機 能 性 ア ン チセ ンスDNAの
化 学合 成
村
上
章*・ 牧
野
圭
祐*
Chemical
Syntheses
of Functionalized
Antisense
DNA.
Akira MURAKAMI*
and Keisuke MAKINO*
In this short review , recent developments in the syntheses of antisense DNAs are described . The antisense
DNA/RNA method is one of the ways to regulate gene expression specifically and uses sequence specific DNAs
and their analogs , namely antisense DNAs . They have been designed and synthesized in order to meet
re-quirements , for use in living systems , such as selectivity , nuclease resistance , cell membrane permeability ,
and duplex stability . The design is mainly focused on the modification of phosphate backbones , the
modifica-tion of sugar moieties , and the introducmodifica-tion of funcmodifica-tional molecules into antisense DNAs . The ability of these
antisense DNAs to regulate gene expression are also discussed as well as biological studies .
1. 緒 言 遺伝 子 の発 現 の制 御 に遺 伝 子 自 身 も関 与 して い る場 合 が あ る と い う事 実 が 最 近 明 らか に され た1)。遺 伝 子 の発 現 に 際 して,そ の遺 伝 子 配 列 と相 補 的 な遺 伝 子 断片 が そ の領 域 と二 重 鎖 を形 成 し,そ の 結 果 遺 伝 子 の 発現 が抑 え られ る とい う機 構 で あ る。 この 機 構 を人 為 的 に再 現 させ る こ とが で きれ ば,従 来 困 難 で あ った 生 体 系 で の遺 伝 子 発 現 機 構 の解 明 や 遺 伝 子 発 現 の 制 御 が 可 能 に な る。 ま た こ の考 え方 に よれ ば ウ イル ス 病 に対 して遺 伝 子 に直 接 作 用 す る 形 で 効 果 を発 揮 す る治 療 薬 の 開 発(ド ラ ッグデ ザ イ ン)も 可 能 と な る2)。一 方,こ う した 遺 伝 子 発 現 制 御 の 方 法 は1970年 初 め か ら提 唱 され,合 成 核 酸 ア ナ ロ グ を用 い て試 み られ て きて お り3∼5),アンチ セ ンスDNA・ RNA法(ハ イ ブ リ ダイ ゼ ー シ ョ ン ・ア レス ト法,ト ラ ン ス レー シ ョ ン ・ア レス ト法 な ど と も呼 ぶ こ とが あ る。 本 稿 で は ア ンチ セ ン ス法 と略 す)と 呼 ば れ て い る。 生 体 で の現 象 の化 学 的 な先 取 り とい う形 で 発 展 して きて い る点 で 興 味 深 い 。 同 法 に よ る 遺 伝 子 制 御 の 対 象 は,現 在 AIDSウ イ ル ス(HIV)6)や イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス7)等の ウ イ ル ス 病,c-myc,c-fos等 発 ガ ン遺 伝 子 群8),Try-panosoma等 原 核 生 物9)にお よび,近 年 で は新 しい農 薬 開 発 に も応 用 さ れ よ う と して い る10)。本 報 で は ア ンチ セ ン ス 法 に 用 い られ る オ リゴ ヌ ク レオ チ ド及 び そ の誘 導 体 の 最 近 の化 学 合 成法 に重 点 を 置 き,次 いで,そ れ らの 性 質 お よ び二,三 の 遺 伝 子 発 現 制 御 の 試 み に つ い て 報 告 す る。 2. ア ン チ セ ン スDNA・RNA法 の 原 理 と ア ン チ セ ン ス 分 子 構 築 の 基 本 条 件 ア ンチ セ ンス 法 の基 本 的 原 理 を 図1に 示 す 。遺 伝 子 の 発 現 の各 過 程 にお い て 一 重鎖 に な る遺 伝 子(DNA,RNA) の 特 定 領 域 を,そ の塩 基 配列 に選 択 的(相 補 的)な 分 子 種 で 被 覆 す れ ば(図1の〓 部 分)当 該 遺 伝 子 は そ の発 現 を抑 制 され る こ と に な る 。(先 に 明 らか に され た の は こ う し た 段 階 で の 生 体 内 在 性 遺 伝 子(RNA)の 関 与 で あ る。)アンチ セ ン ス法 は 制 御 分 子 種 と してDNA,RNAや オ リ ゴヌ ク レオ チ ド(誘導 体 を含 む)な ど を用 いて 人 為 的 に 遺伝 子 発 現 を制 御 しよ う とす る もの で あ る。 対 象 遺 伝 子 を選 択 的 に修 飾 あ る い は切 断 す る こ とで 遺 伝 子 発 現 制 御 を行 う試 み もこの 範躊 に入 る。 ア ンチ セ ンス分 子 が 最 終 的 には 生 体 内 で 機 能 しな けれ ば な らな い こ とか ら,そ の 設 計,構 築 に つ い て は 以 下 の 点 を考 慮 す る必 要 が あ る。 (1) 塩 基 配 列 ア ンチ セ ンス 分 子 の 塩 基 配 列 は対 象遺 伝 子 の特 定 領 域 (例 え ば翻 訳 開 始 コ ドンや ス プ ラ イ シ ング 部 位 等,セ *
京都 工芸繊 維大学 繊維学部 高分子学 科
*Kyoto Institute of Technology , Faculty of Textile Sci-ence, Department of Polymer Science and En-gineering,
ンス 領 域)に 完 全 に 相 補 的 で かつ そ れ らの 配 列 が そ の 種 独 特 で あ る よ う な領 域 が 遺 伝 子 配 列 の情 報 か ら決 定 され る。 近 年 の遺 伝 子 情 報 バ ン クの 充 実 は遺 伝 子 の コ ン ピュ ー タ ー に よ る相 同 性 試 験 や2次 構 造 検 索 な どを 容 易 に し,最 も特 異 性 の高 い と考 え られ る塩基 配列(ア ンチ セ ン ス配 列)の 選 択 が あ る程 度 の 確 度 を もっ て な され る よ うに な っ て きて い る。 (2) 構 造 ア ンチ セ ン ス 法 が 適 用 さ れ る 系 は 最 終 的 に は生 体 系 (in vivo系)で あ る た め,ア ンチ セ ンス 分 子 の 設 計 に 種 々 の 満 た す べ き基 本 的条 件 が 存 在 す る。 そ れ ら を次 に挙 げ る。
(a) DNAあ る い はRNAと の 結 合 安 定性 お よび 選択 性 ア ンチ セ ンス分 子 が機 能 す る た め に は対 象 遺 伝 子 とア ン チ セ ンス 分 子 とが 生 理 的 条 件 下(例 え ば37℃,pH 7.2 イ オ ン強 度0.15等)で 安 定 に 二 重 鎖 を形 成 す る必 要 が あ る。 (b) in vivo系 で の安 定 性(抗 ヌ ク レア ー ゼ特 性) 組 織,細 胞 に作 用 させ る際,ア ンチ セ ンス分 子 は体 液 や細 胞 培 養 液 に 含 まれ る種 々 の加 水 分 解 酵 素 群(ヌ ク レア ー ゼ,ボ ス フ ァタ ー ゼ な ど)に 対 して 少 な くと も 作 用 を発 現 す る まで あ る程 度 安 定 で あ る 必要 が あ る 。 (c) 細 胞 膜 透 過 性 ア ンチ セ ンス分 子 は細 胞 膜 を透 過 し,細 胞 内 に 入 らな け れ ば な らな い 。 (d) 細胞 毒 性 細 胞 毒性 が低 い か あ る い は全 くな い こ と。 (e) 代 謝性 細 胞 に取 り込 まれ た 後代 謝 され生 体 外 に排 出 あ るい は 生 体 に吸 収 され る こ と。 (f) 切 断 活 性 生 理 的 条 件 下 でDNAあ る い はRNAを 切 断 で き る活 性 を有 す る こ と。 (9) 合 成 法 合 成 が簡 便 で あ り製 造 コ ス トが 安 価 で あ る こ と。 な どで あ る 。 現 在 まで に 上述 の基 本条 件 を満 たす べ く多 くの 試 み が 発 表 され て きて い る。 そ れ らの あ る もの は 同時 に複 数 の 条 件 を満 た そ う と して い る 。以 下 に そ れ ら を挙 げ る。 3. ア ン チ セ ン ス 分 子 の 化 学 合 成 3.1. 天 然 型 オ リゴ ヌ ク レ オチ ド ア ンチ セ ンス分 子 と して最 初 に用 い られ た の は 中性 の トリエ ス テ ル結 合 を 有 す る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド誘 導 体(3量 体,後 述)4)と天 然 型 の オ リゴ デ オ キ シ リボ ヌ ク レオチ ド(13量 体,ODN) で あ る5)。現 在 まで に ア ンチ セ ンス 分 子 と して最 も多 く 用 い られ て い る もの は後 者 で あ る。 図2にODNの 基 本 構 造 お よび 構 成 成 分 の構 造 を示 す 。ODNの 化 学 合 成 法 は反 応 中 間体 の リ ン酸 エ ス テ ル の状 態 か ら主 に3種 類 に 分 類 され る(ス キ ー ム1)11∼13)。本 稿 で 紹 介 す る ア ンチ セ ンス分 子 の合 成 法 は これ らい ず れ か に基 づ い て い る。 一 般 にODNは 対 象 遺 伝 子 と安 定 な 二 重 鎖 を形 成 し ア ンチ セ ンス分 子 と して の機 能 も高 い が,リ ン酸 ジエ ス テ ル 結合(1)は 細 胞 培 養 液 あ るい は血 液 等 に含 まれ る ヌ ク
(I) (II) (III)
レ ア ー ゼ に よ り容 易 に加 水 分 解 さ れ る とい う欠 点 を持 つ 。 従 い,こ の 欠 点 を補 い,よ り機 能 的 な ア ンチ セ ンス 能 力 を有 す る種 々 の 分 子 が 開発 され た 。新 しい型 の ア ン チ セ ンス 分 子 は基 本 的 にODNの 修 飾 体 で あ る 。 3.2. 耐 ヌ ク レア ー ゼ活 性 を持 つ 修 飾 リン酸 結 合 を有 す るア ンチ セ ン ス分 子 ア ンチ セ ンス分 子 に よ る遺 伝 子 制 御 で 最 も重要 な 点 と して,ア ンチ セ ンス分 子 の安 定 性 が 注 目 され,そ れ ら を増加 すべ く多 くの試 みが 行 わ れ た 。 こ こで は種 々 の リ ン酸 結合 様 式 の改 良 につ い て述 べ る 。 3.2.1. トリエ ル テ ル 結合(II)生 理 的条 件 下 で ア ンチ セ ンス 分 子 を電 気 的 に 中性 にす れ ばDNAやRNAと の
Fig. 1 Principle of antisense DNA ・ RNA method. 〓 : Antisense molecule
1
(1) Structure of Nucleic Acid
DNA (X= H), RNA (X=OH) (2) Structures of Nucleobases (3) Protecting Group of 5'-OH (DMTr)
(1) Triester method 2 3 1 (2) Phosphoramidite method 4 3 1
(3) Hydrogen phosphonate method
5 3 1 相 互 作 用 時 に お い て静 電 的斥 力 が働 かず,安 定 なハ イ ブ リ ッ ドを形 成 す る との考 え か ら トリエ ス テ ル結 合 型 ア ン チ セ ンス 分 子 が 開発 さ れ,訳NAの コ ドン領 域 の選 択 的 被 覆 に よ る 諏NAの ア ミ ノ ア シ ル 化 反 応 の 抑 制 に 用 い られ た4)。リ ン酸 トリエ ス テ ル型 オ リゴ ヌ ク レオ チ ド(6, 3量 体 ま で)は リン酸 ジ エ ス テ ル 合 成 法 に よ り塩 基 部 分 お よ び2'-水 酸 基 を保 護 した オ リ ゴマ ー を合 成 し,そ れ をDMF/2,6-ル チ ジ ン/ト シ ル ク ロ リ ド中 エ タ ノ ー ル に よ りア ル キ ル化 して得 て い る(収 率:27%)。 化 学 合 成 し て 得 たODNをFmoc(9-フ ル オ レニ ル メ トキ シ カル ボ ニ 6
Fig. 2 Structures of nucleic acids and their components .
ル ク ロ リ ド)に よ り塩 基 部 分,3'お よ び5'水 酸 基 部 分 を 保 護 し た後,ト シ ル ク ロ リ ドのDMF/メ タ ノ ール/2,6-ル チ ジ ン溶 液 で 処 理 す る こ とで トリエ ス テ ール/2,6-ル 型 ア ンチ セ ンス 分 子 を得 る方 法 も報 告 され て い る14)。す べ て の リ ン 酸 ジエ ス テ ルが トリエ ス テ ル に置 き替 わ った もの の 回収 収 率 は18量 体 で37%で あ っ た 。 こ の 方 法 は精 製 し た ODNを 得 て か らで も修 飾 で き る 点 に 利 点 が あ る 。H-ホ ス ホ ネ ー ト法(ス キ ー ム1(3))を 応 用 して も トリエ ス テ ル結 合 は得 られ る15)。H-ボ ス ホ ネ ー ト結 合 の 酸 化 を1V-メ チ ル イ ミダ ゾ ー ル/ト リエ チ ル ア ミ ン(TEA)/CCI4/ ア ル コ ー ル系 で 行 う こ とで リ ン酸 トリエ ス テ ル結 合(H) が得 られ る と報 告 され て い るが,こ の 方 法 は 反応 が 系 中 の 水分 に影 響 され 易 い 点 に 問 題 が あ る。 また オ リ ゴヌ ク レ オ チ ドの 特 定 部 位 に トリエ ス テ ル 結 合 を 導 入 す る 方 法16,17),トリエ ス テ ル 結合 と ジエ ス テ ル結 合 と を交 互 に 持 つ ア ンチ セ ンス分 子18)も報 告 され て い る 。 この ア ンチ セ ンス分 子 は リ ン原 子 に関 して 立 体 異 性 を 示 し(以後p-キ ラ ル と略 称 す る),各 結 合 に そ れ ぞ れS 型 とR型 の絶 対 配 置 が 存 在 す る。 従 っ て,n量 体 の オ リ ゴ マ ー に は2n-1個 の 異 性 体 が 存 在 す る こ と に な り, 31P-NMRス ペ ク トル で はそ の 結 果 幅 広 い ピ ー ク を与 え る14)。 3.2.2. メ チル ポ ス ホ ネ ー ト結 合 ト リエ ス テ ル 結合 型 ア ンチ セ ンス分 子(3.2.1.)は 細 胞 に取 り込 まれ た 後 比 較 的 簡 単 に加 水分 解 され る た め,よ り安 定 な結 合 と して メ チ ル ポ スホ ネ ー ト結 合(III)が考 案 さ れ た19)。この 結 合 も 中性 で あ るた め 高 い細 胞膜 透 過 性 や ヌ ク レア ーゼ 耐 性 が 期 待 さ れ た 。 オ リゴ ヌ ク レ オ シ ドメ チ ル ポ ス ホ ネ ー ト (OMP)は メ チ ル ポ ス ホ ン酸 ジ ク ロ リ ド(7)で 活 性 化 し た8あ るい はそ の テ トラ ゾ リ ド(9)を3と 反 応 させ る こ とで得 られ た が,収 率 は50%-60%で あ っ た20)。次 いで 比 較 的 安 定 で あ る イ ミダ ゾ リ ド(10)を テ トラ ゾ ー ルで 活 7 8 9 10 11 性 化 す る 方 法 が と ら れ,90%程 度 の収 率 が 得 ら れ た21)。 さ ら に3価 リ ンの ア ミ ダイ ト誘 導 体(1Dを 用 い た場 合 各 段 反 応 収 率98%以 上 が 達 成 さ れ て い る22)。11は4同 様 自動 合 成 機 に 適 用 す る こ と が で き,各 段 合 成 収 率 は 97%以 上 と報 告 さ れ て い る23)。こ の メ チ ル ポ ス ホ ネ ー ト結 合 もp-キ ラ ル で あ り,後 述 す る よ う にODNと の ハ イ ブ リ ッ ドの 安 定 性 が 問 題 とな って い る 。現 在 まで の と こ ろ 立 体 選 択 的 合 成 あ る い は分 離 に は 成 功 して い ない が,p-キ ラル な モ ノ マ ー(12)か ら 出 発 した場 合,そ の 12 立 体 異 性 を保 持 しつ つ,立 体 的 に コ ン トロー ル され た(例 え ばR型 の み)オ リ ゴ マ ー を得 る方 法 が 最 近 開発 さ れ た24)。 メ チ ル ポ ス ホ ネ ー トオ リゴマ ーの 精 製 に お い て 注 意 し な け れ ば な らな い の は,メ チ ル ポ ス ホ ネ ー ト結 合 が リ ン 酸 ジ エ ス テ ル結 合 に比 ベ ア ル カ リ条 件 で 不 安 定 で あ り, 容 易 にOMPが 切 断 され る点 で あ る 。従 っ て,塩 基 の 脱 保 護 に は濃 ア ンモ ニ ア水 よ り もTEA/エ タ ノー ル が 用 い られ る21)。 3.2.3. ホ ス ホ ロ チ オ エ ー ト結 合 ボ ス ホ ロチ オエ ー ト 結 合(W)は 本 稿 で 紹 介 す る リ ン酸 結 合 の 中 で 最 も天 然 (IV) (V) のDNAの 結 合 と構 造 的 に類 似 し,電 荷 も存 在 す る。 こ の結 合 は酵 素 を用 い て も形 成 さ れ る。DNAポ リ メ ラ ー ゼ1は α-チオ化ATPな ど を基 質 と して認 識 し,ホ ス ホ ロ チ オ エ ー ト結 合 を有 す る高 分 子 量(約106)のDNA誘 導体 を与 え る25)。化 学 的 に は保 護 ヌ ク レオ シ ドモ ル ホ リ ノ メ トキ シ ホ ス フ ァ イ ト(13)と3'-保 護 ヌ ク レ オ シ ドを テ トラ ゾ ー ル存 在 下 で 反 応 させ15を 得 た後,原 子 状 硫 黄(S8)の ピ リジ ン懸 濁 液 中 で 処 理 して ホス ホ ロチ オエ ー ト結 合(16)を 得 て い る。2量 体 の合 成 収 率 は50%-60% で あ っ た27)。また,ボ ス ホ ロ ア ミダ イ ト法 に よ るDNA 固 相 合 成 の 際,各 段 階 で行 わ れ る ヨ ウ素/水/THFに よ る酸 化 に か わ りにS、 の2,6-ル チ ジ ン懸 濁 液 あ るい は S8の 二 硫 化 炭 素(CS,)溶 液 を 用 い る こ とで ホ ス ホ ロチ オ
13 14 15 16 17 エ ー ト結 合 型 オ リゴ ヌ ク レ オ チ ド誘 導 体(17)が 得 られ る27,28)。14量体,28量 体 が そ れ ぞ れ50%,38%の 収 率 で得 られ て い る。 この 方 法 はDNA自 動 合 成 機 を用 い て 行 う こ とが で きる が,反 応 カ ラム や 流路 の 洗 浄 に 充 分 配 慮 す る必 要 が 指摘 され て い る28)。 他 方,H-ホ ス ホ ネ ー ト法 に よ るDNA合 成 の過 程 で ホ ス ホ ロ チ オ エ ー ト結 合 を 導 入 す る 試 み もな さ れ,H-ホ ス ホ ネ ー ト結 合(V)にS8のCS2/TEA溶 液 で 反応 させ て 17が 得 ら れ て い る13,29)。同 様 の反 応 は2'一水 酸 基 を保 護 したRNAオ リゴ マ ー(18,20量 体)の 合 成 に適 用 され た 18 が,88μmo1の ヌ ク レ オ シ ドを担 持 した サ ポ ー トか ら出 発 した 合 成 で9.1μmolの 最 終 ア ンチ セ ンス 分 子 が得 ら れ て い る6e)。ホ ス ホ ロチ オエ ー ト結 合 は あ る程 度 求核 反 応 性 が あ り,反 応 性 を利 用 して 蛍 光剤 等 を導 入 して い る 場 合 もあ る31)。後 述 す る よ う に こ の種 の ア ンチ セ ンス 分 子 はAIDSウ イ ル ス(HIV)の 活 性 制 御 に 大 き な効 果 を示 して い るが,そ の 際 ア ンチ セ ンス機 構 以外 の 機構 で 効 果 が 発 現 され て い る可 能性 が 示 唆 され て い る 。様 々 な機 構 が 考 え られ るが,ホ ス ホ ロ チ オ エ ー ト結 合 の 反応 性 の 高 さ も関 係 して い る もの と考 え られ る。 リ ン酸 結 合 の すべ て が ホ ス ホ ロチ オ エ ー ト結 合 で あ る ア ンチ セ ンス分 子 の 場 合 水 に対 す る溶 解 度 が小 さ く,精 製 の過 程 で 問題 とな るが,ア ンチ セ ンス分 子 と して生 体 系 に用 い る に は差 し 支 え な い と思 わ れ る。 3.2.4. ホ スホ ロ ジチ オ エ ー ト結 合 ホ ス ホ ロ チ オエ ー ト結 合 はp-キ ラ ル で あ り,ま たS型 の結 合 は ヌ ク レア ー ゼP1で 加 水 分 解 され る た め ホ ス ホ ロ ジ チ オエ ー ト結 合 (VI)が 考 案 さ れ た 。 ビス ア ミダ イ ト法 に よ るDNA合 成 (VI) 法 を 一部 変 換 す る こ とで ホ ス ホ ロ ジチ オエ ー ト結 合 が形 成 され る 。 ビ ス ア ミ ダ イ ト(19)を2,4-ジ ク ロ ロベ ン ジ ル メ ル カ プ タ ンで チ オ ア ミダ イ ト(20)に 変換 し,テ トラ ゾ ー ル を 活 性 化 剤 と して 固 相 で3と 反 応 させ,続 い て S8の ピ リ ジ ン/CS2/ジ オ キ サ ン 溶 液 で 酸 化 処 理 して (21)ボ スホ ロ ジチ オエ ー トオ リ ゴマ ー(22)が 得 ら れて い る32)。S8に よ る酸 化 反 応 は1,/H2O/THF系 で の 酸 化 よ り 遅 く400秒 程 要 し,最 終段 階 の 脱 ジ ク ロ ロ ベ ンジ ル はチ オ フ ェ ノ ー ル/TEA/ジ オ キサ ン系 で20時 間 要 す る。 この 結 合 は 立 体 異 性 を示 さず,対 象 遺 伝 子 とODNと 同
19 20 21 22 様 の 安 定 な二 重 鎖 を形 成 す る もの と期 待 され る。 3.2.5. ホ ス ホ ロ ア ミデ ー ト結 合 ホ ス ホ ロ ア ミデ ー ト 結 合(W)は リ ン原 子 に ア ル キル ア ミノ基 が 直 接 結 合 して お り,生 理 的条 件 下 で は ほ と ん ど電 荷 が な く細 胞 膜 透 過 性,ヌ ク レア ー ゼ耐 性 が 期 待 さ れ る。 最 も容 易 な合 成 法 はH-ホ ス ホ ネ ー ト法 を経 由 す る もの で あ る。H-ホ ス ホ ネ ー ト結 合(23)は 四塩 化 炭 素 中1,2級 ア ミ ンに よ る酸 化 処 理 で ほ ぼ 定 量 的 にホ ス ホ ロ ア ミデ ー ト結 合 に変 換 さ れ る(24)13,33,34)。こ の 際 ジ ア ミ ン を用 い れ ばODNの リ ン酸 結 合 位 置 に ア ミ ノ基遊 離 型 ス ペ ー サ ー と して アル キ ル ア ミノ 基 が 導 入 され,ODNの 標 識 や,DNAプ ロ ー ブ (VII) 23 24 の合 成 に も用 い る こ とが で き る。 ビス ジエ チ ル ア ミノ ホ ス ホ ロ ク ロ リダ イ トに よ り得 られ る19を 固 相 合 成 反 応 に 適 用 し,得 られ る 中 間体25をtBuOOH/ト ル エ ンで 25 26 酸化 す る方 法 で もほ ぼ定 量 的 に ボ スホ ロ ア ミデ ー ト結 合 が 得 られ る35∼37)。こ の 方 法 はDNA自 動 合 成 機 に も応 用 で き,ア ンチ セ ンス 分 子 の 大 量 合 成 に役 立 つ もの と思 わ れ る。リン原 子 に関 す る立 体 異 性 は この結 合 に も存 在 し, そ の絶 対 配 置 が2次 元NMRに よ り決 定 され て い る38)。
通 常 絶 対 配 置 はX線 回折 に よ り決 定 さ れ る が39),2次 元 NMR法 は結 晶 化 の手 間 が か か らず 有 効 な方 法 に な る も の で あ ろ う。 しか し,今 少 しの デ ー タ の蓄 積 が 必 要 で あ る。 3.3. 耐 ヌ ク レア ー ゼ 活 性 を持 つ α-アノ マ ー型 ア ン チ セ ン ス 分子 リ ン酸 結 合 に 関す る修 飾 の他 に,リ ボ ー ス の 修 飾 に よる ア ンチ セ ンス 分 子 の 合 成 も行 わ れ て い る 。 天 然 のDNAのN一 グ リ コ シ ド結 合 は β-ア ノマ ー 型 (27)で あ る が α-アノ マ ー 型 の ア ンチ セ ンス 分 子 が 合 成 さ れ た 。 α-アノマ ー型 ヌ ク レオ シ ド(28)40)を出 発 原料 と 27 28 して 用 い て,β-ア ノマ ー型 ヌ ク レオ シ ドの場 合 と同 様 に保 護 な ら び に リ ン酸 化 を行 い,縮 合 反応 は 液相 トリエ ス テ ル法 に よ るブ ロ ック合 成 法 で,6量 体 が 得 ら れ て い る(収 率65%)41)。 他 方,ホ ス ホ ロ ア ミダ イ ト法 に よ る 固 相 合 成 も行 わ れ,収 率 は15量 体 で27%で あ っ た42)。 α-アノ マ ー 型ODNの 合 成 は β-アノ マ ー 型ODNの 場 合 と ほぼ 同 様 に行 う こ とが で き る。 α-ア ノマ ー型 ア ンチ セ ン ス分 子 は ヌ ク レア ー ゼ 耐 性 を示 し,β-ア ノマ ー 型ODNと 平 行 型 二 重 鎖 を形 成 す る とい う特 徴 が 明 らか に な って い る43)。 3.4. ア ンチ セ ン ス 分子 の 高機 能 化 前 節 で 紹 介 した 種 々 の 結 合様 式 を持 つ ア ンチ セ ンス分 子 を他 の機 能 を持 つ 分 子(結 合 安定 化 能,細 胞 膜 透 過 性 能)と の複 合 化 に よ る ア ンチ セ ンス分 子 の 高機 能化 が 行 わ れ て い る。 3.4.1. イン タ ー カ レー タ ー を有 す る ア ンチ セ ンス 分 子 DNAあ る い はRNAの 二 重 鎖 に 色 素 な ど の イ ン ター カ レー ター が結 合 す る と,そ の二 重 鎖 は安 定 化 す る こ とに 注 目 し44),チ ミジ ル 酸2量 体 にホ ス ホ ロ ア ミデ ー ト結合 を介 して イ ン ター カ レー タ ー(フ ェナ ン トロ ジ ン誘 導体) を 導 入 した 誘 導 体(29)が 合 成 され た45)。天 然 型 の2量 体 は 通 常 の 条 件 で は ポ リ(A)と ほ とん ど相 互 作 用 しな い が 29 29は 強 く相 互 作 用 した(融 解 温 度(Tm):45℃)。 予 想 ど お りイ ンタ ー カ レ ー ター に よ るハ イ ブ リ ッ ド安 定 化 が 観 測 され て い る。 さ らに,オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドの3'-リ ン 酸 基 に ω-ヒ ドロ キ シ ル ア ル キ ル ア ミ ノア ク リジ ン誘 導 体 を縮 合 剤(メ ジチ レ ンス ル ポ ニ ル テ トラゾ リ ド)に よ り 導 入 した も の(30)46)が合 成 さ れ た 。30の ス ペ ー サ ー の 30 メ チ レ ン 鎖 長 は イ ン タ ー カ レ ー タ ー の 機 能 に 大 き な 影 響 を 与 え,二 重 鎖 はn=5,6の 時 最 も安 定 し た47)。 ホ ス ホ ロ ア ミ ダ イ ト結 合 の 酸 化 過 程 に ヨ ウ 素/ジ ア ミ ン 系 を 利 用 し,ア ル キ ル ア ミ ン を ス ペ ー サ ー と し て リ ン酸 基 に 導 入 し(導 入 効 率:56%),次 い で,ア ク リ ジ ン 誘 導 体(6-ク ロ ロ-9-(P-体(6-ク ロ ロ フ ェ ノ キ シ)-2-メ トキ シ ア ク リ ジ ン)と 反 応 さ せ た ア ン チ セ ン ス 分 子 も合 成 さ れ て い る48)。 ま た,リ ボ ヌ ク レ オ シ ドの2'-水 酸 基 を 利 用 して イ ン タ ー カ レ ー タ ー を 導 入 す る 方 法 も開 発 さ れ て い る49)。 こ の 場 合 ウ リ ジ ン の2',3'-水 酸 基 を ジ ブ チ ル チ ン オ キ シ ドで 活 性 化 し た 後(31),プ ロ モ メ チ ル ア ン ト ラ キ ノ ン をCsF 存 在 下 で 作 用 さ せ32を 得 て い る 。2'-置 換 体 と3'-置 換 31 32 体 と の生 成 比 は ほ ぼ1:1で あ り,そ れ らは シ リ カゲ ル カ ラ ム で 容 易 に分 離 さ れ る 。2'-置 換 体 は ホ ス ホ ロ ビ ス ア ミ ダイ ト型 に変 換 さ れ オ リゴ ヌ ク レオチ ドの 中 間位 置 に 導 入 され て い る。 ま た,イ ンタ ー カ レ ー タ ー は塩 基 部 分 に も導入 され て い る50)。 イ ン ター カ レー タ ーの 導 入 はい ず れ の 場 合 も二 重 鎖 の 安 定性 を高 め た。 細 胞 膜 透 過 性 に関 して 報 告 は少 ない が イ ン ター カ レー タ ー分 子 の 性 質 に大 き く依 存 す る と思 わ
れ る。 イ ン ター カ レー ター の導 入 位 置 は末 端 リ ン酸 基, 中 間 リ ン酸 結合 部位,塩 基 部 分 等 が 選 ばれ て い るが,ア ンチ セ ンス 分 子 と して の機 能 の点 で は大 差 が ない よ うで あ る。 3.4.2. 共 有 結 合 で対 象DNA/RNAと 結 合 す る官 能 基 を持 つ ア ン チ セ ン ス 分 子 二 重 鎖 の形 成 が 水 素 結 合 に よ る もの で あ り,一本 鎖 状 態 との 間 で平 衡 が存 在 す るた め, 遺 伝 子 の対 象 部 分 の被 覆 が場 合 に よっ て は外 れ る こ と も 有 り得 る。 従 って ア ンチ セ ンス分 子 を何 等 か の 方 法 で 対 象 遺 伝 子 と共 有 結 合 させ れ ば,不 可 逆 的 に遺 伝 子 の 発 現 を制 御 す る こ とが 可 能 で あ る 。 紫 外 線 照 射(365nm)で ピ リ ミジ ン塩 基 と シ クロ ブ タ ン環 を形 成 して反 応 す る ソ ラ レ ン誘 導 体(4,5',8-ト リ メ チ ル ソ ラ レ ン,TMP,33) を ア ミノア ル キ ル化 し,ホ ス ホ ロ ア ミデ ー ト結 合 に よ り 5'-リ ン酸 化OMPの5'-末 端 に導 入 した ア ンチ セ ンス 分 子 が 開 発 さ れ た(34)51)。 こ れ ら導 入 反 応 は90%以 上 の 33 34 高 率 で 進 行 す る もの で 応 用 範 囲 が 広 い方 法 で あ る52)｡ソ ラ レ ン修 飾OMPは 選 択 的 に対 象 遺 伝 子 の特 定 部 位 に結 合 し,.ま たOMPの ア ンチ セ ンス 分 子 と して の 能 力 を増 大 した。 しか しなが ら,実 際 の 治 療 へ の利 用 に 関 して は 光 の照 射 可 能 な部 位 に しか 用 い られ な い とい う欠 点 が あ り,当 面 は皮 膚 疾 患 等 へ の 利 用 に限 定 され よ う。一 方, 活 性 な ア ル キ ル化 剤,例 え ば35や36を オ リゴ ヌ ク レオ 35 36 チ ドの3'あ る い は5'-位 に導 入 し た もの53),塩 基 部 分 に ア ル キ ル化 剤 を導 入 した もの54,55)等が 合 成 さ れて い る。 こ れ らア ル キ ル化 試 薬 の 反 応 性 は 高 く,高 い選 択 性 で 対 象 遺 伝 子 の塩 基 部 分 を アル キ ル 化 した 。 3.4.3. 細 胞 膜 に親 和 性 の 高 い 分 子 を導 入 した ア ンチ セ ン ス分 子 細 胞 膜 に親 和 性 の 高 い 分 子 をオ リゴ ヌ ク レオ チ ドに導 入 す る こ とで ア ンチ セ ンス 分 子 の細 胞 膜 透 過 性 を高 め る試 み が な され て い る。 細 胞 膜 を電荷 の観 点 か ら 眺 め た場 合 と疎 水 性 の 観 点 か ら眺 め た 場 合 とで 用 い る分 子 の構 造 が 異 な る。 前 者 の 例 と して 生 理 的 条 件 下 で 正 に 帯 電 し て い る ポ リ-L-リ ジ ン(PLL)が 選 ば れ た56)。3'-末 端 に リ ボ ヌ ク レオ チ ドを持 つ オ リゴ ヌ ク レオ チ ド を過 ヨー ド酸 酸 化 の 後NaCNBH3存 在 下PLLと 反 応 させ37 37 が 得 ら れ て い る。 こ の 場 合,PLLの 分 子 量 が ア ン チ セ ンス 効 果 に 大 き く影 響 し,分 子 量14000のPLLが 最 良 の結 果 を与 えて い る。 後 者 の 例 と して コ レス テ ロ ール が 選 ば れ て い る57)。こ の場 合 は ホ ス ホ ロ ア ミ ダ イ ト結 合 に スペ ーサ ー を介 して コ レステ ロ ール が オ リ ゴ ヌ ク レ オチ ドに導 入 さ れ て い る57)。いず れ の 分 子 も ア ンチ セ ンス 分 子 と して高 機 能 を獲 得 して い るが,具 体 的 な 膜 透 過 性 に つ い て は言 及 さ れ て い ない 。 3.4.4. DNAあ る い はRNAを 切 断 す る ア ン チ セ ン ス 分 子DNAあ る い はRNAを 単 に被 覆 す るの で はな く,不 可 逆 的 に切 断す る こ とで発 現 制 御 が 可 能 で あ る。 まず エ チ レ ン ジ ア ミ ン四 酢 酸(EDTA)-Fe錯 体 が 活 性 酸 素 を生 成 しDNAを 切 断 す る こ とが 着 目 さ れ58),EDTAを 有 す る ア ンチ セ ンス 分 子 が 開発 さ れ た59)。デ オキ シ ウ リジ ン の5位 に ス ペ ー サ ー ア ー ム を導 入 し,EDTA無 水 物 と反 応 させ る こ とで38を 得,そ れ を ホ ス ホ ロ ア ミダ イ ト法 38 に よ り オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド(19量 体)の 中 央 に 導 入 し て い る 。 ま た,EDTA無 水 物 を5'-ア ミ ノ ア ル キ ル リ ン 酸 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と 反 応 さ せ た39も 合 成 さ れ60),同 39
様 の 修 飾 はOMPに も施 さ れ た61)。一 方,フ ェナ ン ス ロ リ ン-Cu錯 体 も同様 のDNA切 断 活 性 を持 つ こ とか ら, フ ェナ ン ス ロ リ ンが オ リ ゴヌ ク レオ チ ドに ホ ス ホ ロ ア ミ デ ー ト結 合 を介 して 導 入 され た(40)62)。 40 41 42 以 上 の分 子 は い ず れ もDNAを 切 断 した が,切 断 部 位 の 塩 基 配 列 特 異性 は 大 き くな か っ た。 こ の理 由 はEDTA は ア ンチ セ ンス分 子 に よ り対 象遺 伝 子 の特 定 部 位 に運 ば れ るが,そ こで生 成 した活 性 酸 素 が あ る程 度 の 濃 度 分 布 を持 って拡 散 した結 果 と考 え られ る。 3.5. そ の 他 以 上 の 他,カ ル バ メ ー ト結 合 を 持 つ 41や42な どが 最 近 開 発 さ れ て き て い る63,64)。こ う した 新 規 の 結合 様 式 を持 つ ア ンチ セ ン ス分 子 は たぶ ん今 後 も 発 表 され る と思 わ れ るが,そ の効 果 まで 予 測 して分 子 設 計 し合 成 す る こ とが で きる かが 重 要 で あ る。 4. ア ン チ セ ン ス 分 子 の 性 質 前節 まで に報 告 した種 々 の ア ンチ セ ン ス分 子 につ い て そ れ らのin vivo系,in vitro系 にお け る挙 動 を ま とめ る。
4.1. 細 胞 膜 透 過 性 図3に 示 した の はOMPの 細 胞 透 過 特 性 で あ る 。1.5時 間 ま で 直 線 的 に 取 り込 まれ, 100μMの 初 期 添 加 濃 度 条 件 で 細 胞 中 の 濃 度 は117μM に 達 した65)。この 値 はOMPが 細 胞 に濃 縮 さ れ た こ と を 示 して い る。34も 高 い 透 過 性 を示 しTMPの 存 在 は影 響 を与 え て い な い。 一 方,ODNは 透 過 性 が 低 い と考 え ら れ て きた が,4時 間 の 培 養 で 細 胞 内部 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド濃 度 は1.5μMに な り(初期 添 加 濃 度20μM),ウ イ ル スRNA濃 度 の1万 倍 にお よ ぶ とい う試 算 が あ る66)。 も っ と もこ の場 合 細 胞 培 養 液 系 に は血 清 は含 まれ て い な い こ とに 留 意 す べ きで あ ろ う。PLLや コ レス テ ロ ー ル を有 す る ア ンチ セ ンス 分 子 に 関 して 透過 性 実験 は行 わ れ て い ない が,そ れ らの 有効 作 用 濃度 が非 修 飾 ア ンチ セ ン ス 分 子 に 比 べ 数10分 の1(nMの オ ー ダー)に まで 減 少 した こ と は細 胞 へ の 透過 性 が増 した た め と考 え られ る 。 4.2. 耐 ヌ ク レア ー ゼ活 性 種 々 の ア ンチ セ ンス分 子 が 開発 され そ の 安 定 性 が 試 験 さ れ た 。 図4に5'-リ ン酸 基 を32Pで ラベ ル したODN(12量 体)お よびOMP(12量 体)を 通常 の細 胞 培 養 に用 い られ る10%血 清 で1分 間 か ら2時 間処 理 し,そ れ らの変 化 を ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 で 検 討 した 結 果 を示 した 。OMPは2時 間後 もほ ぼ 分 解 され な い ま ま残 っ た の に対 し,ODNは き わ め て 容 易 に 分 解 さ れ 短 鎖 分 解 物 を与 え た(半 減 期 約5 分)67)。ODNを 卵 母 細 胞 に マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョン に よ り導 入 した 場 合 も半 減 期 は10分 間 で あ っ た68)。α-ア ノ マ ー 型 ア ンチ セ ンス 分 子 をXenopusoocyteに マ イ ク ロ イ ンジ ェ ク シ ョン した場 合,8時 間 で40%の16量 体 が 分 解 され た に過 ぎ なか った 。 ホ ス ホ ロ ア ミデ ー ト結 合
Fig. 3 Transport of dGpGp [3H] T (○, 100μM) and d (Tp)8 [3H] T (●, 100μM) into transformed Syrian hamster fibroblasts at 37℃ 65).
Fig. 4 Stability of OMP (12 mer) and ODN (12 mer) in
10% serum . (15% PAGE) Incubation time : a.
5 min, b. 15 min, c. 30 min, d. 60 min, e.
120 min, f. 1 min, g. 2 min, h. 5 min, i. 15 min,
j. 30 min, k. 60 min, 1. 120 min67)
.
の安 定性 に 関 して は異 な る結 果 が 報 告 され て い る が,筆 者 らは分 解 さ れ な い とい う結 果 を得 て い る。 ホ ス ホ ロ ジ チ オ エ ー ト結 合 や カ ルバ メ ー ト結 合 等 は加 水 分解 を受 け な か っ た が,ボ ス ホ ロチ オエ ー ト結 合 の 場 合,そ の絶 対 配 置 がS型 の もの の み ヌ ク レ ア ーゼP1に よ り加 水分 解 され た26)。 4.3. DNA/RNAと の 結 合 安 定 性 中性 ア ンチ セ ン ス 分 子(例 え ばOMPや オ リ ゴ ヌ ク レ オ シ ドボ ス ホ ロ ア ミデ ー ト)はポ リア ニ オ ンで あ るDNAやRNAと の静 電 反 発 が 小 さ く,形 成 され る ハ イ ブ リ ッ ドが 安 定 に存 在 す る と考 え ら れ る 。OMPと ポ リヌ ク レオ チ ドと のTmを 表1に 示 した が,4量 体(d-ApApApA)のPoly(U),Poly (dT)と の ハ イ ブ リ ッ ドは 同 じ配 列 のODNに くらべ 安 定 で あ っ た65)。これ に対 し本 稿 で 取 り上 げ た数 種 の 中性 オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド(15量 体)とODNと を比 較 した 結 果, ODNは い ず れ の 中 性 ア ン チ セ ン ス 分 子 よ り も相 補 的 ODNと 安 定 な ハ イ ブ リ ッ ドを形 成 す る こ とが 報 告 され て い る34)。これ ら相 反 す る結 果 は ア ンチ セ ンス分 子 の 鎖 長,塩 基 配 列,立 体 異 性 体 の存 在 な どが二 重 鎖 の 安 定 性 に大 き く関 わ って い る こ とに よる と思 わ れ るが,詳 細 は 分 か って い ない 。 イ ン タ ー カ レ ー ター 分 子 との複 合 化 は いず れ の試 み に お い て も安 定 性 を著 し く増 大 させ た 。 4.4. 細 胞 毒 性 お よ び代 謝 性OMPの 細 胞 毒 性 は マ ウ スL-細 胞 を用 い て 検 討 され た が(150μM),細 胞 自 身 の タ ンパ ク質 合 成 や細 胞 増 殖 に な ん ら影 響 は み ら れ な か った 。 ア ル キ ル 化 剤 を導 入 した ア ンチ セ ンス 分 子 も 100μMま で は毒 性 を示 さな か っ た。3Hラ ベ ル化 チ ミジ
ン を含 むOMPをSyrian hamster fibroblastに 用 い た代
謝 試 験 で は,18時 間 後 に70%のOMPが そ の ま ま の形 で細 胞 抽 出液 か ら回収 され,残 りの30%の3Hは 細 胞 の DNA中 に,あ る い は チ ミジ ン ト リ リ ン酸 と して見 い だ さ れ た。OMPが 緩 や か で は あ るが 分 解 され 代 謝 さ れ て ゆ くこ と を示 して い る65)。そ の 他 の ア ンチ セ ンス 分 子 に つ い て は 報告 され て い な い 。 5. ア ン チ セ ン ス 分 子 を用 い た 遺 伝 子 制 御 の 実 例 以 上 紹 介 して きた ア ンチ セ ンス分 子 を実 際 に遺 伝 子 制 御 に用 い た例 を示 す 。 ア ンチ セ ンス分 子 が機 能 した か 否 か を判 定 す る こ とは 生 体 系 あ る い は培 養 細 胞 系 に用 い た 場 合 難 しい 。 従 って まず モ デ ル系 で効 果 が検 討 され て い る。 5.1. ウ サ ギ グ ロ ビ ン産 生 遺 伝 子 の 制 御69,70)対 象 遺 伝 子 と して は1次 構 造 が 明 らか に され て い る ウサ ギ グ ロ
Table 1 Interaction of OMP with complementary polynucleotides65)
50 ƒÊ M (nucleotide), 10 mMTris•HCl, 10 mMMgC12, pH 7.5, Underlines represent the methylphosponate linkage.
Fig.5 Partial nucleotide sequences of rabbit globin mRNA and OMP sequences. 〓 :initiation codon。
ビ ン を コ ー ドす る 祝RNA(α 型 お よ び β 型 の 混 合 溶 液) , タ ンパ ク質 合成 系 と して は ウサ ギ網 状 血 球 破 砕 液 を採用 し,OMPに よ る グ ロ ビ ン産 生 の制 御 を検 討 した。 図5 に α,β 型 の ウサ ギ グ ロ ビ ンの 塩 基 配 列(セ ンス領 域, 部 分)お よ びOMPの 塩 基 配 列(ア ンチ セ ンス 配 列)を 示 した 。 表2に 結 果 の 一 部 を示 す 。OMPは そ れ ら の配 列 に依 存 した形 で グ ロ ビ ン産 生 を制 御 した 。 阻 害効 率 は ア ンチ セ ン ス 分 子 の 鎖 長 ,作 用濃 度,mRNAの 対 象 領 域 等 に よ って 影 響 を受 け る こ とが 明 らか に な っ た。 特 に こ の 遺 伝 子 の 場 合 タ ンパ ク質 合 成 の 開始 コ ドン領域(配 列 1,2)と そ の 上 流(5′側,配 列3)を 被 覆対 象 と した 場 合 , α,β 両 グ ロ ビ ン産 生 を 阻 害 し,タ ンパ ク 質 コ ー ド領 域 を被 覆対 象 と した場 合(配 列4)選 択 的 阻 害 が み られ た 。 こ の 実 験 に 用 い ら れ た ア ンチ セ ンス 分 子 が対 象mRNA と 相 補 的 に 相 互 作 用 をす る こ と は 逆 転 写 酵 素 に よ る cDNAの 生 成 とそ の 遺伝 子 配 列 か ら確 認 され て お り71), 表2の 結 果 は ア ンチ セ ンス分 子 が ま さ に遺 伝 子 の 対 象 部 分 と相 互作 用 した結 果 生 じた もの と見 なす こ とが で き, ア ンチ セ ンス効 果 が 確 認 さ れ た と い え る。 また 配 列2は 加 熱 処 理(2次 構 造 を ア ンチ セ ンス 分 子 存 在 下 で 一 時 的 に破 壊 す る こ と)に よ り効 果 を示 し,こ の こ と か ら,配 列2の 対 象 とす るmRNAの 領 域 が2次 構 造 に組 み 込 ま れて い る こ とが 示 唆 され た 。 これ らの結 果 は高 機 能 化 に よ り顕 著 に な っ た。 光 架 橋 性 基(TMP)を 導 入 した34は,紫 外 線 照 射(365nm)に よ りRNA-OMPア ダ ク ツ を生 成 す る が,表2に 示 した よ う に5μMの 濃 度 で 明瞭 な選 択 的 タ ンパ ク質 合 成 阻害, す な わ ち選 択 的 遺 伝 子 制 御 が 行 わ れ て い る72)。 5.2. AIDSウ イル ス 制 御 ア ン チ セ ンス 法 の 実 用 化 を 目 指 し た 注 目 さ れ る 試 み と して はAIDSウ イ ル ス (HIV)の 制 御 に 関 す る研 究 が 挙 げ られ る。 用 い られ て い る ア ンチ セ ンス 分 子 はODN,ホ ス ホ ロチ オ エ ー ト結 合 型 分 子,メ チ ル ポ ス ホ ネ ー ト型分 子 等 で あ る 。最 も効 果 が 高 い の は ホ ス ホ ロ チ オ エ ー ト結 合 型 ア ンチ セ ンス分 子 で あ る 。HIV感 染 細 胞 の 生 存 率 を指 標 に した 制 御 試 験 で は,1μM程 度 でHIVの 活 性 を90%以 上 抑 制 して い る。 この 試 み で興 味 あ る点 は ア ンチ セ ン ス分 子 の 塩 基 配 列 が 効果 の発 現 に そ れ ほ ど寄 与 して い ない 場 合 が あ る と い う結 果 で あ る。 お そ ら くア ンチ セ ンス 機構 に加 え,他 の機 能 も作 用 して い る こ と を示 して い るが,詳 細 は解 明 され て い な い。 6. 終 わ り に ア ンチ セ ンスDNA・RNA法 に よ る遺 伝 子 発 現 制御 の 研 究 は近 年 加 速 され て きて い る。現 在 まで に報 告 され た 結 果 は当 初 意 図 した もの とは 異 な る もの もあ るが 興 味 あ る結 果 も出て い る。 これ は対 象遺 伝 子 あ る い は そ れ を持 つ 生 物 系 の 個 別 的事 情 に よる もの で あ ろ う。 そ れ で も遺 伝 子 の 塩 基 配 列 情 報 に基 づ い て分 子 設 計 が で き,新 しい タ イ プの 治 療 薬 開発 に つ な が る魅 力 あ る 方 法 で あ る こ と に は違 い な く,今 後 多 くの 生体 系 で試 み られ,確 実 な成 果 を生 み 出 す もの と確 信 して い る。 (平成 元 年11月30日 受 理)
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