. These findings suggest that the present method of measuring IgG-class antibodies to dsDNA is useful for the diagnosis and management of patients with active SLE and that IgG-class antibodies to both dsDNA and ssDNA with high avidity may be an important factor in the pathogenesis of LN with NS.

は じ め に

  抗 二 本 鎖DNA(double-stranded DNA,dsDNA)抗 体 は,全 身 性 エ リ テ マ トー デ ス(systemic lupus eryth ematosus,SLE)に 特 徴 的 に 出 現 し,そ の 診 断 的 意 義 は 高 い 。 ま た,SLEの 疾 患 活 動 性 と も良 く相 関 す る こ と か ら 治 療 上 有 用 な 指 標 と さ れ て い る1)-3)。 一 方,抗 一 本 鎖 DNA(single-stranded DNA,ssDNA)抗 体 は疾 患 特 異 性 が な く,SLEの 疾 患 活 動 性 と の 関 連 性 も乏 し い と さ れ

て い る3)。 しか し,IgGク ラス の抗ssDNA抗 体 とSLE

の病 態 との 関 連 性 を示 す 成 績 も報 告4)-8)され て お り, SLEに お け る抗ssDNA抗 体 の 臨 床 的 意 義 に は不 明 な 点 が 多 い。  SLEは 多臓 器 障 害 性 の疾 患 で あ る こ とか ら,そ の病 態 に 関与 す る抗DNA抗 体 も多様 で あ る。SLEの 予 後 を決 定 す るル ー プ ス 腎炎 に お いて,そ の 病 態形 成 に 関与 す る 抗DNA抗 体 の ひ とつ と して 高 親 和 性 抗DNA抗 体 の存 在 が 指 摘 され て い る9)-16)

杏林大 学医学 部第一内科

(平成6年6月7日 受 理)

1104 BacteriophageλDNAを 抗 原 と し た 抗DNA抗 体 の 測 定  今 回 我 々 は,新 し く 開 発 さ れ た,bacteriophageλ DNAを 抗 原 と し た 固 相 酵 素 抗 体 法(enzyme-1inked immunosorbent assay,ELISA)の キ ッ トを 用 い,各 種 膠 原 病 患 者 に お け るIgGク ラ ス の 抗dsDNA抗 体,抗 ssDNA抗 体 を 測 定 し,SLE,特 に ル ー プ ス 腎 炎 に お け る IgG抗dsDNA抗 体,抗ssDNA抗 体 の 臨 床 的 意 義 を 検 討 し た 。 さ ら に 本 キ ッ ト に お け る反 応 系 の 塩 濃 度 を 上 昇 さ せ てIgG抗dsDNA抗 体,抗ssDNA抗 体 を 測 定 し, ル ー プ ス 腎 炎 患 者 に お け る 抗DNA抗 体 の 親 和 性 に 関 し 検 討 し た の で,そ の 成 績 を 報 告 す る。

対象 と方法

1.対 象 症 例

  SLE80例(活 動 期SLE43例,非 活 動 期SLE37例),

慢 性 関 節 リ ウ マ チ(RA)40例,混 合 性 結 合 繊 病

(MCTD)20例,そ の他 の膠 原 病20例,健 常 人40例 か

ら血 清 を得 た。 血 清 は-20℃ に分 注 保 存 して お い た も の

を 使 用 時 に溶 解 した。 な お各 膠 原 病 患 者 に お いて,他 の

膠 原 病 を 合 併 す る もの は 除 外 した。 ま たSLEの 疾 患 活

動 性 の 判 定 は,Urowitzら17)に よ るlupus activity cri

teriacount(抗DNA抗 体価 を 除 く)を 用 いた 。Table1 に 各 疾 患 患 者 の 男 女 比,年 齢 を一 括 して 示 した 。 対 象 症 例 の 年 齢 を 検 討 す る と,SLE患 者 の 年 齢 はSLE以 外 の 膠 原 病 患 者 の 全 て の群 お よ び 健 常 人 に 比 べ 有 意(p< 0.01)に 低 く,ま た活 動 性SLE患 者 の年 齢 は非 活 動 性 SLE患 者 に比 べ 有 意(p<0.05)に 低 か った。 な おRA, PSS,PM患 者 は,健 常 人 に比 べ有 意(p<0.01)に 高 齢 で あ った。2.方法  (1)抗DNA抗 体 の 測 定

IgG抗dsDNA抗 体 お よ びIgG抗ssDNA抗 体 は,bac teriophageλDNAを 抗 原 と し て 固 相 化 し たELISA キ ッ ト(MESCUP DNA-Ⅱ 「ds」,お よ びMESCUP DNA-Ⅱ 「ss」,医 学 生 物 学 研 究 所)を 用 い,キ ッ ト に 添

付 さ れ た 方 法 に 従 い 測 定 し た 。IgG抗dsDNA抗 体 価 は,40international units(IU)/ml以 上 を 陽 性 と 判 定

し た 。IgG抗ssDNA抗 体 価 は,40arbitary units(AU) /ml以 上 を 陽 性 と 判 定 し た 。

  SLE患 者 で は,同 時 にCrithidia luciliae間 接 蛍 光 抗 体 法(indirect immunofluorescence method.IF法: フ ル オ ロnDNAテ ス ト,医 学 生 物 学 研 究 所)お よ び radioimmunoassay(RIA,Farr法;抗DNAキ ッ トⅡ, Amersham社)に よ り抗DNA抗 体 価 を 測 定 し,子 牛 胸 腺DNAを 抗 原 と し たELISA(抗dsDNA抗 体,抗 ssDNA抗 体 「FRS」,富 士 レ ビ オ 株 式 会 社)お よ び 大 腸 菌 由 来 プ ラ ス ミ ドDNAよ り得 た リ コ ン ビ ナ ン トDNA Table 1. Patients.

斉 藤元章 他3名

1105 を 抗 原 と し たELISA(リ コ ン ビ ジ ェ ンELISA抗 dsDNA,抗ssDNAキ ッ ト,日 本DPCコ ー ポ レ ー シ ョ ン)に よ りIgG抗dsDNA抗 体,IgG抗ssDNA抗 体 を 測 定 し,本 キ ッ トに よ るlgG抗dsDNA抗 体 価,IgG抗 ssDNA抗 体 価 と の 関 連 性 を 検 討 し た 。 (2)高 塩 濃 度 下 で の 抗DNA抗 体 の 測 定   SLE患 者 に お い て,本 キ ッ ト に よ るIgG抗dsDNA 抗 体 価 が150IU/ml以 上 の 著 明 高 値 を 示 し た20例(ネ フ ロ ー ゼ(NS)腎 症9例,非NS腎 症4例,非 腎 症7 例),IgG抗ssDNA抗 体 価 が150AU/ml以 上 の 著 明 高 値 を 示 した28例(NS腎 症12例,非NS腎 症8例,非 腎 症8例)に つ い て,本 キ ッ トに お け る 反 応 系 の 塩 濃 度 を 上 昇 さ せ てIgG抗dsDNA抗 体,IgG抗ssDNA抗 体 を 測 定 し た 。 す な わ ち,Yoshidaら12)の 方 法 に し た が っ て,こ れ らの 血 清 を 最 終NaC1濃 度125mM(本 キ ッ トで は 血 清 希 釈 液 のNaCl濃 度 は 通 常125mMに 調 整 さ れ て い る),175mM,225mM,275mMに 調 整 し た 血 清 希 釈 液 を 用 い て101倍 に 希 釈 し,IgG抗dsDNA抗 体,IgG抗 ssDNA抗 体 を 測定 した。 結 果 は各 塩 濃 度 で の450nmに お け る吸 光 度 を 測 定 し,NaCl濃 度125mMの 血 清 希 釈 液 を用 い た際 得 られ た吸 光 度 の値 で 除 して得 られ た%を avidity indexと した。   統 計 解 析 はt検 定,Welch検 定 を実 施 した。 なおt検 定 の 多重 性 につ い て はBonferoniの 式 で補 正 した。

結

果

 (1)各 種 膠 原 病 患 者 に お け るIgG抗dsDNA抗 体 と IgG抗ssDNA抗 体  各 種 膠 原 病 患 者 に お け るIgG抗dsDNA抗 体 の 成 績 を:Fig.1に,IgG抗ssDNA抗 体 の 成 績 をFig.2に 示 し た。 抗dsDNA抗 体 は,活 動 期SLE43例 中41例 (95.3%),非 活 動 期SLE37例 中5例(13.5%),RA40 例 中,悪 性 関 節 リ ウ マ チ(MRA)2例 を 含 む3例 (7.5%),MCTD20例 中6例(30%)が 陽 性 で あ り,SS, PSS,PMか ら成 る そ の 他 の 膠 原 病 患 者 お よ び 健 常 人 で は全 例 が 陰 性 で あ った 。従 って,非SLE患 者(健 常 人 を

Fig. 1. Titers of IgG anti-dsDNA antibody in patients with collagen diseases.

Fig. 2. Titers of IgG anti-ssDNA antibody in patients with collagen diseases.

1106 Bacteriophage λDNAを 抗 原 と し た 抗DNA抗 体 の 測 定 含 む)に お け る 抗dsDNA抗 体 の 陰 性 率 は92.5%で あ っ た 。 ま た 活 動 期SLE患 者 の 抗dsDNA抗 体 価 は193.4± 132.91U/mlで,他 の 群 の 抗dsDNA抗 体 価 に 比 べ 極 あ て 高 値 を 示 し た 。 な お 非 活 動 期SLE患 者 の 抗dsDNA 抗 体 価 は17.4±14.OIU/ml,MCTD患 者 の 抗dsDNA 抗 体 価 は23.9±27.911U/mlでbonferoniの 補 正 を 行 な う と,両 群 と もSS,PSS,PMか ら成 る そ の 他 の 膠 原 病 群 お よ び 健 常 人 の 抗dsDNA抗 体 価 に 比 べ 有 意(p< 0.05)に 高 値 を 示 し た 。  一方_{,抗ssDNA抗 体 は,活 動 期SLE全 例,非 活 動 期} SLE21例(56.8%),MRA5例 を 含 むRA12例(30%), MCTD9例(45%),SS,PSS,PMか ら成 る そ の 他 の 膠 原 病3例(15%,全 例SS患 者)に 陽 性 で あ っ た 。 従 っ て, 非SLE患 者(健 常 人 を 含 む)に お け る抗ssDNA抗 体 の 陰 性 率 は80%で あ っ た 。 な お 抗ssDNA抗 体 価 は,活 動 期SLE患 者463.9±256.4,非 活 動 期SLE患 者79.6± 88.9,RA患 者34.7±51.9,MCTD患 者60.2±69.2,そ の 他 の 膠 原 病 患 者21.8±33.5,健 常 人4.4±7.7AU/ml で あ り,Bonferoniの 補 正 を行 な う と,活 動 期SLE患 者 は他 の全 て の群 に比 べ 有 意(P<0.01)に 高 値 を示 し,非 活 動期SLE患 者 は,SS,PSS,PMか ら成 るそ の 他 の膠 原 病 お よ び健 常 人 に比 べ 有 意(p<0.05)に 高 値 を示 し, RAお よ びMCTD患 者 は健常 人 に比 べ有 意(p<0.05) に高値を示した。  IgG抗dsDNA抗 体 陽 性,IgG抗ssDNA抗 体 陽 性 の 未 治 療 活 動 期SLE12例 に お い て,治 療 前 の抗DNA抗 体 価 とス テ ロイ ド剤 お よ び免 疫抑 制 剤 に て の治 療 に よ り 非 活 動 期 とな った 時 の抗DNA抗 体 価 の推 移 を検 討 した 成 績 をFig.3に 示 した。 抗dsDNA抗 体 は,非 活 動 期 に は1例(40IU/ml)を 除 き全 例 が 陰性 化 した。 一 方,抗 ssDNA抗 体 は,非 活動 期 に お い て そ の抗 体 価 は有 意(p <0.01)に 低 下 したが,8例 が抗ssDNA抗 体 陽 性 の ま ま で あ った。  (2)SLE患 者 に お け る,本 キ ッ トに よ る抗DNA抗 体

Table 2. Correlation between titiers of IgG anti-ds/ssDNA antibody and anti-DNA antibody measured by various methods

in patients with SLE.

Fig. 3. Disease activity of SLE and change of

titers of IgG anti-ds/ssDNA

antibody.

斉藤元章

他3名

1107

価 と他 の測 定 法 に よ る抗DNA抗 体 価 の比 較

 本 キ ッ トに よ る抗DNA抗 体 価 と他 の 測定 法 に よ る抗

DNA抗 体 価 と の関 連 性 を検 討 した成 績 をTable2に 示

した。 本 キ ッ トに よ るIgG抗dsDNA抗 体 価 は,リ コ ン

ビ ナ ン トDNAを 抗 原 と し たELISAに よ るIgG抗

dsDNA抗 体 価 と最 も強 い 正 の相 関(r=0 .964,n=62)

を認 め,以 下Crithidia lucliae IF法 に よ る抗DNA抗 体

価,RIAに よ る抗DNA抗 体 価,子 牛胸 腺DNAを 抗 原

と したELISEに よ るIgG抗dsDNA抗 体 価 の順 で 有 意

な 正 の 相 関 を 認め た。 ま た 本 キ ッ ト に よ るIgG抗

ssDNA抗 体 価 は,リ コ ン ビナ ン トDNAを 抗 原 と した

ELISEに よ るIgG抗ssDNA抗 体 価 と最 も強 い 正 の 相

関(r=0.931,n=62)を 認 め,以 下,子 牛 胸 腺DNAを

抗 原 と し たELISAに よ るIgG抗ssDNA抗 体 価,RIA

に よ る抗DNA抗 体 価,Crithida Iuciae IF法 に よ る抗

DNA抗 体 価 の 順 で 有 意 な 正 の相 関 を認 め た。 (3)ル ー プ ス 腎炎 患 者 にお け る抗DNA抗 体  ル ー プ ス 腎炎 患者46例(NS腎 症19例,非NS腎 症 27例)と 非 腎症34例 の 抗DNA抗 体 価 を比 較 検 討 した 成 績 をFig.4に 示 した。IgG抗dsDNA抗 体 価 は,Ns 腎 症 群210.7±140.6,非NS腎 症 群79.0±110.7,非 腎 症 群83.0±116.41U/mlで,NS腎 症 群 が 非NS腎 症 群 に比 べ 有 意(p<0.01)に 高 値 を示 し,ま た 非 腎症 群 に比 べ 有 意(p<0.05)に 高 値 を示 した 。な お非NS腎 症 群 と 非 腎 症 群 の 間 に は有 意 な 差 は認 め られ な か った。 一 方, IgG抗ssDNA抗 体 価 は,NS腎 症 群486.8±287 .4,非 NS腎 症 群275.7±257.0,非 腎 症 群182.3±223.2AU/ mlで,IgG抗dsDNA抗 体 と 同 様 に,NS腎 症 群 が 非 NS腎 症 群 に比 べ有 意(p<0.05)に 高 値 を示 し,非 腎症 群 に比 べ 有 意(p<0.01)に 高 値 を 示 した。 な お非NS腎 症 群 と非 腎 症 群 の 間 に は有 意 な 差 は認 め られ な か った。  次 に 腎生 検 時,抗DNA抗 体 を 測定 した未 治 療 ル ー プ ス 腎炎 患 者18例(び 慢 性 増 殖 性 ル ー フ.ス腎 炎(DPLN) 9例,膜 性 ル ー プ ス 腎炎(MLN)9例)に お いて,腎 組 織 病 型 と抗DNA抗 体 価 との 関 連 性 を検 討 した成 績 をFig. 5に 示 し た。DPLN群 に お け るIgG抗dsDNA抗 体 価

Fig. 4. Renal disorders and titiers of IgG anti-ds / ssDNA antibody in patients with SLE.

Fig. 5. Renal histological findings and titiers of IgG anti-ds / ssDNA antibody inpatients with LN.

1108 BacteriophageλDNAを 抗 原 と し た 抗DNA抗 体 の 測 定 は,208.9±119.4IU/ml,IgG抗ssDNA抗 体 佃1は, 513.2±247.7AU/mlで,MLN群 に お け るIgG抗 dsDNA抗 体 価 は,70.7±111.8IU/ml,IgG抗ssDNA 抗 体 価 は,288.2±257.3AU/mlで,IgG抗dsDNA抗 体 価 お よ びIgG抗ssDNA抗 体 価 は 共 に,DPLN群 が MLN群 に 比 べ 有 意(p<0.05)に 高 値 を 示 し た。 (4)ル ー プ ス 腎 炎 患 者 に お け る 高 塩 濃 度下 で の 抗 DNA抗 体   本 キ ッ ト に お い て,反 応 系 の塩濃 度 を上 昇 さ せ て 抗 DNA抗 体 を 測 定 し た 成 績 をFig.6,7に 示 し た 。IgG抗 dsDNA抗 体 のavidity indexは,反 応 系 のNaCl濃 度 が175mM.225mM,275mMの 時,NS腎 症 群 で は 各 々, 93.6±8.8,83.7±16.6,77.0±24.1%,非NS腎 症 群 で

は 各 々,92.7±5.7,84.0±.15.0,71.6±24.5%,非 腎症 群 で は 各 々,79.3±15.3,63.6±18.4,46.6±19.5%で

あ り,IgG抗dsDNA抗 体 のavidity indexは 、反 応 系 のNaGl濃 度 が225mMお よ び275mMの 時,NS腎 症 群

が 非 腎 症 群 に 比 べ 有 意(p<0.05)に 高 値 を 示 し た 。 一方 ,IgG抗ssDNA抗 体 のavidity indexは,反 応 系 の NaCI濃 度 が175mM、225mM,275mMの 時,NS腎 症 群 で は 各 々,91.4±8.6,87.2±14.1,83,0±17.3%,非 NS腎 症 群 で は 各 々,79.8±16.1,67.2±21.8,56.7±24.3%,非腎症群では各々,77.1±19.8,63.3±26.5, 51.5±26.5%で あ り,IgG抗ssDNA抗 体 のavidity indexは,反 応 系 のNaCI濃 度 が225mMお よ び275mM の 時,NS腎 症 群 が 非NS腎 症 群 お よ び 非 腎 症 群 に 比 べ 有意(p<0.05)に高値を示 し た 。

考

察

 今 回 我 々 は,新 し く 開 発 さ れ たbacteriophageλ DNAを 抗 原 と し て 固 相 化 し たELISAキ ッ ト を 用 い I gG抗dsDNA抗 体 とIgG抗ssDNA抗 体 の 同 時 測 定 を 行 な い,本 キ ッ トの 有 用 性 と,SLE特 に ル ー プ ス 腎 炎,患 者に お け るIgG抗dsDNA抗 体,IgG抗ssDNA抗 体 の

Fig. 6. Avidity analysis of IgG anti-dsDNA by NaCl concentrations in patients with

SLE.

Fig. 7. Avidity analysis of IgG antiss-DNA by NaCl concentrations in patients with SLE.

斉藤元章 他3名

1109 臨 床 的 意 義 お よ び そ の親 和 性 に関 し検 討 した 。  今 回,抗 原 と して用 い たbacteriophageλDNAは ピ ス トンの 混 入 が な く,DNAの 長 さ が均 一(48.502Kbp) で あ り,dsDNAに お いて 二 本 鎖 の 部 分 的 な一 本 鎖 へ の 変 性 が ほ と ん ど な い こ と を 特 徴 と して い る。 ま た 抗 DNA抗 体 の 測定 法 と して,ELISAは 感 度 お よ び定 量 性 に優 れ,多 数 検体 の処 理 が可 能 で あ り,被 曝 や放 射 性 廃 棄 物 の 問 題 が な くIgク ラ ス別 に 抗dsDNA抗 体 お よ び 抗ssDNA抗 体 の両 者 を容 易 に測 定 し得 る と い う特 徴 を 有 して い る。  今 回,本 キ ッ トを 用 い た 抗DNA抗 体 の測 定 に関 す る 我 々 の 検 討 で は,IgG抗dsDNA抗 体 は活 動 期SLE患 者 に特 異 的 に検 出 さ れ,そ の 抗 体 価 も非 活 動 期SLE患 者 を含め た他 の 膠 原 病 患 者 に比 べ極 あ て高 値 で あ った。 一 方 ,IgG抗ssDNA抗 体 は,活 動 期SLE患 者 の他,非 活 動 期SLE,RA,MCTD,SS患 者 で の陽 性 率 も高 く,疾 患 特 異 性 は認 め られ なか っ た。しか しな が ら活 動 期SLE 患 者 で は非 活 動 期SLEを 含 め た 全 て の膠 原 病 患 者 群 に 比 べ 有 意(p<0.01)に 高 いIgG抗ssDNA抗 体価 を示 し,ま た非 活 動 期SLE患 者 のIgG抗ssDNA抗 体価 は, 個 々 の膠 原 病 患 者 群 と比 較 した時,RA患 者,SS,PSS, PMか ら成 る そ の他 の膠 原 病 に比 べ 有 意(P<0 _{.01)に 高} 値 を示 した こと は重 要 と思 わ れ る。す な わ ち,抗ssDNA 抗 体 価150AU/m1以 上 の 著 明 高 値 例 は,活 動 期SLE37 例(86%),非 活 動 期SLE7例(18.9%),RA1例(2.5%, MRA例),MCTD1例(5%)で,抗ssDNA抗 体 価 著 明 高 値 例 は ほ ぼSLE患 者 に 限 られ て い た。  ま た,未 治 療 活 動 期SLE患 者 に お い て,疾 患 活 動 性 と 抗DNA抗 体 の推 移 を検 討 した と ころ,治 療 に よ るSLE 疾 患 活 動 性 の 消 失 に 伴 ってIgG抗dsDNA抗 体 は 陰 性 化 した が,IgG抗ssDNA抗 体 は陽 性 の ま ま の 例 が 多 く 認 め られ た。 しか しなが ら,そ の 抗体 価 は,非 活 動 期 に は有 意 に低 下 し た。 この事 実 は,IgG抗ssDNA抗 体 価 の経 時 的 測定 は,SLE治 療 効 果 判 定 上 の ひ とつ の指 標 と な り得 る可 能 性 を示 唆 して い る。   以 上 の結 果 は,従 来 よ り指 摘 され て い る よ うに,SLE の 診 断 お よ び疾 患 活 動 性 の 評 価 にIgG抗dsDNA抗 体 の 測定 が極 め て 有 用 で あ る こ とを再 確 認 す る と と もに, SLEに お け るlgG抗ssDNA抗 体 の 臨 床 的 意 義 は さ ら に検 討 す べ き重 要 な 課 題 で あ る こ とを 明 らか に した。 こ れ ま で,SLEに お け るIgG抗ssDNA抗 体 の 関連 性 を支 持 す る もの と して,ル ー プ ス腎炎 の 腎糸 球 体 か ら酸 処 理 に よ り抽 出 さ れ た 抗 体 は,抗dsDNA抗 体 よ り も抗 ssDNA抗 体 が 高 率 か っ 高 力 価 で あ る と い う報 告7), DNA感 作 赤 血 球 を 用 い た 溶 血 法 に よ り補 体 結 合 性 抗 DNA抗 体 を 測 定 し,抗ssDNA抗 体 が ル ー プ ス 腎 炎 の 診 断,治 療 の モ ニ タ リ ング に有 用 で あ る と い う報 告5), IgG抗ssDNAはSLEの 診 断 お よ び治 療 効 果 判 定 上 の 有 用 な 指 標 に な り得 る,ま たSLE再 燃 に 際 し臨 床 症 状 出現 前 か らIgG抗ssDNA抗 体 の上 昇 が認 め られ る とい う報 告4)'6)など が あ る。今 回 我 々 が 検 討 したSLE患 者 で は,IgG抗dsDNA抗 体 陽 性例 は,1例(抗dsDNA抗 体

56IU/ml,抗ssDNA抗 体16AU/ml)を 除 き全 例 がIgG

抗ssDNA抗 体 も陽 性 で あ った。 そ し てSLE患 者 に お け るIgG抗dsDNA抗 体 価 とIgG抗ssDNA抗 体 価 はr =0.831(n=80)の 強 い 正 の相 関 を認 め た。 この こ とは, SLE患 者 に 検 出 さ れ る 抗dsDNA抗 体 の ほ と ん ど が ssDNAと 交 差反 応 を示 す事 実 を支 持 した 。   次 に本 キ ッ トの有 用 性 を確 認 す る為 に,従 来 用 い られ て い る他 の 抗DNA抗 体 測 定 法 に よ る抗DNA抗 体 価 と の 比 較 検 討 を行 な った と ころ,本 キ ッ トに よ るIgG抗 dsDNA抗 体 価 は,大 腸 菌 由来 プ ラ ス ミ ドDNAよ り得 た リコ ン ビナ ン トDNA(オ ー トラ ジオ グ ラ フ ィ ー に よ る検 討 でdsDNAの み で あ る こ とが 確 認 され て い る)18) を 抗 原 と したELISAに よ るIgG抗dsDNA抗 体 価 と最 も強 い 正 の 相 関(r=0.964,n=62)を 示 し,次 にCrith idiaIuciliacIF法(Crithidia-luciliaeのkinetoplast はdsDNAの み を有 して い る)に よ る抗DNA抗 体 価 と 強 い 正 の 相 関(r=0.849,n=62)を 示 した。 この こ と は,本 キ ッ トで 用 い られ て い るdsDNA抗 原 と して の bacteriophageλDNAが 安 定 したdsDNA構 造 を呈 し て い る こ とを 支 持 す る成 績 と思 わ れ る。 な お,本 キ ッ ト に よ るIgG抗dsDNA抗 体 の 活 動 期SLEに 対 す る感 度 は93.5%,非 活 動 期SLEに 対 す る感 度 は13.5%,非

1110 BacteriophageλDNAを 抗 原 と し た 抗DNA抗 体 の 測 定 SLE患 者 を対 象 と して 検 討 したSLEに 対 す る特 異 性 は 92.5%,ま たIgG抗ssDNA抗 体 の活 動 期SLEに 対 す る感 度 は100%,非 活 動 期SLEに 対 す る感度 は56.8%, SLEに 対 す る 特 異 性 は80%と 考 え ら れ た が,他 の ELISAキ ッ トに お い て も この 点 を検 討 し た。 子 牛 胸 腺 DNAを抗原としたELISAによるIgG抗dsDNA抗体の活 動 期SLE(25例)に 対 す る感 度 は72%,非 活動 期

SLE(9例)に 対 す る感 度 は11.1%,非SLE患 者(RA

30例,MCTD15例,そ の 他 の 膠 原 病15例,健 常 人20 例)を 対 象 と し て 検 討 し たSLEに 対 す る 特 異 性 は 82.4%,ま たIgG抗ssDNA抗 体 の 活 動 期SLEに 対 す る感 度 は100%,非 活 動 期SLE(7例)に 対 す る感度 は 100%,SLEに 対 す る特 異 性 は32.4%で あ った 。 リコ ン ビ ナ ン トDNAを 抗 原 と し たELISAに よ るlgG抗 dsDNA抗 体 の 活 動 期SLE(37例)に 対 す る 感 度 は 94.6%,非 活 動 期SLE(25例)に 対 す る感 度 は16%, SLEに 対 す る特 異 性 は73.4%,ま たIgG抗ssDNA抗 体 の 活 動 期SLEに 対 す る感 度 は100%,非 活 動 期SLE に対 す る感 度 は64%,SLEに 対 す る特 異 性 は67.1%で あ った。 検 討 症 例 数,性,年 齢 な ど に ば らつ きが あ り, 統 計 解 析 は行 な って い な い が,本 キ ッ トはSLE患 者 に お け る抗DNA抗 体 測 定 系 と して,そ の感 度,特 異 性 に 関 し優 れ た もの と思 わ れ た。  次 に ル ー プ ス 腎 炎 患 者 にお け る抗DNA抗 体 を検 討 す る と,臨 床 的 に はNS腎 症 群 が 非NS腎 症 群 お よび 非 腎 症 群 に 比 べ 有 意 に 高 いIgG抗dsDNA抗 体 価 とIgG抗 ssDNA抗 体 価 を示 した。 しか し,非NS腎 症 群 と非 腎症 群 の 問 に は両 抗 体 価 に有 意 な差 を認 め なか った 。 ま た少 数 例 の 検 討 で は あ る が,組 織 学 的 に は,DPLN群 が MLN群 に比 べ 有 意 に 高 いIgG抗dsDNA抗 体 価 とIgG 抗ssDNA抗 体 価 を 示 し た。 な おDPLN群9例 は 全 例 IgG抗dsDNA抗 体 陽 性,IgG抗ssDNA抗 体 陽 性 で あ り,MLN群9例 中4例 はIgG抗dsDNA抗 体 陰 性,IgG 抗ssDNA抗 体 陽 性 で あ った。 こ の こ と は,SLEに お け るDPLNの 成 因 の ひ とつ と してIgG抗dsDNA抗 体 が 重 要 な役 割 を有 す る こ と を示 唆 す る と共 に,ル ー プ ス腎 炎,特 にMLNに お け るIgG抗ssDNA抗 体 の 関 与 に関 し再 検 討 され るべ き重 要 な課 題 で あ る こ とを 示 唆 して い る。  抗DNA抗 体 は多 様 性 で,そ の性 状 がSLEの 病 態,臓 器 障 害 性 に関 連 す る こ とが 報 告 され て い る。 ル ー プ ス腎 炎 の発 現 に関 して は,抗DNA抗 体 の ア イ ソ タ イ プ19), 補体結合能20),イディォタイプ21),荷電状態22)などと共に そ の親 和 性 が 問題 とさ れ,ル ー プ ス腎 炎 発 現 にお け る 高 親 和 性 抗DNA抗 体 の重 要 性 が 報 告9)一16)され て い る。 抗DNA抗 体 の親 和 性 を検 討 す る に は,抗 原 抗 体 反 応 系 の塩 濃 度 を上 昇 させ イ オ ン強度 を変 化 させ て 抗 体 の解 離 を見 る方 法 が 簡 便 と され て い る11)-16)。我 々 は,本 キ ッ トに よ る抗DNA抗 体 の 測 定 に て,IgG抗dsDNA抗 体 価150IU/ml以 上 を示 した20例,IgG抗ssDNA抗 体 価 150AU/ml以 上 を 示 した28例 のSLE患 者 を 対 象 と し て,Yoshidaら12)の 方 法 に 準 じ て 抗DNA抗 体 を 測 定 し,そ の親 和 性 と ル ー プ ス腎 炎 との 関連 性 を検 討 した。 そ の 結 果,IgG抗dsDNA抗 体 は,反 応 系 の 塩 濃 度 が 225mM以 上 の 時,NS腎 症 群 が 非 腎 症 群 に比 べ 有 意 に

高 いavidity indexを 示 した 。 ま たIgG抗ssDNA抗 体

は,反 応 系 の塩 濃 度 が225mM以 上 の 時,NS腎 症 群 が 非NS腎 症 群 お よ び 非 腎 症 群 に比 べ 有 意 に高 いavidity indexを 示 した。最 近,宮 脇 ら14)は,高 親 和 性 抗DNA抗 体 を検 出 しやす い とさ れ るFarr法 を 用 い,DNA抗 原 液 の塩 濃 度 を上 昇 させ て(最 終 塩 濃度125mM)低 親 和 性 DNA抗 体 が 結 合 しに くい条 件 下 で 抗DNA抗 体 の 結 合 率 を 測 定 し,ル ー プ ス 腎炎 の病 態 形 成 へ の高 親 和 性 抗 DNA抗 体 の 関 与 を 報 告 し て い る。 ま た,高 親 和 性 抗 DNA抗 体 測 定 キ ッ トも開 発 され,SLEの 疾 患 活 動 性, ル ー プ ス腎 炎 の 活 動 性 の 判 定 に極 め て 有 用 と さ れ て い る16)。本 キ ッ トの抗DNA抗 体 測 定 法 は,低 親 和 性 か ら 高 親 和 性 抗DNA抗 体 ま で 広 く検 出 す るELISAで あ り,抗 原 抗 体 反 応 系 の塩 濃 度 を 極 端 に高 くす る こ と で NS腎 症 群,非NS腎 症 群,非 腎 症 群 の 間 でavidity indexに 有 意 な 差 を 得 た。 そ の結 果,ル ー プ ス 腎炎,特 にNSを 呈 す る重 症 例 に お い て は,高 親 和 性 のIgG抗 dsDNA抗 体 お よ びIgG抗ssDNA抗 体 が そ の 病 態 形 成 に深 く関 与 して い る こ とが 示 唆 され た 。

斉藤元章 他3名

1111

結

語

  bacteriophageλDNAを 抗 原 と したELISAに よ り, 膠 原 病 患 者 に お け るIgG抗dsDNA抗 体,IgG抗 ssDNA抗 体 を測 定 した 。 そ の結 果,1)IgG抗dsDNA 抗 体 は活 動 期SLEに 特 異 的 に検 出 され,2)NS,或 い は 組 織 学 的 にDPLNを 呈 した 重 症 ル ー プ ス 腎 炎 例 で は IgG抗dsDNA抗 体 お よ びIgG抗ssDNA抗 体 が極 め て 高 値 を 示 し,3)NSを 呈 した ル ー プ ス 腎炎 例 で は,高 塩 濃 度 下 で 検 出 さ れ る高 親 和 性 のIgG抗dsDNA抗 体 お よ び 高 親 和 性IgG抗ssDNA抗 体 が 高 値 を 示 した 。 今 回,我 々が 使 用 したELISAキ ッ トは,SLE患 者 に お け る抗DNA抗 体 測定 系 と して,そ の 感 度,特 異 性 に関 し 極 め て 有 用 な もの で あ る と思 わ れ た 。 今 後 は,さ らに SLEの 各 病 態 と抗DNA抗 体 の親 和 性 に 関 す る研 究 が 必 要 と思 われ る。

文

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