薬物分析法の開発

(1)

API5000

TM

_LC/MS/MS

_{システムを}

用いた高速定量分析法の開発について

株式会社東レリサーチセンター株式会社東レリサーチセンター薬物動態研究室薬物動態研究室廣川廣川順一順一 Junichi_Hirokawa@trc.toray.co.jp Junichi_Hirokawa@trc.toray.co.jp

(2)

内容

1. 導入しているLC/MS/MS

2. 分析法確立までの留意点

3. MS/MS条件の最適化（キサンチン類の測定）

4. キサンチン類の前処理及び測定

5. API5000高速分析実験例

6. キャリーオーバー対策

7. トラブル事例と解決策

8. まとめ

(3)

1.

1. 導入している

導入している

LC/MS/MS

API 5000

API 5000（

（

AB/MDS Sciex

AB/MDS

Sciex）

）

UPLC

API 4000

（

AB/MDS

Sciex

）

Agilent1100

PAL

−

New wash

4000 QTRAP

（

AB/MDS

Sciex

）

Agilent1100

API 3000

（

AB/MDS

Sciex

）

Agilent1100

API 365

（

PE

Sciex

）

Agilent1100

TSQ Quantum

（

Thermo

Finnigan

）

TSQ 7000 API 2

（

Finnigan

MAT

）

TSQ 7000

(4)

1

1 -

-

1

1 .

.

導入している

LC/MS/MS

API5000

(5)

2

2 -

-

1

1 .

.

分析法確立までの留意点

測定条件

（１）分析カラム夾雑成分との分離を最優先ﾊｲｽﾙｰﾌﾟｯﾄ用分析カラム（高理論段数）の使用ｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄ，ｽﾃｯﾌﾟｸﾞﾗｼﾞｴﾝﾄを利用（２）オートサンプラーｷｬﾘｰｵｰﾊﾞｰ対策（洗浄溶媒，洗浄時間の検討，検量線範囲，注入量等）（３）質量分析計ﾏﾄﾘｯｸｽ効果の低減化ｲｵﾝ化の飽和ﾃﾞｰﾀﾎﾟｲﾝﾄ数クロストーク分解能

(6)

2

2 -

-

2

2 .

.

分析法確立までの留意点

測定条件の設定（標準溶液使用）

定量下限

で使用する溶媒

移動相

A

ギ酸，酢酸を含む水

ギ酸アンモニウム，酢酸アンモニウム

B

アセトニトリル，メタノール

カラム

ODS,

C8

，

HILIC

条件

グラジエント

10

10 -

-

90%B

アイソクラティック

(7)

2

2 -

-

3

3 .

.

分析法確立までの留意点

洗浄溶媒の検討

定量

上限の溶液

キャリーオーバーの確認

Agilent Agilent11001100 UPLC UPLC CTC

CTC PALPAL new wash new wash

シリンジの大きさ

シリンジの大きさ (24 (24 µµL, 55 L, 55 µµL)L)

強洗浄溶媒

2

2--propanol/MeCN/HCOOHpropanol/MeCN/HCOOH，，SDS/SDS/MeCNMeCN，，NHNH₃₃/H/H₂₂O/MeCNO/MeCN 弱洗浄溶媒弱洗浄溶媒移動相（初期移動相）移動相（初期移動相）洗浄溶媒の種類によって保持時間に影響を及ぼすので注意洗浄溶媒の種類によって保持時間に影響を及ぼすので注意 1 1 種種 2 2 種種 2 2 種種

(8)

2

2 -

-

4

4 .

.

分析法確立までの留意点

前処理条件の検討

前処理前処理除タンパク（ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ，メﾀﾉｰﾙ等）除タンパク（ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ，メﾀﾉｰﾙ等）除タンパクフィルター除タンパクフィルター緩衝液での希釈（尿）緩衝液での希釈（尿）液液液液抽出抽出固固相相抽出（逆相，イオン交換等），抗体ｶﾗﾑの利用抽出（逆相，イオン交換等），抗体ｶﾗﾑの利用注意点注意点除タンパク除タンパク小刻みにボルテックスによる攪拌小刻みにボルテックスによる攪拌液液液液抽出抽出採取する位置採取する位置固相抽出固相抽出洗浄溶媒洗浄溶媒抽出溶媒抽出溶媒

(9)

2

2 -

-

5.

5. 分析法確立までの留意点

分析法確立までの留意点

前処理及び測定条件の確認

前処理前処理検量線上限検量線上限検量線検量線下限下限ブランクブランクサンプルサンプルゼロサンプルゼロサンプル測定条件測定条件夾雑成分との分離夾雑成分との分離定量下限定量下限検量線範囲の確認検量線範囲の確認キャリーオーバーの確認キャリーオーバーの確認 S/N S/N ≥≥ 55 上限は飽和しないか？上限は飽和しないか？注入量を減らす注入量を減らす試料濃度を薄くする試料濃度を薄くする検量線検量線上限の設定を下げる上限の設定を下げる

(10)

2

2 -

-

6

6 .

.

分析法確立までの留意点

その他注意すること

最適化最適化多成分同時分析多成分同時分析感度の悪いものに最適化する感度の悪いものに最適化する感度のよすぎるものに対しては最適値からずらす感度のよすぎるものに対しては最適値からずらす再溶解での注意点再溶解での注意点多成分では溶解度に差があるため，有機溶媒を先に添加多成分では溶解度に差があるため，有機溶媒を先に添加ボルテックスによる攪拌、超音波処理を入念に行うボルテックスによる攪拌、超音波処理を入念に行う溶媒量を増やし、濃度を薄くし、注入量を増やす溶媒量を増やし、濃度を薄くし、注入量を増やす希釈での注意点希釈での注意点水系が多い溶媒での希釈は吸着がおこる可能性が高い水系が多い溶媒での希釈は吸着がおこる可能性が高い移動相より有機溶媒比が高い溶媒では注入後，ピーク割れやピーク形状移動相より有機溶媒比が高い溶媒では注入後，ピーク割れやピーク形状が悪くなるが悪くなる

(11)

3

3 -

-

1.

1. MS/MS

MS/MS

条件の最適化

キサンチン類の構造式

キサンチンのメチル誘導体である

テオフィリン，テオブロミン

，

カフェインは

大脳皮質及び延髄の興奮により，

中枢機能および循環機能の亢進を起こす．

これらのメチルキサンチンは天然に存在する．

N N N H N O CH₃ H₃C O

Theophyline Theobromine Caffeine

HN N N N O CH₃ O CH₃ N N N N O CH₃ H₃C O CH₃ xanthine HN N H N H N O O コーヒーの種子：カフェインコーヒーの種子：カフェイン茶の葉：カフェイン，テオフィリン茶の葉：カフェイン，テオフィリンココア：テオブロミン，カフェインココア：テオブロミン，カフェイン

(12)

3

3 -

-

2

2 .

.

MS/MS

条件の最適化

キサンチン類の構造式と分子量

スペクトル測定スペクトル測定溶解度溶解度アセトニトリルアセトニトリルメタノールメタノール水 HN N N N O CH₃ O CH₃ N N N H N O CH3 H₃C O xanthine

Theophyline Theobromine Caffeine

N N N N O CH₃ H₃C O CH₃ HN N H N H N O O M.W. 194 M.W. 180 M.W. 180 M.W. 152 Caffeine-d_{M.W. 197}3 I.S. I.S. 1 3 7 ○ ○ ○ ○ △ △ 水 N N N N O CH3 D3C O CH3 溶解度を知ることが，重要溶解度を知ることが，重要前処理，再溶解溶媒前処理，再溶解溶媒内標の選定内標の選定 d d体を選択しても，楽に定量はできないこともある体を選択しても，楽に定量はできないこともある

(13)

3-3.

MS/MS条件の最適化

Q1/Q3 の最適化

イオン化とはイオン化とは．．．．．．分子を気化させて，プロトンが負荷（正イオン分子を気化させて，プロトンが負荷（正イオン [M+H[M+H]]++_）_）プロトンを失うプロトンを失う（負イオン（負イオン [M[M–_–H]H]––）_） N N₂ Q1 Q1 [ [M+HM+H]]++ フラグメントイオン（フラグメントイオン（Q3Q3）） [( [(M-M-56)56)+H+H]]++ 2

1. Quantitative Optimization (Infusion) MS/MS Analysis を選択

Q1/Q3の設定6ピーク（Intensityの高いものから）

Declustering Potential (DP）, Colligion Energy （CE）, Collision Cell Exit Potencial (CXP) の最適化

2. Manual Tuning

Scan Type Q1 MS (Q1)

Product Ion MS2 (Q3) CE の値 10,20,30,40

(14)

3

3 -

-

4

4 .

.

MS/MS条件の最適化

Ion

optics p

ath

Q0 Q1 Q2 Q3 Orifice (OR) DP CE ST3 ST2 ST1 CXP EP

Collision Gas (CAD) Curtain Gas (CUR)

GS1

GS2

Temp

API-5000

DP: to minimize solvent cluster ions EP: guide and focus the ions

CE: accelerate into the Q2 collision cell

CXP: focus and accelerate the ions out of the collision cell

GS1 : nebulizer gas GS2: turbo gas

CUR: flow between the curtain plate and the olifice CAD: to fragment the precursor ions

TEM: to help evaporate the solvent

Compound-dependent

Source-dependent

(15)

3

3 -

-

5

5 .

.

MS/MS条件の最適化

API5000

と

API4000

でのマス

スペクトルデータの比較

（

Product ion scan

での結果

）

API5000 API5000 10 10 ng/mLng/mL 溶解溶媒での比較溶解溶媒での比較 API4000 API4000 CE30 Theophyline Theophyline m/z 181.1 CE30 m/z 181.1 30 30000000 1 155000000 Intensity Intensity 125 1250000 4 4000000 Intensity Intensity 水水//アセトニトリルアセトニトリル 0.1

0.1volvol%%AcOHAcOH//メタノールメタノール水

水/_/アセトニトリルアセトニトリル

0.1

0.1volvol%%AcOHAcOH//メタノールメタノール

m/z m/z

(16)

3

3 -

-

6

6 .

.

MS/MS条件の最適化

Theophyline

Theophyline 及び及びTheobromineTheobromine ののマス

マススペクトルデータ比較スペクトルデータ比較（（ Product ion scan での結果Product ion scan での結果）） Scan type Scan type Product ion Product ion MS2MS2 CE 20 CE 20,, 3030,, 4040 N N N H N O CH3 H3C O Theophyline Theobromine HN N N N O CH3 O CH3 m/z m m//zz1124.24.22 m m//zz69.69.00 CE40 CE30 CE30 CE20 Theobromine Theobromine Theophyline Theophyline m/m/zz181.1181.1 m m//zz181.1181.1 m m//zz113838.1.1 m m//zz96.196.1 m m//zz110.110.00 m m//zz69.069.0 30 30000000 Intensity Intensity 30 30000000 6 6000000 87 87000000

(17)

3

3 -

-

7

7 .

.

MS/MS条件の最適化

Theobromine

のマススペクトルと

クロマトグラム

及び

Theophyline

のクロストーク

181.4/138.1 181.4/138.1 181.4/110.0 181.4/110.0 181.4/69.0 181.4/69.0 Q1/Q3 Q1/Q3 Theobromine Theobromine 2 255000000 1 100000000 40 400000 Intensity Intensity Column

Column HypersilHypersilGold Gold , 2., 2.11mm mm i.di.d. x . x 550 mm, 0 mm, 1.91.9µµm, m, TermoTermo Mobile Phase A 1

Mobile Phase A 1 volvol% AcOH/H% AcOH/H22OO Mobile Phase B 1

Mobile Phase B 1 volvol% % AcOH/MeOHAcOH/MeOH Time program 0

Time program 0 →→1.51.5min A/B = min A/B = 9090/1/100→→ 4040//6060 Flow rate 600

Flow rate 600 µµL/minL/min

2 min m m//zz138.1138.1 m m//zz110.0110.0 m m//zz 69.069.0 Theophyline のクロストーク CE30 CE30 m/z 3 min Intensity Intensity 2 20000000000 m/z

(18)

3

3 -

-

8

8 .

.

MS/MS条件の最適化

Theophyline

及び

Theobromine

のクロマトグラム

（

Q1/Q3

の

選択）

Theobromine Theobromine

Theo

Theophylinephyline

181.3/ 181.3/138.2138.2 クロストークの影響もないクロストークの影響もない Q1/ Q1/Q3Q3 Intensity Intensity 9 9000000 25 250000 3 min 181.1/ 181.1/124.2124.2 1.5 min Column

Column HypersilHypersil Gold Gold , 2., 2.11 mm mm i.di.d. x . x 550 mm, 0 mm, 1.91.9µµm, m, TermoTermo Mobile Phase A 1

Mobile Phase A 1 volvol%% AcOH/HAcOH/H₂₂OO Mobile Phase B 1

Mobile Phase B 1 volvol%% AcOH/MeOHAcOH/MeOH Time program 0

Time program 0 →→1.51.5 min A/B = min A/B = 9090/1/100 →→ 4040//6060

Flow rate 600

(19)

3

3 -

-

9

9 .

.

MS/MS条件の最適化

3

3 化合物

化合物

+IS

の最適化

の結果

Theophyline Theophyline Theobromine Theobromine Caffeine Caffeine Caffeine Caffeine-d₃ Q1/

Q1/Q3Q3 _Theophyline_Theophyline _Caffeine_Caffeine _Theobromine_Theobromine 181.1/ 181.1/124.2124.2 181.3/ 181.3/138.2138.2 1 195.295.2//138.1138.1 198.2/ 198.2/138.2138.2 N N N H N O CH₃ H₃C O HN N N N O CH₃ O CH₃ N N N N O CH₃ H₃C O CH₃ N N H N CH₃ O _N N N CH₃ O CH₃ N O H₃C _HN O m/z 138 m/z 124 Theophyline Theophyline Theobromine Theobromine Caffeine Caffeine Caffeine Caffeine-d₃ DP EP DP EP CECE CXPCXP 80 10 80 10 2525 2525 100 14 100 14 2525 2020 90 14 90 14 2525 2020 90 12 90 12 3030 2020 N O H3C CAD

CAD CUR GS1 GS2 IS TEPCUR GS1 GS2 IS TEP 6

(20)

4

4 .

.

キサンチン類の前処理及び測定

測定方法

コンピュータが

2

2 台存在（パソコン画面が

台存在（パソコン画面が

2

2 台）

台）

API5000

を先に

wait

状態

UPLC

の測定を開始

問題点：それぞれにファイル名を入力する手間

UPLC

の

Injection

を感知して，

MS

(21)

4

4 -

-

1.

1. キサンチン類の前処理方法

キサンチン類の前処理方法

（固相抽出）

固相抽出総合カタログ固相抽出総合カタログSUPELCOSUPELCOより引用より引用 Discovery DSC Discovery DSC--1818 50 50 mg/1mLmg/1mL コンディショニングコンディショニング MeOH MeOH 0.5 0.5 mLmL H H₂₂O O 0.5 0.5 mLmL ウサギ血漿ウサギ血漿 100 100 µµLL 洗浄洗浄 5

5 volvol%% MeOHMeOH 0.5 0.5 mLmL

溶出溶出 MeOH MeOH 0.5 0.5 mLmL 窒素気流下窒素気流下乾燥乾燥再溶解_再溶解 1

1 volvol%% AcOH/MeOHAcOH/MeOH (90:10)(90:10) 100 100 µµLL 5 5 µµLL 注入注入

(22)

4

4 -

-

2

2 .

.

キサンチン類の前処理及び測定

キサンチン類の測定結果

Theophyline

Theophyline CaffeineCaffeine

Area ratio Area ratio 1 1--10001000 ng/mLng/mL 11--10001000 ng/mLng/mL Concentration (ng/mL) Concentration (ng/mL) Theobromine Theobromine Analyte Theophyline –0.00159 0.00677 0.9934 Caffeine 0.0165 0.0108 0.9969 Theobromine 0.0104 0.00216 0.9958 Calibration curve (y = a + bx )

Linear regression (1/x2weighting)

a b r

Area ratio ₅₅_-_-₁₀₀₀₁₀₀₀ _ng/mL_ng/mL

(23)

4

4 -

-

3

3 .

.

キサンチン類の前処理及び測定

Blank

sample

及び

LLQC

のクロマトグラム

Blank sample LLQC 1 ng/mL 1 ng/mL 5 ng/mL I.S. Theophyline Theobromine Caffeine 3 min 3 min 2000 1400 1200 3000 Intensity 5000 6000 2500 45000 Intensity Column

Column Super ODS, 2.0 mm Super ODS, 2.0 mm i.di.d. x 100 mm, 2.0. x 100 mm, 2.0µµm, TOSOHm, TOSOH Mobile Phase A

Mobile Phase A 1 1 volvol%%AcOH/HAcOH/H₂₂OO

Mobile Phase B

Mobile Phase B 1 1 volvol%%AcOH/MeOHAcOH/MeOH

Time program

Time program 0 0 →→3 min A/B = 88/123 min A/B = 88/12 Flow rate

Flow rate 600 600 µµLL/min/min Injection volume

Injection volume 55µµLL

(24)

5

5 -

-

1

1 .

.

API5000

高速分析実験例

(1)

プロスタグランジン（

PG

）類の構造式

COOH HO HO _OH COOH HO HO _OH COOH HO HO _OH OH COOH HO HO COOH HO HO _OH COOH HO HO _OH 11β-epi-PGF₂α 9β-PGF₂α 8-epi-PGF₂α 5-trans-PGF₂α PGF₂α 15-epi-PGF₂α 8 8--epiepi--PGFPGF₂₂αα は組織障害や疾病の悪化に関与，血管収縮作用を有する．は組織障害や疾病の悪化に関与，血管収縮作用を有する．

(25)

5

5 -

-

2

2 .

.

API5000

高速分析実験例

(1)

PG

の測定

従来法従来法 HPLC

HPLC：：ACQUITY UPLCACQUITY UPLCTMTM_(Waters)_(Waters)

分析カラム：

分析カラム：ACQUITY UPLC BEH C18, ACQUITY UPLC BEH C18, 100 mm

100 mm ××_{2.1 mm, 1.7}2.1 mm, 1.7 µµmm

移動相：

移動相：アセトニトリルアセトニトリル//水水//酢酢酸酸(30/70/0.01)(30/70/0.01) Flow rate

Flow rate：：0.4 0.4 mLmL/min/min Mass spectrometer

Mass spectrometer：：_{API5000 (AB/MDS}API5000 (AB/MDS SciexSciex)) HPLC

HPLC：：HP1100 (HP1100 (AgilientAgilientTechnologies)Technologies)

分析カラム

分析カラム：：SuperspherSuperspherRPRP--8 (125 mm ×8 (125 mm × 4.6 mm, 4 4.6 mm, 4 µµm)m)

移動相：アセトニトリル

移動相：アセトニトリル//水水//酢酸酢酸(30/70/0.01)(30/70/0.01) Flow rate

Flow rate：：_0.40.4 mLmL/min/min Mass spectrometer

Mass spectrometer：：TSQ7000 (Thermo Electron)TSQ7000 (Thermo Electron)

8-epi-PGF2α PGF₂α 9β-PGF2α 11β-PGF2α 8-epi-PGF₂α 5-trans-PGF2α PGF2α 15-epi-PGF2α 5 min 5 min 25 min

(26)

5

5 -

-

3

3 .

.

API5000

高速分析実験例

(2)

アンジオテンシン類のアミノ酸配列と

マススペクトル

レニン・アンジオテンシン系は生体のレニン・アンジオテンシン系は生体の血圧調節及び電解質バランスの維持血圧調節及び電解質バランスの維持に重要な役割をはたしている．に重要な役割をはたしている． Ang Ang I I はは1010残基のアミノ酸からなる残基のアミノ酸からなるペプチドで，肝臓で産生されるペプチドで，肝臓で産生されるアンジオテンシノーゲンに，腎臓で主にアンジオテンシノーゲンに，腎臓で主に産生されるレニンが作用することによって産生されるレニンが作用することによって遊離されることが知られている．遊離されることが知られている．アンジオテンシン変換酵素により，アンジオテンシン変換酵素により， Ang Ang IIののC_C末端側のアミノ酸残基が末端側のアミノ酸残基が2₂つ切断つ切断されたされたAngAng IIIIは，血管収縮や，水・電解質は，血管収縮や，水・電解質の再吸収促進など，様々な生理機能の再吸収促進など，様々な生理機能を発揮し，血圧を上昇の方向へと導いているを発揮し，血圧を上昇の方向へと導いていると考えられている．と考えられている． Ang

Ang IIIIIIははAng_Ang II_IIののN_N末端のアミノ酸残基が末端のアミノ酸残基が

1 1つ切断されたペプチドである． NH2―Asp―Arg―Val―Tyr―Ile―His―Pro―Phe―His―Leu―OH NH2―Asp―Arg―Val―Tyr―Ile―His―Pro―Phe―OH NH₂―Arg―Val―Tyr―Ile―His―Pro―Phe―OH Angiotensin I (Ang I)

Angiotensin II (Ang II)

Angiotensin III (Ang III)

[M + H]+ [M + 2H]2+ [M + 2H]2+ In te n si ty In te n si ty In te n si ty [M + H]+ [M + H]+ [M + 2H]2+ m/z 649 m/z 524 m/z 467 Ang I Ang II Ang III m/z 649 → 269 m/z 524 → 263 m/z 467 → 263 つ切断されたペプチドである． m/z

(27)

5

5 -

-

4

4 .

.

API5000

高速分析実験例

(2)

アンジオテンシン類の測定

ZORBAX Poroshell 300Eztend-C18 2.1 mm x 75 mm, 5µm

Mobile phase A: 10 mmol/L ammonium formate (pH 10) B: Acetonitrile

Gradient A/B=90/10→50/50→90/10 (0.0→6.0→6.1 min) Flow rate 0.20 mL/min

20 ng/mL Angiotensin I Angiotensin II Angiotensin III [Val5_{]-Angiotensin I} [Val5_{]-Angiotensin II}

[Val4_{]-Angiotensin III}

3 3 2 2 1 1 0 0 上清を濃縮乾固上清を濃縮乾固血漿血漿 0.5 _0.5mmLL ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ ₁₁_m_m_L_L LC/MS/MS 5 LC/MS/MS 5 µµL L 注入注入内標準物質内標準物質攪拌，遠心分離攪拌，遠心分離移動相移動相 0.1 _0.1mmLL 4 4 前処理フロー前処理フロー保持時間（分）保持時間（分）

(28)

6.

6. キャリーオーバー

キャリーオーバー

対策

問題点：問題点：・定量値へ与える影響は大・定量値へ与える影響は大・繰り返し分析により，バックグランドが上昇・繰り返し分析により，バックグランドが上昇・次の試料のクロマトグラムの形状，定量値への影響・次の試料のクロマトグラムの形状，定量値への影響対策：対策：・高濃度のサンプルを注入しない．検量線範囲の見直し・高濃度のサンプルを注入しない．検量線範囲の見直し・夾雑成分などの汚れにより誘起される場合もあるため，・夾雑成分などの汚れにより誘起される場合もあるため，精製度の低い試料の注入は控える．精製度の低い試料の注入は控える．・

・time program time program において有機溶媒比を高い設定にして，において有機溶媒比を高い設定にして，

カラムの洗浄工程を加える．カラムの洗浄工程を加える．・配管の繋ぎ目，インジェクションポートの洗浄・配管の繋ぎ目，インジェクションポートの洗浄・測定後は，有機溶媒・測定後は，有機溶媒//水等（水等（2-2-propanol/Hpropanol/H₂₂OO）で洗浄する）で洗浄する

(29)

6

6 -

-

1.

1. キャリーオーバー

キャリーオーバー

対策

-

1

1 UPLC

UPLC

洗浄システムの構造

弱溶媒弱溶媒強溶媒強溶媒

(30)

6

6 -

-

2

2 .

.

キャリーオーバー対策

-

2

（

CTC PAL New wash station

）

サイドポートサイドポート Pump 1 Pump 1 Pump 2 Pump 2 シリンジシリンジニードルニードル Injection Port Injection Port Wash

Wash StationStation

プランジャープランジャー Wash 1 Wash 1 Wash 2 Wash 2

(31)

6

6 -

-

3

3 .

.

キャリーオーバー対策

-

2

（

New wash station

の

time

program

）

1 pre clean with sol 2 1

2 Neelde outside clean sol 1 2

3 Neelde outside clean sol 2 2

4 Neelde inside clean sol 1 1

5 Loop Rinse Time sol 2 (s) 6

6 Air vol up (uL) 2

7 Air vol down (uL) 2

8 SP syringe clean time 1(s) 10

9 SP syringe valv clean time 1(s) 10

10 SP syringe valv clean time 2(s) 5

11 Valve clean time sol 1 (s) 5

12 Valve clean time sol 2 (s) 5

13 Valve switch cycle 10

14 V_switch interval (s) 2 ニードル外側洗浄ニードル外側洗浄ニードル内側洗浄ニードル内側洗浄サンプルループ洗浄サンプルループ洗浄サンプルをエアで挟み込むサンプルをエアで挟み込むサイドポートからシリンジ洗浄サイドポートからシリンジ洗浄サイドポートからバルブ洗浄サイドポートからバルブ洗浄ポンプからバルブ洗浄ポンプからバルブ洗浄

(32)

6

6 -

-

4

4 .

.

キャリーオーバー対策

-

3

（

Agilent1100

：

Injection time

program

の設定）

1 draw def. amount from sample

2 needle to wash port

3 needle to wash port

4 needle into location 91

5 inject

6 wait 0.60 min

7 valve bypass

8 draw 80.0 uL from location 92

9 eject 80.0 uL from into air

10 draw 80.0 uL from location 93

11 eject 80.0 uL from into seat max speed

12 wait 3.5 min 13 valve mainpass 14 valve bypass ニードル外側洗浄ニードル外側洗浄 Vial 91 Vial 91でニードル洗浄でニードル洗浄 Vial 92 Vial 92の洗浄溶媒の吸入の洗浄溶媒の吸入シートの洗浄シートの洗浄 Vial 93 Vial 93排出の洗浄溶媒の吸入の洗浄溶媒の吸入排出測定時間測定時間 Valve Valveの洗浄（メインパス）の洗浄（メインパス） Valve Valveの洗浄（バイパス）の洗浄（バイパス）

(33)

7

7 -

-

1.

1. トラブル事例と解決策

ピークが検出されない，感度が悪い

MS

の汚れ

洗浄液

洗浄場所

確認

2

2 -

-

propanol

50

50 vol%MeOH/H2O (1

vol%MeOH/H2O (1

vol

% HCOOH)

Curtain plate, Orifice, Probe

Spray needle

(34)

7.2.

7.2. トラブル事例と解決策

ピークが検出されない，感度が悪い，保持時間の変動ピークが検出されない，感度が悪い，保持時間の変動

HPLC

の問題

ライン及びバルブの洗浄

サンプルループ

10,

20

20 uL

uL

ピークチューブ

太さ

移動相の

pH

変化

移動相の置換が不十分

ポンプの故障？

(35)

7.3.

7.3. トラブル事例と解決策

トラブル事例を解決するために

トラブル事象が起こった直前の作業を見直すこと

１つ１つ原因を解明

一度に複数の要因を変更しない

トラブルをよく観察する

マスクロマトグラムの観察

測定機器の動作確認

(36)

8.

8. まとめ

まとめ

１１ API5000API5000高速分析は医薬品の開発スピードを上げるためには有用高速分析は医薬品の開発スピードを上げるためには有用２２高速高感度分析を行うためには高速高感度分析を行うためには Q1/Q3 Q1/Q3，前処理，測定条件の最適化が必要，前処理，測定条件の最適化が必要キャリーオーバー（洗浄溶媒の選択）キャリーオーバー（洗浄溶媒の選択）キサンチン類の測定を行い，キサンチン類の測定を行い， Theophyline

Theophyline Caffeine Caffeine に関してはに関しては 1-1-10001000 ng/mLng/mL

Theobromine Theobromine に関してはに関しては 5-₅-10001000 ng/mL_ng/mL で検量線の直線性が得られた．で検量線の直線性が得られた．３３トラブルになった時はあわてずに観察することトラブルになった時はあわてずに観察すること最後まであきらめない最後まであきらめないご清聴ありがとうございました．ご清聴ありがとうございました．