Title
Characterization of the nuclear localization signal in the DNA
helicase responsible for Bloom syndrome( 内容の要旨
(Summary) )
Author(s)
早川, 星朗
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第434号
Issue Date
2000-03-24
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14689
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏 名(本籍) 学位の種頬 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 早Jtt 星 朗(愛知県) 博 士(医学) 甲第 434 号 平成12 年 3 月 24 日 学位規則第4条第1項該当
Characterization of the nuclearIocalization signa=n the DNA
helicase responsible for Bloom syndrome
(主査)教授 近 藤 直 実 (副査)教授 中 島 茂 教授 高 見 剛 論 文 内 容 の 要 旨 Bl｡｡m症候群(BS)は生下時よりみられる小柄な体型,日光過敏性紅斑,免疫不全,高率な癌腫の合併を伴う常 染色休劣性の遺伝性疾患である.BSの病因遺伝子産物BLMはWerner症候群の病因遺伝子産物WRN,酵母Sgsl などと共にDNAヘリカーゼと相同性を有しており細胞の再生に必要と考えられるが,その機能については不明 な点が少なくない.BLMタンパクの機能ドメインを明かにすることは,患者変異と表現型の相関や,将来的な遺 伝子治療への基礎的研究として重要である.ヘリカーゼは核で機能すると考えられるが,細胞質で合成されたタ ンパクが核膜を通過して核に入るには核移行シグナル(NLS)とよばれる塩基性のアミノ酸配列が必要である･今 回申請者はBLMタンパクのC末端側の1334-1349番目にArg-Lys-Arg-Lys-LysとArg-SeトLys-Arg-Arg-Lysという 近位と遠位二つの塩基性アミノ酸クラスターを見い出した.このアミノ酸配列が核移行シグナルとして機能する か否かを解析するためEnhancedGreenFluorescentProtein(EGFP)のC末端側にさまざまな長さまたは変異 を導入したBLM遺伝子断片を組み込み,HeLa細胞にトランスフェクションし,24時間後に蛍光顕微鏡で細胞内 局在を検討した.二つの塩基性アミノ酸クラスターをEGFPにつなぐとEGFPは核に局在した･さらに,遠位の 塩基性アミノ酸クラスターのみでも核への局在を示した.N末端側およびC末端側からArg-Ser-Lys-Argをけずっ たBLM遺伝子断片では核のみの局在が認められなくなった.更に,Arg-Ser-Lys-Argの一部を非塩基性のアミノ 酸におきかえた断片では核のみの局在が認められなくなった.マウスBLMタンパクもC末端側に塩基性アミノ酸 クラスターは保存されており2つの塩基性アミノ酸クラスター,Arg-Lys-Arg-Lys-LysとLys-Pro-Lys-Arg-Arg-Argが存在し,遠位の塩基性アミノ酸クラスターLys-Pro-Lys-Arg-Arg-ArgのみでEGFPの核への局在が認めら れた.以上よりヒトBLMではArg13d-Ser136-Lys1346-Arg13qの配列が核移行に必要不可欠であることを明かにした･ [方法] (1)EGFP発現ベクターの作製:ヒトBLMcDNAはRT-PCR法にてfIeLa細胞よりクローニングした･マウ スBLM cDNAは東北大学の榎本武美教授より供与された.BIJMの各断片はcDNA全長を鋳型としてpfu DNA polymeraseを用いて10cycleのPCRで作製した･増幅したDNA断片はⅩhoI,PstIで処理した後,PEGFPベクター C末端側のⅩhoI,PstIサイトにフレームをあわせて挿入した.トランスフェクション用のDNAはCsClを用いた 超遠心法またはQiagenkit(Qiagen,Germany)を用いて調製した. (2)トランズフェクション:5Ⅹ106個のHeLa細胞に10FLgのDNAをelectroporation法(Bio-Rad,CA)でトラ ンスフェクションし,カバーグラスの上にまいた.12時間後に一度洗い,24時間後に4%paraformaldehydeで1 時間固定後,カバーグラスを4,,6-diaminidino-2-Phenylindole(Sigma,MO)とともにスライドグラスのうえに マウントし,蛍光顕微鏡で鏡検した.変異の導入はQuickChangeSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene, CA)のプロトコールに従い行った.変異の導入はBLMおよびEGFP特異的なプライマーを用いてDyeDeoxy TerminatorCycleSequencingkit(AppliedBiosystems,CA)で確認した･ [結果] (1)BLMのC一末に存在する二つの塩基性のアミノ酸クラスターをEGFPのC一末につないだベクターをHeLa細
ー31- 胞にトランスフェクションしたところEGFPは核内に局在した･さらに,遠位のアミノ酸クラスタ,Argl鋤-Serl細-Lys1346-Argl鋸7-Arg13亜-Lys13Wを含む断片のみでも核に局在した･ (2)更にこのなかで重要なアミノ酸配列を同定するためこのアミノ酸を削った断片や塩基性アミノ酸に変異を 導入したコンストラクトを作製した.Arg-Ser-Lys-Argの-一部を削ると核のみの局在がみられなくなり更にArg またはLysを非塩基性のアミノ酸に置換すると核のみの局在がみられなくなった･このことは塩基性のアミノ酸 のうちArg13"-Ser136-Lys13亜-Argl封7が特に核移行シグナルとして重要であることを示している･ (3)マウスBLMはヒトBLMと高い相同性を有する.アミノ酸では75%の相同性を示す･マウスBLMタンパク もそのC末端側に二つの塩基性のアミノ酸クラスターが存在する.マウスBLM全長をEGFPにつないだベクター は核に局在した.また,遠位の塩基性アミノ酸クラスターのみでも核に局在し,遠位の塩基性アミノ酸クラスター がマウスBLMの核移行シグナルとして重要なことが明かになった.この,遠位のアミノ酸クラスターはヒトの Arg-Ser-Lys-Argに相当するLys13W-Prolu7-Lys13亜-Argl別9という配列を有していた■ [考察] 申請者らはBLMのC末端側にある1334-1349のアミノ酸に核移行シグナルが存在しそのうちArg13"-Ser136-Lys一別6-Argl抑が重要であることを明らかにした･核移行シグナルは約10アミノ酸のスペーサーを介して二つの塩基性ア ミノ酸クラスタpが存在しいわゆるBipartitetypeの核移行シグナルとよばれる構造をとっている場合とSV40 のT抗原のように数個のアミノ酸配列からなるSimpletypeの核移行シグナルの場合がある･今回の結果よりヒ トBLMは二つの塩基性アミノ酸クラスターを有するがそのうち遠位の塩基性アミノ酸クラスターがSimple type の核移行シグナルとして機能する可能性が示唆された.マウスBLMタンパクのC末端側もと卜BLMタンパクと 同様に二つの塩基性アミノ酸クラスターを有するが遠位の塩基性アミノ酸配列のみでも核に局在した･このうち ヒトBLMの核移行に重要なArg-Ser-Lys-Argの配列に相当するLys13d-Prol封7-Lys13亜-Arg13Wという配列をマウス BLMは有していた. 興味深いことに,最近,同じRecQヘリカーゼファミリーに属するWRNタンパクが核へ移行しC末端側に核移 行シグナルを有することが明かにされた.WRNタンパクの核移行シグナルとして重要な配列はAsp-Lys-Arg-Arg-Cys-Pheであった･Werner症候群にみられるWRNの変異はその変異部位に関わらず表現型は一定である0 これは,フレームシフトをきたすような変異により変異部位に関わらずC末端側の核移行シグナルがよまれない ため核への移行が阻害されることによるためであると報告されている･今までに報告されているBLMの変異は ヘリカーゼ活性そのものに影響をおよぼすと考えられる変異が多いが,症例の中にはNLSの機能の障害により BSを発症する場合も存在すると考えられる.他のRecQヘリカpゼファミリーに属するタンパクもC末端側に塩 基性アミノ酸クラスターを有しており,これらは核移行シグナルとして機能すると想定される･BLMの機能ド メインを明らかにすることは病態の理解や新たな治療法の開発につながると考えられる. 論文書査の結果の要旨 申請者 早川星朗はBloom症候群の病因と病態を解明する目的で,ヒトおよびマウスでBLMタンパクが核内 で機能することを明らかにし,核移行に重要な核移行シグナルを同定した･また,ヒトBLMタンパクについては, Argl鋤-Serl減-Lys1346-Argl封7が核移行に必要であることを解明した･この成果は小児科学ならびに人類遺伝学の研 究の進歩,発展に少なからず寄与するものと認める. [主要論文公表誌]
Characterization of thenuclearlocalization signalin the DNA helicase responsible for Bloom Syndrome.
InternationalJournalof Molecular Medicine(印刷中)
