遺伝子操作合成ヒトインスリンによる糖尿病の治療

シンポジウム

遺伝子操作の基礎と臨床

〔書女難，。第麟63鵜〕

遺伝子操作合成ヒトインスリンによる糖尿病の治療

東京女子医科大学 第3内科学教室（主任：平田幸正教授） タ サカ ヨシ マサ

田 坂 仁 正

（受付 昭和63年2月4日）

Treatment of Diabetes Mellitus by Human Insulin Engineered Genetically through Recombinant DNA Technique in E． Coli

Yoshimasa TASAKA

Department of Internal Medicine III（Director：Prof． Yukimasa HIRATA）

Tokyo Women’s Medical College

Double blind studies were done on insulin−treated diabetics to evaluate and compare the efficacy of human insulin（recombinant DNA of A and B chain of insulin）（HI（rDNA））with that of purified pork insulin（PI）， and also another double blind studies were conducted on two human insulins， one is HI（rDNA）and the other is HI−pro（rDNA）which is genetically produced from proinsulin． In HI（rDNA）一 treated patients， fasting plasma glucose was elevated to some extent shortly after initiation of the study， and the increase of HbAI and insulin requirement was observed． The binding of anti−human insulin antibody decreased slightly in HI（rDNA）group compared with P工The anti−E． coli polypeptide titer showed no change in both group． Between HI−pro（rDNA）and HI（rDNA）no difference was found in the amount of insulin used and in HbAIc level．

On the basis of the above results， it is assumed that both HI（rDNA）and HI−pro（rDNA）are useful insulin for the treatment of diabetes．

緒 言 近年遺伝子工学の発達によりペプチドホルモン のアミノ酸配列より考えられるDNA断片を化学 的に合成しこれを大腸菌プラスミドDNAと連結 させてヒトインスリンを合成することが可能と なってきた1）．最近までは主にウシ，ブタインスリ ンが糖尿病治療に用いられてきたが，ウシならび にブタを主とする限り開発途上国における糖尿病 患者の増加を考慮すると20世紀末には全世界的に インスリンの枯渇が想定され2），かかる点におい てもヒトインスリンの大腸菌合成は誠に時機を得 た生化学の進歩である． 現在使用中の遺伝子操作合成ヒトインスリン 〔以下HI（γDNA）〕は米国リリー社による大腸菌 にインスリンA鎖，B鎖を産生させてインスリン

に変換させたものである（図1）．このHI

（γDNA）は，近くヒトプロインスリン用遺伝子を 大腸菌プラスミドに入れてヒトプロインスリンを 産生しヒトインスリンに転換する方法のインスリ ンにとってかわる予定である．これとは別にデン マーク，ノボ社による酵母にインスリン前躯体を 産生させ培養液中の分泌インスリン前躯体よりヒ トインスリンを精製する方法もある3）4）．本研究で はA鎖，B鎖法によるインスリンの効果ならびに プロインスリン法によるインスリン効果を各々従 来の動物インスリンとのdouble blindにて比較， その効果を検討したので成績を報告する．また一 部インスリンアレルギーについても若干検討し

ヒトインシュリンA鍔｛入』1二遺伝」㌃ 組み込みプラスミド

。

トリプトファン合成酵素遺伝一Fと インシュリンA鎖遺伝子 大腸菌への 鍵 組み込み 、『．

o

酵素 タンパク ム

伽

タンパク 合 成 ヒトインシュリンB釘〔入二1二遺伝子 組み込みプラスミド

。

灘 分離・精製 トリプトファン合成酵素遺伝子と インシュリンB鎖遺伝子 瀞 大腸菌への 組み込み

o

酵素 タンパク

伽

翻 酵素タノパクーメチオニ／一A鎖 酵素タ／パクーメチオニ／一B鎖 A鎖 A一（SSOゴ）4 CNBrによる処理 スルホン化 B鎖 B一〔SSO3つ2

鞭離灘鍵顯蔑熱購織灘議

精製 A 鎖l

B鎖 ”，＼s 蓼層

z ，7・・1Q，11＿151・17旧5 、／ ／ ，。 6 s 29 7 25 9 1 ． 25 1011 1 1 23z4 図1 大腸菌合成ヒトインスリンの製法 た． 対象および方法 1．大腸菌合成ヒトインスリンm（γ1）NA）と 精製ブタインスリン（PI）との二重盲検比較試験 対象はインスリン投与を必要とする糖尿病患者 であり，少なくとも過去1年間の治療歴が明確な 者で，最近6ヵ月間ウシ製剤を使用していない者 である．薬剤として被験薬はHI（γDNA）レギュ ラー製剤40単位／mlとHI（γDNA）NPH製剤40 単位／ml，対照薬はPIレギュラー製剤40単位／lnl とPI NPH製剤40単位／mlである．使用薬剤は症 例個々にblind下で割付けた．投与方法は患者の

病態に応じて主治医がレギュラー製剤NPH製

剤あるいは両製剤併用を選択し，皮下注あるいは 静注した．また必要あれぽ分割投与を行った．投 与量は個々の症例に応じて血糖コントロールに要 する量を用い12ヵ月観察した．症例数は途中の脱 落症例を含めるとHI（γDNA）8例， PI 8例であ る． 2．ヒトプロインスリン法による生合成ヒトイ ンスリンHI・pro（γDNA）とA鎖十B鎖法によ る生合成ヒトインスリンHI（γDNA）との二重盲 検法 対象はインスリン投与を必要とする糖尿病患者

で原則として2ヵ月以上ヒューマリン製剤HI

（γDNA）を投与中の者である．被験薬はHI−pro （γDNA）レギュラー製剤40単位／m1ならびに HI−pro（γDNA）NPH製剤40単位／ml．対照薬に HI（γDNA）レギュラー製剤40単位／ml，または

HI（γDNA）NPH製剤40単位／mlで使用薬剤は

症例個々にblind下で割付けた．投与量は個々の 症例に応じて血糖コントロールに要する量，投与 回数を主治医が決定した．症例数は各5例ずつ， 投与期間は6ヵ月である． 1．では表1に示すごとく各時期に諸検査を行い また自覚症状，副作用をチェックした．2．では約 6ヵ月ほぼ1．と同様に検討した．インスリン抗体 価，E． coli蛋白抗体価はリリ一社の測定による． 表1 検査・調査項目および時期

時 期

?目 0 _{亀 為 角 角 角 角 賀 皆} 皮内テスト ○ ○ 空腹時血糖 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 尿糖・アセトン ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ Ecoli蛋白抗体価 ○ ○ ○

C

○ インスリ／抗体価 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ HbAエ ○ ○ ○ ○ ○

0

○ 血液一般 ○ ○ 血液生化学 ○

0

尿一般 ○ ○ 自覚症状・副作用 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 血液一般：赤血球数白血球数血色素量ヘマトクリッ ト 血液生化学：総コレステロール，中性脂肪，HDLコレステ ロール，NEFA， GOT， GPT， LDH， AL−P，

BUN，血清クレアチニン，尿酸，総蛋白

成 績

1．HI（γ：DNA）変更に伴う変化

1）HI（γDNA）変更に伴う血糖値の変化

PIよりHI（γDNA）（4例）またはPIよりPI

変更（8例）に伴うfasting serum glucose（FSG）

FSG （mg／d2） 300 200 100 ブタ→ヒトインスりン 300 0 3 6 9 12 200 ioo フ．_{^→ブタインスリン} の変化を検討した．個々の症例に伴う血糖の変化 は図2に示すごとくPI（ブタ）よりHI（γDNA） （ヒト）に変更すると4例中2例は血糖が初期より 中間期にかけて増加し一方PIよりPIの症例で はかかる傾向はみられなかった．9ヵ月まで血糖 測定点のそろった症例の平均値をとり検討した （図3）．PIよりHI（γDNA）に変更すると初期 （164±12mg／d1）より中間期（6ヵ月：212±41 mg／d1）にかけ血糖値は若干高値となった（本症例 数では有意差はない），同時期のPI→PIでは前 値164±31mg／dl，6カ，月値117±20mg／dlであっ た．同様の傾向はHbA、値からみても明らかであ りPI→HI（γDNA）では開始日10．0±0．6％が6 カ，月では12．3±1．8％に増加，PI→PIで9．0± 1．0％より9．3±1．1％とほぼ同程度であった（図 4）．HI（γDNA）変更に伴うこれらの変化は症例 HbAl 14 12 0 3 6 9 12ケ月 図2 ブタよりヒトまたはブタよリブタインスリン変 更に伴うFSGの変化 （認） 200 150 ○ブタ→ヒトインスリン④ ムブターブタインスリン（5） ｝OO O 3 6 9ヵ月前後 図3 ブタ．よりヒトまたはブタよりブタインスリン変 更に伴うFSGの変化 投 与 量 （∪） 30 25 20 15 1O 0 3 6 9ヵ月前後 図4 インスリン変更に伴うHbA1の変化 十

＼

Qブタ→ヒトインスリン ムブタ→ブタインスリン 0 3 6 9 12ヶ月 図5 インスリン変更に伴うHbA、の変化

数の点より統計的に有意差とはならなかった． 2）HI（γDN：A）変更に伴う使用インスリン量 の変化 PIよりHI（γDNA），またはPI→PIへのイン スリン変更における使用インスリン量の変化を追 求した．速効性インスリンの使用を含めて1日使 用・インスリン量で表現した（図5）．PI→HI （γDNA）開始日：19．2±2．4U／日（n 5），6カ，月： 20．4±1．9U／日，9カ，月：20．4±1．9U／日であり， PI→PIでは開始日：29．8±6．4U／日，6ヵ月： 26．8±7．5U／日， 9ヵ月：26．3±7．8U／日とむし ろ減少した．HI（γDNA）において中期より後期 にかけて増加傾向にあるのはこの時期における血 糖値の増加によるものであろう． 3）抗ブタ，ウシ，ヒトインスリン抗体および大 腸菌ポリペプチド抗体結合率の推移 抗ブタ，ウシ，ヒトインスリン抗体結合率なら びに大腸菌ポリペプチド抗体結合率の変化をPI →HI（γDNA）， PI→PI群について検討した． 抗インスリン抗体結合率はPI→HI（γDNA）群 では（図6），抗ブタ，抗ウシ，抗ヒトインスリン 抗体共にいずれも減少傾向を示したが，PI与PI 群では（図7），抗ウシインスリン抗体結合率の若 ％ 40 2Q o 抗ブタ ブタ→ヒトインスリン M±SE⑤ 。哲 ブタ→フタインスリン M±SE〔5） 抗ブタ

・・ドY／ト→

0 。哲 lo o 抗ウシ 2召 lO 0 CPM llo lOO go 抗大腸菌ポリペプチド 0 3 6 9ヵ月前後 図7 ブタよりブタインスリン使用に伴うインスリン 抗体ならびに抗大腸菌ポリペプチド抗体の変化 ％ 20 10 0 0 3 6 9 12 ％ 20 10 ヒト CPM 口o lQQ go 80 抗大腸菌ポリペプチド 0 3 6 9 12ヶ月前後 図6 ブタよりヒトインスリン変更に伴うインスリン ならびに抗大腸菌ポリペプチド抗体の変化 干の上昇が認められたが抗ブタ，抗ヒトインスリ ン抗体結合率には殆ど変化がみられなかった．抗 大腸菌ポリペプチド抗体結合率は両群とも特に変 化しなかった． 4）インスリンアレルギーおよびリポアトロ フィーに対する効果 〔症例〕患者：大0俊○，60歳男性． 病名：糖尿病，網膜症，神経症，肝癌の疑い， インスリンアレルギーの疑い． 昭和47年疲労感があって某医大病院を受診し， 慢性肝炎ならびに糖尿病と診断，ジメリンを内服 した．昭和62年6編めまいと動悸で入院．インス リン歴として昭和52年9月19日よりノボレンテ 16∼22U，54年7月18日よりMCインスリン26U， 56年2月16日よりイソスラタード28∼36U，61年 4月4日よりヒューマリンU−100を40U皮下注し た．血糖は食事とインスリンでほぼコントロール 良好，入院中肝癌様所見を発見した．第3病日に 右大腿部にヒューマリソN−10030U皮下注射し， 5分後に注射部位および左大腿部に対称性に盛 痒，腫脹が出現し，3∼4時間後に軽快した．イ ンスリン皮内反応としてヒューマリンRO．5Uに て（±），0．05Uにて（一），イソスラタードイン

スリン0．05Uにて（一）の反応であった．その後 は距離を離して深めに注射することによりアレル ギー症状はみられな：くなった． インスリンリポアトロフィーのヒトインスリン またはpuri丘ed insulinによる改善成績を既に報 告された症例よりまとめると表2のごとくであ る．今までのウシ，ブタインスリンによるりポア トロフィーにおいて大腸菌合成ヒトインスリンへ の変更により30例中70％に改善または治癒がみら れ，半合成ヒトインスリンを用いた場合にもほぼ 同様の治癒率をみた．表2の右端のpuri免d insu− Hnとは今までのウシ，ブタインスリンには不純な ものも混入していたために純化したものである が，純化ブタインスリンを用いただけでも相当数 に改善のみられたことを示している． 2．プロインスリン変換ヒトインスリンHI・

pro（γDNA）とHI（γDNA）との比較

HI（γDNA）使用者に二重盲検法に従って両イ ンスリンを使用，6ヵ月間の経過を観察した（図

8，9）．HI（γDNA）とHLpro（γDNA）間に

インスリン投与量に差はみられず，HbAlc値にも 両者間に差を認めなかった． HI（γDNA）ならびにHI−pro（γDNA）使用に おいて，12ヵ月または6ヵ月間使用してもいずれ 表2 インスリソリポアトロフィーに及ぼすヒトインスリンまたは純化ブタ インスリンの効果 症例 半合成ヒトインスリン

@（糖尿病Vol，27， Suppl，1，84） γDNAヒトインスリン

@（S−3300研究会） Puri丘ed insulin 数 6 30 38 性

｛ll

♂ 26．7％o♀ 73．3％ ｛1、1 効果 4例：治癒 Qヵ月∼約半年 Q例：不明 70％改善又は治癒 @治癒例 k撫上、期不 変 30％ Teuscher 6例全例 @ 2∼10ヵ月治癒 gulst 10例全例 @ 2ヵ月治癒 rakamoto：22例 @ 1年後80％ @ 治癒または改善 26 25 24 投 与23 量 （∪）22 21 20 OA十B→A十B（4） △A十B→プロインスlJン法（7） 19

0123456ケ月

図8 HI（γDNA）よりHI−pro（γDNA）に変更し た時のインスリン投与量の変化 A＋BはHI（γDNA）を示す．

一

一

／

HbAlc （％） 11 10 △A＋B一→プロインスリン法〔射

し＿一｛

M±SE 0 3 6ヶ月前後 図9 HI（γDNA）よりHI・pro（γDNA）に変更し た時のHbAlcの変化 A＋BはHI（γDNA）を示す．

も肝腎機能，尿，血液検査，心電図，胸部X線に 異常を認めなかった． 考 察 大腸菌合成ヒトインスリンはヒトインスリンの A鎖およびB鎖に対応する人工遺伝子を別々の 大腸菌に組みこんで培養し分離精製した後に化

学的にA鎖とB鎖を結合して産生したものであ

り5）6）その概略は図1に示す通りである，現在かか るヒトインスリンはアミノ酸配列はもとより結晶 構造5）6），物理化学的性状‘），インスリンレセプター との結合7），生物活性等は天然ヒトインスリンと 全く同一であり，作用の面でも本成績でもみる点 を這いで殆ど同一である8）． 正常者にHI（γDNA）（レギュラー）と純化ブ タインスリン（レギュラー）を各0．1U／kg静注し た成績では血糖低下作用は全く同一であり9）10）， Thorsteinssonら11）も正常者とType 1糖尿病患 老にヒトとブタインスリンをdouble−blind cross overにて静注し，またeuglycemic glucose clamp

にてsteady stateの血漿free insulinのplasma

disappearanceを調べたがdearanceやparame− terに差を認めることができなかった．一方イン スリンを皮下注した時は吸収速度の異なることが 多く報告されている12）噌14）． Pickupら15）はHI（γDNA）とブタインスリン を6名の非糖尿病者に皮下注して比較した所，4．8 Uでは1血中インスリン濃度で両群に差を認めな かったが，9．6Uでは50分と90分にてヒトインス リンの方が血中濃度が高値であったと報告し， Ebiharaら9）も正常者にHI（γDNA）とノボ社ア クトラピッドインスリンを各皮下注し採点統計的 には有意差はないが，0．05U／kg量の時には0∼ 6時間の血漿insulin areaがブタよりもヒトで大 であり，低血糖効果も大であった．しかし0．1U／kg 量では差がなく，結論的には皮下注時では僅かに ヒトインスリンの方が早く吸収され血糖降下作用 も少し大であったと述べている．いずれもCPR 反応に差はなかった．同様の報告は他にも多くみ られ15∼18）Gulanら19）は同じくHI（γDNA）のfree insulinの初期30分のより高値な点を利用すると Type I糖尿病における食後高血糖がよりょくコ ントロールできるのではないかといっている．よ り吸収が早い結果作用時聞は若干短かくなること が考えられ，Pickupら15）およびSkyler20）はヒト NPHインスリンではウシ，ブタに比し，作用面面 が短いことを指摘している．本研究の成績におい ても図2，3にみるようにブタよりヒトインスリ

ンに変更すると，始めの6ヵ月間はややFSGは

高値となりHbAIにもやや高値を呈している．か かる高血糖を是正するためにインスリン投与量の 増加が必要となる（図4）．同様の成績は小坂ら21） の報告でもみられる． ヒトインスリンの吸収が早い理由としてはヒト

インスリンのBi鎖28∼30がhydrophilic

structure22）であることが指摘されており，またブ タB鎖末のアラニンがヒトではスレオニンであ り，このため溶解性の大なることがあげられてい る23）24）． 他にヒトインスリンとブタインスリンの差とし て報告されていることは，低血糖時のcounter− regulatory hormoneの分泌の差である．SchlUter ら25）は正常者に低血糖を発症させた時ブタインス

リンの方がエピネフリン，growth hormone

（GH）， cortisolの反応が強く（0．075および0．1U／ kg静注）内因性インスリン分泌の抑制も強かった と報告し，Petersenら1D）は同じくインスリン静注 による低血糖効果は同一でもヒトインスリンでは 低K血やエピネフリン反応が著明でないと述べ ている．またグルカゴン反応の遷延も指摘されて いる26）．これらの反応の差のためかヒトインスリ ン低血糖では低血糖に気付かないことが多いとい う27）．しかしこれらの反応の差，気付かなさ等は最 近否定されている8）． インスリン抗体の変化はわれわれの成績ではヒ トインスリン変更後面ブタ，抗ウシ，抗ヒトいず れも低下傾向を示しless antigenicであったが， 小坂ら21）の報告ではブタ，ヒト間で差を認めてい ない．Sonnenbergら17｝は始めの6ヵ月に差はな いが，12ヵ月後にはヒトでは抗原性の少ないこと を報告し，Finebergら28）も結合インスリン陽性率 の低値をのべている．半合成ヒトインスリンでも ブタよりも抗原性の少ないことが報告されてい

る33）．未治療II型糖尿病にヒトとブタultralente を使用した成績29）では各12人，6ヵ月聞使用でヒ トの1人を除きインスリン抗体産生はなく抗原性 に差がなかった．このようにみると，ブタとの比 較では，抗原性は殆んど同一か，僅かヒトの方が 弱いという所であろう．したがって糖尿病妊婦の ようにしぼしぼ妊娠中のみインスリン注射を行っ たり，インスリン抗体が胎盤を通して胎児に移行 することの影響が危倶される時にはヒトインスリ ンの使用がすすめられる． われわれの症例ではヒトインスリンに対しイン スリンアレルギーが見られたが，多くの場合は既 に以前動物インスリンを注射されて抗体が形成さ れている．Gralnmerら30）の報告でもHI（γDNA） に対する皮膚アレルギー2例はいずれもブタイン スリンに対しsystemic allergyの反応の歴史が ある．ヒトインスリンはインスリンにsystemic allergyのある全例に有効であるわけではなく，ま

たヒトインスリンでも皮下に抗体が産生され

る31＞．しかし多くの場合に動物インスリンの皮膚 アレルギー，リポアトロフィーにヒトインスリン 変更の有効性は多く報告されている，ヒトインス リン注射のみによるインスリンアレルギーに，動 物インスリンを注射した効果と比較すべきだが， ヒトインスリン単独によるインスリンアレルギー は極めて稀有である32）． プロインスリン法によるヒトインスリンは，そ の製法においてより短時日でインスリンが産生さ れる利点があり，今後のヒトインスリンはこの HI−pro（γDNA）となる予定である． HI・pro （γDNA）とHI（γDNA）間にはその作用の面で 全く差がみられず，種々のin vitroの実験成績で も差が認められていない． 結 論 1．大腸菌合成ヒトインスリンHI（γDNA）と 純化ブタインスリンの二重盲検比較試験を糖尿病 患者に行った．空腹時血糖値はHI（γDNA）群に おいて前期にやや上昇が認められ，HbAIにおい てもかかる傾向が認められた．インスリン使用量 は増加の傾向がみられた．しかし両群で有意の差 は認められなかった． 2．抗ヒトインスリン抗体結合率の推移はHI （γDNA）使用群で若干低下傾向が認められた． PI 使用群ではウシインスリン抗体結合率の若干の増 加が認められた． 3．大腸菌ポリペプチド抗体結合率には両群と も変化がなかった．

4．HI（γDNA）とHI−pro（γDNA）間では

HbAlc値，インスリン使用量に差が認められた． 5．ウシ，ブタインスリンアレルギー，リポアト ロフィーではヒトインスリン使用により改善例が 多く報告されている．

6．副作用はHI（γDNA）ならびにHI−pro

（γDNA）共にみられなかった． 以上ヒトインスリンは従来の純化ブタインスリ ンと同様に有用なインスリンではあるが特殊の場 合を除き，ヒトインスリンへの変更の必要性は特 別には存在しないと考えられる． 本研究に御協力していただいた第3内科小田桐講 師に厚く御礼申しあげます． 文 献

1）Goeddel DV， Kleid DG， Bolivar F et a1： Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin． Proc Natl

Acad Sci USA 76：106−110，1979

2）Podolsky S， Bradley RF：Treatment of diabetes with insulin． Zη Clinical Diabetes Mellitus（Podolsky S ed）pp9｝130， Apbleton− Century−Crofts， New York（1980）

3）Tbim L， Hansen MT， Norris K et al：Secre− tion and processing of insulin precursors in yeast． Proc Natl Acad Sci USA 83：6766−6770，

1986

4）Markussen J， Damgaard U， Diers I et a1＝

Biosynthesis of human insulin in yeast via

single chain precursors， Diabetologia 29：568

A，1986

5）Chance RE， Kroe仔EP， Ho鉦mann JA et a1： Chemical， physical， and biologic properties of bjosynthetic human insulin， Diabetes Care 4： 147−154， 1981

6）Johnson IS： Authenticity and purity of human insulin（recQmbinant DNA）， Diabetes

Care 5（Suppl 2）：4−12， 1982

7） Olefsky JM： Insulin binding， biologic activ．

ity， and metabolism of biosynthetic human

8) Berger M : Human insulin : Much ado about hypoglycaemia (un) awareness. Diabetologia 30:829-833, 1987

9) Ebibara A, Kendo K, Ohashi K et al: cal pharmacology of human insulin of

binant DNA origin in healthy volunteers.

Diabetes Care 5(Suppl 2):35-38, 1982

10) Petersen K-G, Schltiter KJ, Kerp L: Less pronounced changes in serum potassium and epinephrine during hypoglycemia induced by human insulin <recombinant DNA). Diabetes

Care 5(Suppl 2) 190-92, 1982

11) Thorsteinsson B, Fugleberg S, Binder C;

Kinetics of human and porcine insulins in mal and Type 1 diabetic subjects. Eur J CIin

Pharmacol 33:173-178, 1987

12) Bottermann P, Gyaram H, Wahe K et al:

Pharmacokinetics of biosynthetic human lin and characteristics of its effect. Diabetes

Care 4I168-169, 1981

13) Federlin K, Laube H, Velcovsky HG: logic and immunologic in vivo and in vitro studies with biosynthetic human insulin. Diabetes Care 4:170-174, 1981

14) Kemmer FW, Sonneberg G, Clippers HJ et al :

Absorption kinetics of semisynthetic human insulin and biosynthetic (recombinant DNA) human insulin. Diabetes Care 5(Suppl 2) I 23-28, 1982

15) Pickup JC, Bilous RW, Viberti GC, et al:

Plasma insulin and C-peptide after ous and intravenous administration of human insulin (recombinant DNA) and purifed porcine insulin in healthy men. Diabetes Care 5(Suppl 2) I 29-34, 1982

16) Bottermanm P, Gyaram H, Wahe K et al:

Insulin concentration time action profiles of different intermediate acting insulin tions in non-diabetic volunteers under glucose controlled glucose infusion technique. Diabetes Care 5(Suppl 2) I43-52, 1982

17) Sonnenberg GE, Berger M : Human insulin :

Much ado about one amino acid ? Diabetologia

25I457-459, 1983

18) Pickup J: Human insulin, Br Med J 292i 157-159, 1986

19) Gulan M, Gottesman IS, Zinman B:

Biosynthetic human insulin improves dial glucose excursions in Type 1 diabetes. Ann Intern Med 107 : 506-509, 1987

20) Skyler JS: Human insulin of recornbinant

DNA origin : clinical potential. Diabetes Care (Suppl 2) I 181-186, 1982

21) ,INtygtee : Human insulin (recombinant DNA) oktu scnN v= X 6 -gEit bt ec at wt. ve ff fi 27(Suppl 2) : 159m178, 1984

22) Chavvdhury SA, Dodson EJ, Dodson GG et al : The cryptal structures of three non-pancreatic human insulins. Diabetologia 25 I 460-464, 1983

23) Markussen J, Damgaard U, Pingel M et al :

Human insulin (Novo) : Chemistry and teristics. Diabetes Care 6(Suppl) : 4-8, 1983

24) Jeryell J : Role of human insulin in the ment of diabetes mellitus, Acta Endocrinol

110(Suppl 272) 1 61-64, 1985

25) Schlifter KJ, Petersen K-G, Sontheimer J et al: Different counterregulatory responses to human insulin (recombinant DNA) and purified pork insulin. Diabetes Care 5(Suppl 2) : 78-81,

1982

26) Raptis S, Hadjidakis D, Enzmann F et al:

Inhibition of pancreatic glucagon responses to

arginine by human insulin (recombinant DNA) and purified porcine insulin in normal and

diabetic subjects. Diabetes Care 5(Suppl 2) I

93-101, 1982

27) Teuscher A, Berger WG: Hypoglycemic

awareness in diabetics transferred from beef/ porcine insulin to human insulin. Lancet 2:

382-385, 1987

28) Fineberg SE, Galloway JA, Fineberg NS et

al: Immunogenicity of recombinant DNA human insulin. Diabetologia 25 : 465-469, 1983

29) Saner B, Frankhauser S : Ultratard HM, ein neues Human Insulin. Vorteile gegenUber den bisherigen Prtiparatem, Schweiz Med

schr 116l 116-119, 1986

30) Grammer LC, Metzer BE, Patterson R:

Cutaneous allergy to human (Recombinant

DNA) insulin. JAMA 251 i 1459-1460, 1984 31) Etzwiler DD: International symposium on human insulin: A summary . Diabetes Care 6(Suppl 1)I66-68, 1983

32) N*Ei'ee*p3-, ,jN#ag-RB, d21!n#-t:hs : 2op7it -r ;i- V i/7v7v F-igZ< LLk1 ffU. ij25NHJztsi

ssitfie#ktwMgeEptHig"ftftX, 1988

33) Le Floch JP, Attali JR, Cathelineau G et al : Variations du tanx des anticorps anti-insuline et des immunes complexes circulants chez des

diabetiques traifes par insu]ine humane ou

porcine monocomposee un an pendant, La